אנו מודים חברי המעבדה Ninov להערות על כתב היד, חברי מרכז למתקן דגים, מיקרוסקופיה דרזדן טיפולים משובי (CRTD) לקבלת סיוע טכני. N.N. נתמך על ידי מימון DFG-CRTD, אשכול התמחות TU-דרזדן, קרן מחקר גרמני (DFG) ואל מרכז גרמנית עבור סוכרת מחקר (DZD).

כל ההליכים לרבות נושאים בעלי חיים אושרו על ידי חוק רווחת בעלי חיים, עם אישור של Sachsen Landesdirektion, גרמניה (AZ 24 – 9168.11-1/2013-14, טי12/2016).
1. הכנה
הערה: פרוטוקול זה הוא עבור ex-vivo הדמיה של דג זברה איון העיקרי של Tg הטרנסגניים כפול (ins:nls-Renilla-mKO2; cryaa:CFP); Tg (ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry) 19 דג זברה. בשורה זו מהונדס, האמרגן אינסולין (ins) כוננים תאי בטא ביטוי ספציפי של שני transgenes: nls-Renilla-mKO2, אשר מסמנת את הגרעין של תאי הבטא עם Kusabira monomeric כתום 2 (mKO2) זריחה; GCaMP6s15, אשר פולט קרינה פלואורסצנטית ירוק בתגובה: גידול רמות הסידן תאיים. הביטוי בטא-תא-ספציפי של GCaMP6s מאפשר ללמוד הגלוקוז-התגובה של תאי הבטא ללא הפרעה משינויי סידן המקיף סוגי תאים.
<ol><li>להכין מלאי פיברינוגן טריים (10 mg/mL) על ידי המסת 10 מ ג של פיברינוגן שור תוך 1 מ"ל של Ca2 +/Mg2 +-המכיל תמיסת מאוזנת מלח הנקס (HBSS) בשפופרת צנטרפוגה 1.5 mL. מערבולת נמרצות עד האבקה פיברינוגן מתמוסס לחלוטין. שמור את הפתרון בטמפרטורת החדר למשך לפחות עוד 15 דקות. הערה: המניה יכול להישמר בטמפרטורת החדר במשך 2-3 ח' להשליך המניה אם הפתרון מתחיל פולימריזציה, הופך צמיגה.</li>
	<li>הכן הפתרון עובד פיברינוגן (3.3 mg/mL) על ידי דילול המניה פיברינוגן HBSS בתוך החולוני. לדוגמה, מערבבים 300 µL של פיברינוגן מניות של 600 µL של HBSS להכין µL 900 של הפתרון עובד פיברינוגן.</li>
	<li>להכין תרומבין פתרון (10 U/mL) על ידי המסת 10 יחידות של תרומבין ב 1 מ"ל של HBSS או פוספט buffered תמיסת מלח (PBS). הערה: פתרון זה יכול להיות מוכן מראש, aliquoted 50 חלקים µL, קפוא ב-20 ° C.</li>
	<li>להכין 200 מ"מ תמיסת גלוקוז D על ידי המסת 1.8 g של D-גלוקוז ב- 50 מ ל מים. שמור 4 ° C לאחסון לטווח ארוך.</li>
	<li>להכין 300 מ"מ אשלגן כלורי פתרון על ידי המסת g 1.1 של אשלגן כלורי ב- 50 מ ל מים. שמור 4 ° C לאחסון לטווח ארוך.</li>
	<li>להשיג 35 מ מ קוטר זכוכית-התחתון מנות להרכבה על איים קטנים.</li>
	<li>לנתיחה, הרכבה של איון, להשתמש במיקרוסקופ סטריאו מצויד עם פלורסצנטיות המנורה ואת מסנן אדום קוביה (TRITC: עירור: 532 – 554 ננומטר, פליטה: 570-613 ננומטר; או טקסס-אדום: עירור: 540-580 nm, פליטה: 592 – 667 ננומטר).</li>
	<li>הדמיה זרם סידן בתאי בטא, שימוש מיקרוסקופ קונפוקלי הפוכה (Zeiss LSM 780 או דומה) עם 20 X (0.8 NA) אוויר המטרה ומצוידים בעל לוחית הכלים למטה זכוכית בקוטר 35 מ מ.</li>
	<li>היכונו המתות חסד את דג זברה פתרון 200 מ ג/ליטר של tricaine מתאן סולפונאט (MS222).</li>
	<li>להביא צלחות פטרי 90 מ מ רוברט דג זברה.</li>
</ol>2. דג זברה ראשי איון לנתיחה מכשירי הרכבה
<ol><li>המתת חסד דג באמצעות דגירה ממושך ב- MS222. בשביל זה, להסיר את הדג מן האקווריום באמצעות רשת דיג ובעדינות דגירה אותו בצלוחית המכילה את הפתרון MS222 עד החיה מראה אין תנועה opercular (זימים); בדרך כלל, זה לוקח 5 דק העברת הדג על צלחת פטרי המכילות את הפתרון HBSS עם Ca2 +/Mg2 +.</li>
	<li>
תחת מיקרוסקופ סטריאו מצויידים המנורה פלורסצנטיות, מסנן אדום קוביה, לנתח את העור המכסה את הצד הימני של הבטן של החיה כדי לבודד את הלבלב.
	<ol>
<li>בשביל זה, לחתוך את העור של דג זברה מפי לפין אנאלי באמצעות מלקחיים חדה. לקלף את העור לחתוך כדי לחשוף את הבטן; החיתוך הזה חושף את האיברים הפנימיים. באמצעות פלואורסצנטי אדום את הביטוי mKO2 בתאים-ביתא, לוודא שמיקום איונים בבדיקה חזותית מתחת למיקרוסקופ. במידת הצורך, הסר את אונות הכבד, כפי הם יכולים לכסות את איון, ולכן קשה למצוא. הערה: איון הראשי ממוקם ליד האזור הקדמי של הבטן, בדרך כלל בצד ימין.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לנקות את איון הראשי על-ידי בקפידה הסרת הרקמה הסובבת כגון הכבד, adipocytes. לנקוט אמצעי זהירות לא כדי לפגוע או לתקוע את איון; לאחר ניקוי של הרקמה שמסביב, תאים נפרדים על פני איון להיות ניכרת.</li>
	<li>Pipette טיפה 30 µL HBSS במרכז צלחת זכוכית-התחתון. להעביר את איון גזור הזה טיפה.</li>
	<li>לשטוף היטב את איון פעם אחת עם HBSS ופעם אחת עם 30 µL של הפתרון עובד פיברינוגן (3.3 mg/mL). לוודא למנוע ייבוש של איון במהלך השלבים כביסה בגלל כשל לשם כך התוצאה היא מוות של תאים.</li>
	<li>לאט ובעדינות להוסיף 10 µL של הפתרון תרומבין (10 U/mL). להשאיר את איון ואת המנה לא נגעה במשך 15-20 דקות להתבונן כי הירידה פיברינוגן-תרומבין יהפכו צמיגה כמעצמה בשלב זה.</li>
</ol>3. לשעבר Vivo לחיות-הדמיה של GCaMP עוצמת קרינה פלואורסצנטית ב איונים ראשי דג זברה
<ol><li>להוסיף 200 µL של HBSS על העובש ולמקם את המנה בקפידה את המחזיק לוחית מיקרוסקופ קונפוקלי. השתמש מטרה אוויר 20 X, 0.8 NA, עבור הדמיה קונפוקלי. אתר את איון באמצעות האפשרות brightfield.</li>
	<li>באמצעות המסנן עבור פלואורסצנטי אדום כדי להציג את זריחה mKO2 הגרעין בתאים-בטא, להתמקד איון. גרעינים בודדים צריך להיות ברור לעין.</li>
	<li>אתר מטוס הדמיה ברורה על-ידי שינוי ידני של מטוס מוקד של מיקרוסקופ קונפוקלי כדי לעבור בין עובי איון לאורך ציר z. ודא כי המטוס הדמיה מכיל מספר מספיק (50-100) של תאי הבטא עבור הדמיה, בהירות זריחה mKO2 גרעיני הוא אחיד, במיוחד במרכז של איון.</li>
	<li>להגדיר על רכישת רציפים עבור זריחה GCaMP6s ו- mKO2 באמצעות ההגדרות הבאות ב "בתפריט הגדרה חכם": GCaMP6s, עירור: 488 ננומטר, פליטה: 500-555 ננומטר, שווא-צבע: ירוק (בחר "GFP"); mKO2, עירור: 561 nm (mCherry), פליטה: 570 – 630 ננומטר, שווא-צבע: אדום (בחר "mCherry"). הערה: עם הגדרה זו, הערוץ האדום יתעד את המיקום של גרעיני תאי בטא, בעוד לערוץ הצבע הירוק יהיה שיא עוצמת קרינה פלואורסצנטית GCaMP.</li>
	<li>במצב של"רכישת" הגדר את רזולוציית התמונה 1,024 x 1,024 פיקסלים, מהירות ב-10 ו בממוצע ב- 1. החניך רציפה מקליט על-ידי בחירה באפשרות של "זמן-סדרה", והגדרת "משך" 500 מחזורי, עם-2 s רכישת זמן לכל מסגרת. הערה: מסגרות 50 הראשונים של סדרת הזמן תואמות הפעילות של תאי הביתא-ריכוז גלוקוז 5 מ מ. זוהי התגובה הבסיסית. בטא-תא מגיבה יראה מתמלא, מתמעט בעוצמת פלורסצנטיות ירוק עם הזמן. הבחנו כי כמה (1 – 5%) של תאי הביתא נעים-גלוקוז 5 מ מ.</li>
	<li>
לפקוח עין על מחזור הדמיה. לאחר הראשונה 50 מסגרות, להגדיל את ריכוז הגלוקוז הפתרון המקיף 10 מ מ בלי לעצור את ההקלטה.
	<ol>
<li>ללא perturbing רכישת התמונה, בעדינות פיפטה 5 µL של 200 מ מ D-גלוקוז פתרון על גבי הג'ל מחזיק את איון. לרכוש מסגרות 150-גלוקוז 10 מ מ. הערה: העלייה בריכוז הגלוקוז יגדיל את מספר תאי בטא-עוברת תנודות פלורסנט GCaMP בערוץ ירוק.</li>
		<li>להבטיח הגרעינים של התאים יישארו יציבים במהלך התהליך. אם איון היא רועדת בהרחבה במהלך רכישת ופועלים הגרעינים מהמטוס מוקד, למחוק את הדגימה (במידת הצורך).</li>
		<li>לחכות תקופה מספקת כדי לאפשר פלמור של העובש פיברינוגן-תרומבין על מנת להבטיח את היציבות של דגימות עוקבות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ב 200 מסגרות, להגביר עוד יותר את הריכוז של הפתרון 20 מ מ על ידי בעדינות pipetting µL 10 מ מ 200 תמיסת גלוקוז-D. לרכוש מסגרות 150 עבור ריכוז 20 מ מ.</li>
	<li>אחרי 350 מסגרות, depolarize את איון באמצעות 30 מ מ של אשלגן כלורי. בשביל זה, להוסיף 20 µL של 300 מ מ פתרון מניות אשלגן כלורי. בשלב זה, להתבונן תנודות זריחה GCaMP6s להפסיק ולתקן בעוצמה גבוהה; תאי הבטא שלא הגיבו לגלוקוזה יכול גם להציג עלייה בעוצמת ירוק-זריחה על תוספת אשלגן כלורי.</li>
</ol>4. כימות של GCaMP עקבות קרינה פלואורסצנטית בטא-לתאים בודדים
הערה: כדי לאתר ולכמת את התגובות של בטא-תאים בודדים רמות משתנות של גלוקוז, לכמת את עוצמת קרינה פלואורסצנטית GCaMP עבור כל התקופה הדמיה. כימות מתבצע ברזולוציה הסלולר. לשם כך, השתמש פיג'י20 כדי לחלץ את ערכי העוצמה של זריחה GCaMP תמונות (צעדים 4.1 – 4.6), ואת תוכנת הגיליון האלקטרוני או R21 לבצע ניתוח (שלבים 4.8-4.9).
<ol><li>פתח את קובץ התמונה בפיג'י באמצעות "ארגז הכלים LSM". לשם כך, בחר "תוסף | ארגז הכלים LSM | הצג את ארגז הכלים LSM". בארגז הכלים"LSM", לחץ על "פתח LSM" ובחר את קובץ התמונה. הערה: עבור תבניות אינה נתמכת על ידי "ארגז הכלים LSM", להמיר אותם תחילה על tiff לניתוח.</li>
	<li>לחלץ את התגובות של תאים באמצעות הכלי (ROI) אזור-של-עניין בפיג'י. פתח את 'מנהל רועי"בתפריט ' 'נתח' ' תחת"כלים". צייר באופן ידני את רועי באמצעות "הבחירה בכלי מצולע" הממוקם בסרגל הכלים.</li>
	<li>ציירו רועי בערוץ האדום שבו האטומים תאי בטא גלויים. בחר את רועי כזה כי זה מכסה שטח גדול יותר גרעין של התא כדי לכלול חלק הציטופלסמה של התא. ודא כי המיקום רועי עקבית בין מסגרות ולהתאים את המיקום במידת הצורך.</li>
	<li>להוסיף את ROIs שנבחר למנהל"רועי" על ידי לחיצה על לחצן "הוסף [t]". בחר ולהוסיף ROIs מרובים רועי להשגת נתונים על תאים מרובים.</li>
	<li>לאחר מכן, בתפריט ' 'נתח' ', בחר "קביעת המידות". בחר "צפיפות משולב" לציון החילוץ של עוצמת קרינה פלואורסצנטית הכולל בתוך האזור.</li>
	<li>להעביר לערוץ הצבע הירוק המכיל את זריחה GCaMP ובחר "ריבוי אמצעי" במנהל"רועי". הערה: פעולה זו תספק את המידות העוצמה עבור התאים לאורך כל סדרת הזמן.</li>
	<li>במקרה לתנוחה רועי צריכה תיקון עקב תנועת איון, באופן ידני לקמפל את המידות בעוצמה במסגרות שונות. העתק והדבק את הערכים לגיליון אלקטרוני נפרדים.</li>
	<li>להשיג חותמות הזמן של מסגרות תמונה של "ארגז הכלים LSM". שימוש "להחיל בולים | החלת טי בולים | שם קובץ | לטיפוסים textfile"כדי להשיג את חותמות זמן. שמור חותמות זמן שימוש באפשרות "שמור בשם", או להעתיק אותם לתוך הגיליון האלקטרוני.</li>
	<li>בעת קימפול את ערכי העוצמה של כל התאים, לבצע את ניתוח תא אחד בכל פעם או באופן אוטומטי (לדוגמה, שימוש בנוסחאות Excel או R).</li>
	<li>
לנתח תאים בודדים בשני שלבים.
	<ol>
<li>בשלב הראשון, לחשב את עוצמת קרינה פלואורסצנטית מעל לקו הבסיס. לשם כך, לחשב את עוצמת ניאון בסיסית (F0) כממוצע של עוצמות קרינה פלואורסצנטית עבור מסגרות קודם 50 (גלוקוז 5 מ מ). ואז מהמסיכה הבסיס (F0) בזמן-הסדרה כולה (F-F0). הערה: כמה תאים באפשרותך להציג ברור תנודות GCaMP תחת הבסיס גלוקוז, אשר בדרך כלל ממשיכים בעקבות גירוי עם ריכוזים גבוהים יותר. עבור תאים כאלה, זה רק ניתן לאמוד F0 על ידי לקיחת עוצמת אכזרי של המסגרות הראשוני שבו התאים הראו ירידה זריחה.</li>
		<li>בשלב השני של הניתוח, לקבל את עוצמת קרינה פלואורסצנטית GCaMP סופית על-ידי נרמול עוצמת קרינה פלואורסצנטית. הערה: זה מבוצע כדי להסיר את ההבדלים בין איים קטנים של בעלי חיים שונים. איים בודדים להציג רמות משתנות של פליטת קרינה פלואורסצנטית על גירוי גלוקוז.</li>
		<li>לנרמל את עוצמת קרינה פלואורסצנטית חילוק זה עם הערך הגבוה ביותר בעוצמה. בשביל זה, לחשב את עוצמת שיא (Fמקסימום – F0) או חילוק הערכים הבסיסיים המופחת באינטנסיביות שיא להניב את עוצמת קרינה פלואורסצנטית GCaMP הסופי (F-F0) / (Fמקסימום – F0).</li>
	</ol>
</li>
	<li>למחוק את התאים לא מוצג שינוי בעוצמת בעקבות גירוי אשלגן כלורי, כפי שהם עשויים להיות לא בריא או פגום.</li>
	<li>לביצוע הניתוח (שלבים 4.9-4.10) ב- R, להשתמש בסקריפט R (plotcelltrace. R) מסופק עם כתב היד הזה.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Kahn, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relative+contributions+of+insulin+resistance+and+beta-cell+dysfunction+to+the+pathophysiology+of+Type+2+diabetes.">The relative contributions of insulin resistance and beta-cell dysfunction to the pathophysiology of Type 2 diabetes.</a> Diabetologia. 46 (1), 3-19 (2003).</li><li>Ogurtsova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IDF+Diabetes+Atlas:+Global+estimates+for+the+prevalence+of+diabetes+for+2015+and+2040.">IDF Diabetes Atlas: Global estimates for the prevalence of diabetes for 2015 and 2040.</a> Diabetes Res Clin Pract. 128, 40-50 (2017).</li><li>Pipeleers, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+pancreatic+beta-cell+population.">Heterogeneity in pancreatic beta-cell population.</a> Diabetes. 41 (7), 777-781 (1992).</li><li>MacDonald, P. E., Joseph, J. W., Rorsman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose-sensing+mechanisms+in+pancreatic+beta-cells.">Glucose-sensing mechanisms in pancreatic beta-cells.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 360 (1464), 2211-2225 (2005).</li><li>Hellman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+induces+oscillatory+Ca2++signalling+and+insulin+release+in+human+pancreatic+beta+cells.">Glucose induces oscillatory Ca2+ signalling and insulin release in human pancreatic beta cells.</a> Diabetologia. 37, S11-S20 (1994).</li><li>Bergsten, P., Grapengiesser, E., Gylfe, E., Tengholm, A., Hellman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronous+oscillations+of+cytoplasmic+Ca2++and+insulin+release+in+glucose-stimulated+pancreatic+islets.">Synchronous oscillations of cytoplasmic Ca2+ and insulin release in glucose-stimulated pancreatic islets.</a> J Biol Chem. 269 (12), 8749-8753 (1994).</li><li>Wollheim, C. B., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+cytosolic+free+Ca2++and+insulin+release+in+an+insulin-secreting+cell+line.">Correlation between cytosolic free Ca2+ and insulin release in an insulin-secreting cell line.</a> J Biol Chem. 259 (4), 2262-2267 (1984).</li><li>Pace, C. S., Price, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+responses+of+pancreatic+islet+cells+to+secretory+stimuli.">Electrical responses of pancreatic islet cells to secretory stimuli.</a> Biochem Biophys Res Commun. 46 (4), 1557-1563 (1972).</li><li>Ohara-Imaizumi, M., Nakamichi, Y., Tanaka, T., Ishida, H., Nagamatsu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+exocytosis+of+single+insulin+secretory+granules+with+evanescent+wave+microscopy:+distinct+behavior+of+granule+motion+in+biphasic+insulin+release.">Imaging exocytosis of single insulin secretory granules with evanescent wave microscopy: distinct behavior of granule motion in biphasic insulin release.</a> J Biol Chem. 277 (6), 3805-3808 (2002).</li><li>Soria, B., Martin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytosolic+calcium+oscillations+and+insulin+release+in+pancreatic+islets+of+Langerhans.">Cytosolic calcium oscillations and insulin release in pancreatic islets of Langerhans.</a> Diabetes Metab. 24 (1), 37-40 (1998).</li><li>Kenty, J. H. R., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testing+pancreatic+islet+function+at+the+single+cell+level+by+calcium+influx+with+associated+marker+expression.">Testing pancreatic islet function at the single cell level by calcium influx with associated marker expression.</a> PLoS One. 10 (4), e0122044 (2015).</li><li>Speier, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+in+vivo+imaging+of+pancreatic+islet+cell+biology.">Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology.</a> Nat Med. 14 (5), 574-578 (2008).</li><li>Bootman, M. D., Rietdorf, K., Collins, T., Walker, S., Sanderson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2+-sensitive+fluorescent+dyes+and+intracellular+Ca2++imaging.">Ca2+-sensitive fluorescent dyes and intracellular Ca2+ imaging.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013 (2), 83-99 (2013).</li><li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+generation+of+Ca2++indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties.">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> J Biol Chem. 260 (6), 3440-3450 (1985).</li><li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Hesselson, D., Anderson, R. M., Beinat, M., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+populations+of+quiescent+and+proliferative+pancreatic+beta-cells+identified+by+HOTcre+mediated+labeling.">Distinct populations of quiescent and proliferative pancreatic beta-cells identified by HOTcre mediated labeling.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (35), 14896-14901 (2009).</li><li>Pisharath, H., Rhee, J. M., Swanson, M. A., Leach, S. D., Parsons, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+ablation+of+beta+cells+in+the+embryonic+zebrafish+pancreas+using+E.+coli+nitroreductase.">Targeted ablation of beta cells in the embryonic zebrafish pancreas using E. coli nitroreductase.</a> Mech Dev. 124 (3), 218-229 (2007).</li><li>Curado, S., Stainier, D. Y. R., Anderson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitroreductase-mediated+cell/tissue+ablation+in+zebrafish:+a+spatially+and+temporally+controlled+ablation+method+with+applications+in+developmental+and+regeneration+studies.">Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies.</a> Nat Protoc. 3 (6), 948-954 (2008).</li><li>Singh, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+developmental+histories+of+beta-cells+generate+functional+and+proliferative+heterogeneity+during+islet+growth.">Different developmental histories of beta-cells generate functional and proliferative heterogeneity during islet growth.</a> Nat Commun. 8 (1), 664 (2017).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676 (2012).</li><li>R Core Team. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> R: A Language and Environment for Statistical Computing. , (2016).</li><li>Friedman, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evolving+autoimmune+microenvironment+regulates+the+quality+of+effector+T+cell+restimulation+and+function.">An evolving autoimmune microenvironment regulates the quality of effector T cell restimulation and function.</a> Proc Natl Acad Sci. 111 (25), 9223-9228 (2014).</li><li>White, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transparent+adult+zebrafish+as+a+tool+for+in+vivo+transplantation+analysis.">Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis.</a> Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).</li><li>Bader, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+proliferative+and+mature+&#946;-cells+in+the+islets+of+Langerhans.">Identification of proliferative and mature &#946;-cells in the islets of Langerhans.</a> Nature. 535 (7612), 430-434 (2016).</li><li>Dorrell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+islets+contain+four+distinct+subtypes+of+&#946;+cells.">Human islets contain four distinct subtypes of &#946; cells.</a> Nat Commun. 7, 11756 (2016).</li><li>Johnston, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta+Cell+Hubs+Dictate+Pancreatic+Islet+Responses+to+Glucose.">Beta Cell Hubs Dictate Pancreatic Islet Responses to Glucose.</a> Cell Metab. 24 (3), 389-401 (2016).</li></ol>

המחברים מצהירים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

כאן אנחנו מדגימים טכניקה עבור כימות של תאי בטא תגובתיות גלוקוז ברזולוציה תא בודד. זה התאפשר על ידי ניטור ריכוז הסידן תאיים באמצעות מחוון בקידוד גנטית סידן, GCaMP6s. פעילות תאי בטא היא הלכוד שמחוץ על ידי הרכבה של איון בתבנית פיברינוגן-תרומבין. שלב קריטי של הפרוטוקול הוא היציבות של העובש. מספיק זמן צריך להינתן עבור פיברינוגן להמיס הפתרון HBSS. בלי זה, כייר לא פולימריזציה מספיק כדי לספק יציבות במהלך הפגישה הדמיה. איון הוטענו פיברינוגן-תרומבין עובש, שקוע בתוך התא תרבות המדיה יכול להישאר בר קיימא לשבוע לפחות (נתונים לא מוצג). חלופות כייר פיברינוגן-תרומבין, כגון agarose נמוך-להמיס, יכול להיות מנוצל כדי לטעון את איון22. פרמטר קריטי נוסף הוא ניתוח איון. במהלך שלב זה, רקמות המקיפים את איון צריך להיות מוסר ללא ופצעו או תוקע איון. . הקרע מיומן מגיע עם תרגול.
מגבלה של פרוטוקול הדמיה הוא צמצום למישור קונאפוקלית אחד של איון. זה נעשה כדי ללכוד את הדינמיקה של סידן זרם בתוך ביתא-תאים בודדים. Z-מחסנית דרך כל עובי איון מוביל נמוך הדמיה מהירויות, לאבדן קשר מתנדנדות תאים בודדים. מגבלה זו יכולים להשתפר תוך שימוש באמצעים מהירים קונאפוקלית-הדמיה כגון מיקרוסקופ ספינינג-דיסק, כדי לאפשר את הדינמיקה סידן בממדים-3. גבול נוסף יהיה ויוו סידן הדמיה12. הטבע שקוף של דג זברה העובר או השימוש של פיגמנט-פחות זנים של דג זברה מבוגרים23 היתה לפתוח את האפשרות ויוו הדמיה בעתיד.
ההדמיה של פעילות תאי בטא ברזולוציה גבוהה יכולות מאפשר לחקור את הטרוגניות פונקציונלי בין ביתא-תאים בודדים. גישה זו יכולה לסייע לשפוך אור על קיומו של תאי בטא תת אוכלוסיות. לאחרונה, מחקרים רבים הראו קיומה של תת אוכלוסיות של תאי הבטא נומינלית הומוגנית24,25,26. Ex-vivo הדמיה ניתן לשלב עם כתבים גנטית כדי לאפיין מתגובה של תת-האוכלוסייה גלוקוז. בנוסף, שילוב של הגדרת הדמיה עם גירוי תרופתי יכול לאפשר להקרנה של תרכובות יכול לשפר את הפונקציונליות של תאי בטא.
לסיכום, הטכניקה המובאת כאן מאפשר כימות והשוואה בין התגובה גלוקוז בטא-לתאים בודדים. הוא מספק חלון ישירה לתוך תאי בטא פונקציונליות, פרמטר חשוב בהתפתחות סוכרת.

הגלוקוז בדם שלנו נשמר בטווח צר, בעיקר בזכות הפונקציה בלבלב האנדוקרינית. תפקיד האנדוקרינית הלבלב מתבצע על ידי איי לנגרהנס, אשר מכילים תאים מפריש הורמון. הורמון האינסולין-תאי הבטא אחראים הפחתת רמות הגלוקוז בדם לאחר ארוחה המכילה פחמימות. הפרשת האינסולין לקוי של תאי בטא יכול לגרום סוכרת1, אשר מאופיין על ידי מתמשכת הגלוקוז בדם גבוהה. סוג 1 וסוכרת מסוג 2, אשר פוגעת כיום יותר מ- 400 מיליון אנשים ברחבי העולם, מוביל התחלואה והתמותה2. על ידי חוקר את הגורמים המולקולריים וסביבתיים שתורמים בתפקוד תאי בטא, אנחנו יבין טוב יותר איך לפתח סוכרת מסוג 2 מתחיל ולא מתקדמת. בנוסף, היכולת להבדיל תאי גזע אנושי לתוך תאי הבטא פונקציונלי במבחנה יכול לספק מקור של בטא-תאים חדשים תא-החלפת טיפולים בסוכרת מסוג 1. לשם כך, חשוב ללמוד ההבשלה מודל גנטי אורגניזמים ותפקוד תאי בטא כדי להשיג את הידע הדרוש לייצור תאי הבטא פונקציונלי בקערה.
תאי בטא פונקציונליות ניתן לנטר באותה רמת שלמה-איון מאת לכימות הסכום הכולל של אינסולין מופרש בתגובה גלוקוז-גירוי. גישה זו מצטברת מחקרים של איון כקבוצה אחת של תאים ללא הבחנה המאפיינים הבודדים של התא. עם זאת, ניתוח הנתונים של גלוקוז תגובות של בטא-תאים בודדים גילה מגוון המאפיינים הפונקציונליים של תאי ביתא-ואת הנוכחות של הטרוגניות3. כדי להעריך את הפונקציה של בטא-תאים בודדים, זה אפשרי לעקוב אחר שינויים תאיים להוביל הפרשת אינסולין4. הפרשת האינסולין קודם כניסה של גלוקוז לתוך תאי הבטא. גלוקוזה זה מזין תאי הבטא עובר מטבוליזם במהירות ל ATP. ריכוז גבוה של ATP תאיים להקטין את ההסתברות פתוח של תעלות יונים של אשלגן תלויית ATP המוביל אל תאי בטא דפולריזציה. דפולריזציה פתיחת תעלות היונים מתח רגיש סידן ומגביר את הסידן תאיים. בתורו, הסידן מפעיל אקסוציטוזה של אינסולין, אשר מופץ במחזור הדם, מוריד את רמות הגלוקוז על ידי קידום גלוקוז-ניצול5,6,7.
מספר אסטרטגיות הוחלו לחקור את תפקוד תאי הבטא, כולל ניטור של פוטנציאל הממברנה8, פריט חזותי ישיר של אינסולין-שלפוחית אקסוציטוזה9, כימות של Ca תאיים2 + זרם כמדד גלוקוז-תגובתיות10. ביניהם, הדמיה של Ca תאיים2 + מספק את היתרון של הניתוח בתאים בודדים מרובים בתוך אותו איון11,12, המאפשר השוואה ישירה של הגלוקוז-התגובה בין למעלה-קנה מידה בטא-תאים בודדים. Ca תאיים2 + ריכוז ניתן לנטר בעזרת צבעי פלורסנט סידן רגיש13 או סידן מקודד גנטית אינדיקטורים (GECIs)14. ואילו סידן-מחוון צבע חוסר סוג התא ירידה לפרטים, GECIs יכול להתבטא סוג תא מסוים על ידי היזמים ספציפיים. בנוסף, הדור החדש של GECIs, כגון GCaMP6, מספק יחס אות לרעש טוב יותר יחד עם מהר טמפורלית dynamics15. כאן נתאר את התועלת של הדור החדש של GECIs, ב GCaMP6s מסוים, כדי להמחיש סידן בתאי בטא ברזולוציה תא בודד. אנו מיישמים שיטה זו כדי איון העיקרי דג זברה כמודל שלנו להתמקד. במהלך התפתחות עובריים, ביתא-תאים איון הראשי מקורן מהראש, הלבלב הגחוני / ניצנים16. איון העיקרי הינו ממוקם במיקום האנטומי סטריאוטיפי בתוך הלבלב דג זברה, המאפשרת בידוד וזיהוי קל שלה. בטא-תאים איון העיקרי נחוצים גלוקוז-תקנה, כפי אבלציה הגנטי שלהם מוביל היפרגליקמיה17,18. יתר על כן, הביתא-תאים אלה הופכים גלוקוז מגיב במהלך התפתחות מוקדמת של דג זברה19. פרוטוקול זה ניתן להחיל גם על הדמיה איונים המשני, המהווים בשלבים עובריים פוסט. הפרוטוקול מאפשר תמונה תאי בטא- ex-vivo, בשלבים מאוחרים יותר של התפתחות ותחת ריכוזי גלוקוז מוגדרים.

<table><tbody><tr><td>Transgenic Zebrafish line: Tg(ins:nls-Renilla-mKO2; cryaa:CFP); Tg(ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry)</td><td></td><td></td><td>By request from authors</td></tr><tr><td>Stereo microscope</td><td>ZEISS</td><td>495015-0001-000</td><td>SteREO Discovery.V8</td></tr><tr><td>Fluorescence lamp</td><td>ZEISS</td><td>423013-9010-000</td><td>Illuminator HXP 120 V</td></tr><tr><td>Red Filter Cube</td><td>ZEISS</td><td>000000-1114-462&amp;nbsp;</td><td>Filter set 45 HQ TexasRed</td></tr><tr><td>Confocal Microscope</td><td>ZEISS</td><td>LSM 780</td><td></td></tr><tr><td>Bovine fibrinogen</td><td>Sigma</td><td>F8630</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (Hanks&#039; Balanced Salt solution)</td><td>ThermoFisher</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>Thrombin</td><td>Sigma</td><td>T4648</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>35 mm diameter glass-bottom dishes</td><td>ThermoFisher</td><td>150680</td><td></td></tr><tr><td>tricaine methane sulfonate</td><td>Sigma</td><td>E10521&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fine Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11445-12</td><td></td></tr><tr><td>FIJI, using ImageJ Version: 2.0.0-rc-43/1.50e</td><td></td><td></td><td>https://fiji.sc/</td></tr><tr><td>R, version 3.2.4</td><td></td><td></td><td>https://www.r-project.org/</td></tr><tr><td>RStudio</td><td></td><td></td><td>https://www.rstudio.com/</td></tr><tr><td>plotcelltrace.R</td><td></td><td></td><td>A custom script provided with the manuscript</td></tr></tbody></table>

analysis of beta-cell function using single-cell resolution calcium imaging in zebrafish islets

בתאי בטא בלבלב להגיב הגדלת ריכוזים של גלוקוז בדם על ידי הפרשת הורמון ה אינסולין. תפקוד תאי בטא-מוביל היפרגליקמיה השלכות חמורות, סכנת חיים. הבנת איך תאי הבטא פועלים בתנאים פיזיולוגיים, איזה גורמים גנטיים וסביבתיים עלול לגרום שלהם לקוי עלול להוביל אפשרויות טיפול טובות יותר עבור חולי סוכרת. היכולת למדוד את רמות הסידן בתאים-בטא מהווה אינדיקטור חשוב של תפקוד תאי בטא, כמו זרם של שחרור אינסולין גורמים מפעילים של יונים של סידן. כאן נתאר פרוטוקול עבור ניטור זרם סידן מגורה-גלוקוז בתאים-דג זברה בטא באמצעות GCaMP6s, חיישן מקודדים גנטית של סידן. השיטה מאפשרת ניטור הדינמיקות סידן תאיים עם רזולוציה תא בודד ב- לשעבר vivo רכוב איונים. הגלוקוז-התגובה של תאי הבטא בתוך איון אותו ניתן ללכוד בו זמנית תחת ריכוזי גלוקוז שונים, אשר מצביע על הנוכחות של הטרוגניות פונקציונלי בין דג זברה בטא-תאים. יתר על כן, השיטה מספקת הגיאופוליטיות והמרחביות טמפורלית ברזולוציה גבוהה, אשר חושף את מהות מתנדנדות זרם סידן על גירוי גלוקוז. הגישה שלנו פתיחת הדלתות כדי להשתמש את דג זברה כמודל כדי לחקור את התרומה של גורמים גנטיים וסביבתיים אל תאי בטא ותפקוד לקוי.

באמצעות פרוטוקול המתואר לעיל, התגובות גלוקוז של תאי-ביתא איון של דג שלאחר ההפריה (dpf) 45 ימים נותחו. בשביל זה, איון העיקרי היה גזור מחיה לאללה, רכוב ב כייר פיברינוגן-תרומבין בצלחת זכוכית-התחתון. איון היה שקוע HBSS המכילה גלוקוז 5 מ מ. ריכוז גלוקוז היה גדל באופן הדרגתיים 10 מ מ, 20 מ מ. התגובות של תאי ביתא-הגדלת ריכוז הגלוקוז נרשמו. לבסוף, תאי בטא-היו depolarized באמצעות 30 מ מ אשלגן כלורי (איור 1). דפולריזציה אשלגן כלורי באמצעות גורם סידן ערך בטא-תאים בריאים.
פיג'י באמצעות תוכנת ניתוח הנתונים, את עוצמת קרינה פלואורסצנטית GCaMP6s של בטא-תאים בודדים מופק ואת מנורמל (איור 2). כפי שניתן לראות מהעקבות בעוצמה פלורסצנטיות, ביתא-תאים בודדים להציג תנודות GCaMP6s זריחה על גירוי גלוקוז, אשר עוצר על גירוי אשלגן כלורי. הטכניקה מספק פתרון הסלולר הגלוקוז-ההיענות של הבטא-התא ואת חלון לתוך הפונקציונליות שלהם.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57851/57851fig1.jpg"> איור 1: Ex-vivo לחיות-הדמיה של זרם סידן באמצעות GCaMP6s בתאים-דג זברה בטא- איון הראשי של Tg(ins:nls-Renilla-mKO2); Tg(ins:GCaMP6s) דג זברה (45 dpf) היה רכוב של פיברינוגן-תרומבין עובש, מודגרות עם גלוקוז 5 מ מ (הבסיס). תאי בטא-תוויות עם גרעיני סמן אדום, ואילו GCaMP6s הוא נוכח לערוץ הצבע הירוק. איון הייתה מאולצת עם רמפה-גלוקוז המורכב הדגירה רציפים עם 10 מ מ, 20 מ מ D-גלוקוז, depolarized באמצעות התוספת של 30 מ מ. אשלגן כלורי. ראשי חץ לסמן פעילות אשר נותחו בטא-תאים בודדים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57851/57851fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57851/57851fig2.jpg"> איור 2: מנורמל GCaMP6s קרינה פלואורסצנטית בעוצמה מעקב אחרי בטא-לתאים בודדים. מנורמל GCaMP6s קרינה פלואורסצנטית בעוצמה-מעקב עבור הבטא-התאים המסומנים ראשי חץ באיור1. ציר ה-x מציין את הזמן בשניות. בחלק העליון, ברים מתארים את ריכוז הגלוקוז, אשלגן כלורי במדיום HBSS. ציר ה-y מציין את עוצמת קרינה פלואורסצנטית מנורמל במהלך סדרת הזמן. בשביל זה, עוצמת בסיסית (F0) מחושבת עוצמת רשע בתקופת דגירה של גלוקוז 5 מ מ. זה יופחת מתוך נתוני זמן-סדרה שלמה (F - F0). הבסיס בעוצמה מעל זה מנורמל מאת העוצמה המקסימלית המוצגים על-ידי התא (F - F0) / (Fמקסימום- F0). המעקב מנורמל מראה מענה מתנדנדות של תאי ביתא-גלוקוז, אשר מייצבת כאשר התאים הם depolarized עם 30 מ מ אשלגן כלורי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57851/57851fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets at JoVE.com

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

תאי בטא פונקציונליות חשוב הומאוסטזיס הגלוקוז בדם, אשר מוערך ברזולוציה תא בודד באמצעות כתב גנטית מקודד עבור זרם סידן.

ניתוח של תפקוד תאי בטא באמצעות הדמיה הסידן בתא יחיד ברזולוציה איונים דג זברה

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to ...

analysis-beta-cell-function-using-single-cell-resolution-calcium

Research

JoVE Journal

Biology

14.7K Views.  TU Dresden. תאי בטא פונקציונליות חשוב הומאוסטזיס הגלוקוז בדם, אשר מוערך ברזולוציה תא בודד באמצעות כתב גנטית מקודד עבור זרם סידן.

Video: Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been described at the morphological level, little is known about the molecular basis of cellular changes that occur as the organism develops. With recent advancements in microfluidics and multiplexing technologies, it is now possible to characterize gene expression in single cells. This allows for investigation of heterogeneity between individual cells of specific cell populations to identify and classify cell subtypes, characterize intermediate states that occur during cell differentiation, and explore differential cellular responses to stimuli. This study describes a protocol to isolate viable, single cells from zebrafish embryos for high throughput multiplexing assays. This method may be rapidly applied to any zebrafish embryonic cell type with fluorescent markers. An extension of this method may also be used in combination with high throughput sequencing technologies to fully characterize the transcriptome of single cells. As proof of principle, the relative abundance of cardiac differentiation markers was assessed in isolated, single cells derived from nkx2.5 positive cardiac progenitors. By evaluation of gene expression at the single cell level and at a single time point, the data support a model in which cardiac progenitors coexist with differentiating progeny. The method and work flow described here is broadly applicable to the zebrafish research community, requiring only a labeled transgenic fish line and access to microfluidics technologies.

This protocol describes a method for isolating single cells from zebrafish embryos, enriching for cells of interest, capturing zebrafish cells in microfluidic based single cell multiplex systems, and assessing gene expression from single cells.

בידוד ואפיון של תאים בודדים מעוברים דג הזברה

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Developmental Biology

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

חיים הדמיה של המוח על ידי עוברי דג הזברה מיקרוסקופיה confocal

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Simultaneous Calcium Imaging and Glucose Stimulation in Living Zebrafish to Investigate In Vivo &#946;-Cell Function

The pancreatic &#946;-cells sustain systemic glucose homeostasis by producing and secreting insulin according to the blood glucose levels. Defects in &#946;-cell function are associated with hyperglycemia that can lead to diabetes. During the process of insulin secretion, &#946;-cells experience an influx of Ca2+. Thus, imaging the glucose-stimulated Ca2+ influx using genetically encoded calcium indicators (GECIs) provides an avenue to studying &#946;-cell function. Previously, studies showed that isolated zebrafish islets expressing GCaMP6s exhibit significant Ca2+ activity upon stimulation with defined glucose concentrations. However, it is paramount to study how &#946;-cells respond to glucose not in isolation, but in their native environment, where they are systemically connected, vascularized, and densely innervated. To this end, the study leveraged the optical transparency of the zebrafish larvae at early stages of development to illuminate &#946;-cell activity in vivo. Here, a detailed protocol for Ca2+ imaging and glucose stimulation to investigate &#946;-cell function in vivo is presented. This technique allows to monitor the coordinated Ca2+ dynamics in &#946;-cells with single-cell resolution. Additionally, this method can be applied to work with any injectable solution such as small molecules or peptides. Altogether, the protocol illustrates the potential of the zebrafish model to investigate islet coordination in vivo and to characterize how environmental and genetic components might affect &#946;-cell function.

Here, the study presents a protocol for calcium imaging and glucose stimulation of the pancreatic &#946;-cells of the zebrafish in vivo.

The pancreatic &#946;-cells sustain systemic glucose homeostasis by producing and secreting insulin according to the blood glucose levels. Defects in ...

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory stimuli that mechanically deflect apical protrusions called hair bundles. Deflection opens mechanotransduction (MET) channels in hair bundles, leading to an influx of cations, including calcium. This cation influx depolarizes the cell and opens voltage-gated calcium channels located basally at the hair-cell presynapse. In mammals, hair cells are encased in bone, and it is challenging to functionally assess these activities in vivo. In contrast, larval zebrafish are transparent and possess an externally located lateral-line organ that contains hair cells. These hair cells are functionally and structurally similar to mammalian hair cells and can be functionally assessed in vivo. This article outlines a technique that utilizes a genetically encoded calcium indicator (GECI), GCaMP6s, to measure stimulus-evoked calcium signals in zebrafish lateral-line hair cells. GCaMP6s can be used, along with confocal imaging, to measure in vivo calcium signals at the apex and base of lateral-line hair cells. These signals provide a real-time, quantifiable readout of both mechanosensation- and presynapse-dependent calcium activities within these hair cells. These calcium signals also provide important functional information regarding how hair cells detect and transmit sensory stimuli. Overall, this technique generates useful data about relative changes in calcium activity in vivo. It is less well-suited for quantification of the absolute magnitude of calcium changes. This in vivo technique is sensitive to motion artifacts. A reasonable amount of practice and skill are required for proper positioning, immobilization, and stimulation of larvae. Ultimately, when properly executed, the protocol outlined in this article provides a powerful way to collect valuable information about the activity of hair-cells in their natural, fully integrated states within a live animal.

The zebrafish is a model system that has many valuable features including optical clarity, rapid external development, and, of particular importance to the field of hearing and balance, externally located sensory hair cells. This article outlines how transgenic zebrafish can be used to assay both hair-cell mechanosensation and presynaptic function in toto.

בתחום ההדמיה סידן Vivo של קו הצד תאים שיער בזחל דג זברה

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory ...

Neuroscience

ב Vivo הדמיה מוחית שלמה של זחלי דגי זברה

In Vivo Whole-Brain Imaging of Zebrafish Larvae Using Three-Dimensional Fluorescence Microscopy

As a vertebrate model animal, larval zebrafish are widely used in neuroscience and provide a unique opportunity to monitor whole-brain activity at the cellular resolution. Here, we provide an optimized protocol for performing whole-brain imaging of larval zebrafish using three-dimensional fluorescence microscopy, including sample preparation and immobilization, sample embedding, image acquisition, and visualization after imaging. The current protocol enables in vivo imaging of the structure and neuronal activity of a larval zebrafish brain at a cellular resolution for over 1 h using confocal microscopy and custom-designed fluorescence microscopy. The critical steps in the protocol are also discussed, including sample mounting and positioning, preventing bubble formation and dust in the agarose gel, and avoiding motion in images caused by incomplete solidification of the agarose gel and paralyzation of the fish. The protocol has been validated and confirmed in multiple settings. This protocol can be easily adapted for imaging other organs of a larval zebrafish.

מחבר זרקור: In Vivo הדמיה של המוח כולו של זחלי זברה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי תלת מימדי  

Presented here is a protocol for in vivo whole-brain imaging of larval zebrafish using three-dimensional fluorescence microscopy. The experimental procedure includes sample preparation, image acquisition, and visualization.

ב Vivo הדמיה מוחית שלמה של זחלי דגי זברה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי תלת מימדי

As a vertebrate model animal, larval zebrafish are widely used in neuroscience and provide a unique opportunity to monitor whole-brain activity at the ...

מעקב אחר התנהגות ודפוס פעילות עצבית במוח הקדמי של דגי הזברה

Two-Photon Calcium Imaging of Forebrain Activity in Behaving Adult Zebrafish

Adult zebrafish (Danio rerio) exhibit a rich repertoire of behaviors for studying cognitive functions. They also have a miniature brain that can be used for measuring activities across brain regions through optical imaging methods. However, reports on the recording of brain activity in behaving adult zebrafish have been scarce. The present study describes procedures to perform two-photon calcium imaging in the dorsal forebrain of adult zebrafish. We focus on steps to restrain adult zebrafish from moving their heads, which provides stability that enables laser scanning imaging of the brain activity. The head-restrained animals can freely move their body parts and breathe without aids. The procedure aims to shorten the time of head restraint surgery, minimize brain motion, and maximize the number of neurons recorded. A setup for presenting an immersive visual environment during calcium imaging is also described here, which can be used to study neural correlates underlying visually triggered behaviors.

מחבר זרקור: התקדמות בחקר המוח של דגי זברה בוגרים 

Here, we present a protocol to perform two-photon calcium imaging in the dorsal forebrain of adult zebrafish.

הדמיית סידן דו-פוטון של פעילות המוח הקדמי בדגי זברה בוגרים

Adult zebrafish (Danio rerio) exhibit a rich repertoire of behaviors for studying cognitive functions. They also have a miniature brain that can be used ...

ניתוח של תפקוד תאי בטא באמצעות הדמיה הסידן בתא יחיד ברזולוציה איונים דג זברה

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

בידוד ואפיון של תאים בודדים מעוברים דג הזברה

חיים הדמיה של המוח על ידי עוברי דג הזברה מיקרוסקופיה confocal

Simultaneous Calcium Imaging and Glucose Stimulation in Living Zebrafish to Investigate In Vivo β-Cell Function

בתחום ההדמיה סידן Vivo של קו הצד תאים שיער בזחל דג זברה

ב Vivo הדמיה מוחית שלמה של זחלי דגי זברה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי תלת מימדי

ב Vivo הדמיה מוחית שלמה של זחלי דגי זברה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי תלת מימדי

ב Vivo הדמיה מוחית שלמה של זחלי דגי זברה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי תלת מימדי

הדמיית סידן דו-פוטון של פעילות המוח הקדמי בדגי זברה בוגרים

הדמיית סידן דו-פוטון של פעילות המוח הקדמי בדגי זברה בוגרים

הדמיית סידן דו-פוטון של פעילות המוח הקדמי בדגי זברה בוגרים