Agradecemos a membros do laboratório Ninov para comentários sobre o manuscrito, membros do centro para instalações de peixe e microscopia de Dresden de terapias regenerativas (poucos) para obter assistência técnica. N.N. é suportado pelo financiamento da DFG-poucos, Cluster de excelência no TU-Dresden, Fundação de pesquisa alemã (DFG) e o centro alemão para Diabetes pesquisa (DZD).

Todos os procedimentos, incluindo assuntos animais foram aprovados pelo acto de bem-estar Animal e com a permissão do Landesdirektion Sachsen, Alemanha (AZ 24 – 9168.11 / 1/2013 / 14, T12/2016).
1. preparação
Nota: Este protocolo é para ex vivo por imagens do zebrafish ilhéu primário de duplo Tg transgénicos (ins:nls-Renilla-mKO2; cryaa:CFP); TG (ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry) 19 zebrafish. Nesta linha de transgênicos, o promotor de insulina (ins) conduz a expressão específica de células beta de dois transgenes: nls-Renilla-mKO2, que marca o núcleo das células-beta com monomérico Kusabira laranja 2 (mKO2) fluorescência; e GCaMP6s15, que emite fluorescência verde em resposta ao aumento nos níveis de cálcio intracelular. A expressão de beta-pilha-específico de GCaMP6s permite estudar a glicose-capacidade de resposta das células-beta sem a interferência de alterações de cálcio em torno de tipos de células.
<ol><li>Preparar o estoque fresco fibrinogênio (10 mg/mL) dissolvendo-se 10 mg de fibrinogênio bovino em 1 mL de Ca2 +/ mg2 +-que contém a solução de sal balanceada de Hanks (HBSS) num tubo de centrífuga 1,5 mL. Vórtice vigorosamente até que o pó de fibrinogênio se dissolve completamente. Manter a solução em temperatura ambiente por mais pelo menos de 15 min. Nota: O estoque pode ser mantido em temperatura ambiente por 2 – 3 h.. descarte o estoque se a solução começa a polimerizar-se e torna-se viscoso.</li>
	<li>Prepare a solução de trabalho de fibrinogênio (3,3 mg/mL) diluindo o estoque de fibrinogênio HBSS em triplo. Por exemplo, misture 300 µ l de caldo de fibrinogênio em 600 µ l de HBSS preparar 900 µ l da solução de trabalho de fibrinogênio.</li>
	<li>Preparar a solução de trombina (10 U/mL) dissolvendo-se 10 unidades de trombina em 1 mL de HBSS ou fosfato tampão salino (PBS). Nota: Esta solução pode ser preparada com antecedência, aliquotada em 50 partes µ l e congelada a-20 ° C.</li>
	<li>Prepare 200 mM D-glucosa dissolvendo 1,8 g de D-glicose em 50 mL de água. Manter em 4 ° C para armazenamento a longo prazo.</li>
	<li>Prepare 300 mM solução KCl dissolvendo-se 1,1 g de KCl em 50 mL de água. Manter em 4 ° C para armazenamento a longo prazo.</li>
	<li>Adquirir 35mm pratos de vidro-fundo de diâmetro para a montagem dos ilhéus.</li>
	<li>Para dissecação e fixar o ilhéu, usar um microscópio estéreo equipado com lâmpada de fluorescência e cubo filtro vermelho (TRITC: excitação: 554 – 532 nm, emissão: 613 – 570 nm; ou Texas-vermelho: excitação: 540 – 580 nm, emissão: 592-667 nm).</li>
	<li>Para o influxo de cálcio em células-beta, uso um microscópio confocal invertido (Zeiss LSM 780 ou similar) com 20 X (0,8 NA) objetivo do ar e equipado com um suporte de placa para os pratos de vidro-fundo de diâmetro 35mm de imagem.</li>
	<li>Prepare uma solução de 200 mg/L de sulfonato de metano metanosulfonato (MS222) para eutanásia o zebrafish.</li>
	<li>Requisitar pratos de Petri de 90 mm para a dissecação do zebrafish.</li>
</ol>2. Zebrafish primária ilhéu dissecação e montagem
<ol><li>Eutanásia em um peixe usando incubação prolongada em MS222. Para isso, delicadamente Retire o peixe do aquário usando uma rede de pesca e incube-lo em uma placa de Petri contendo a solução MS222 até que o animal não mostra nenhum movimento de odontódios (brânquias); Normalmente, este leva 5 min. transferência o peixe para um prato de Petri contendo a solução HBSS com Ca2 +/ mg2 +.</li>
	<li>
Sob um microscópio estéreo equipado com uma lâmpada da fluorescência e cubo filtro vermelho, disse a pele que cobre o lado direito do abdômen do animal para isolar o pâncreas.
	<ol>
<li>Para isso, corte a pele do zebrafish da boca a nadadeira anal usando Pinças afiadas. Descascar a pele cortada para expor o abdome; Este recorte expõe os órgãos internos. Usando a fluorescência vermelha de mKO2 expressão em células-beta, verificar a localização dos ilhéus através de exame visual, sob o microscópio. Se necessário, remova os lóbulos do fígado, como eles poderiam cobrir o ilhéu, tornando difícil de encontrar. Nota: O Ilhéu primário está localizado perto da região anterior do abdômen, geralmente no lado direito.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Limpe o ilhéu primário removendo cuidadosamente o tecido circundante como fígado e adipócitos. Tomar precauções para não ferir ou picar o ilhéu; Depois de limpar o tecido circundante, as células individuais na superfície do Ilhéu tornam-se perceptíveis.</li>
	<li>Pipete uma gota de 30 µ l de HBSS no centro de um prato fundo de vidro. Transferi o ilhéu dissecado para essa queda.</li>
	<li>Lave cuidadosamente o ilhéu, uma vez com HBSS e uma vez com 30 µ l da solução de trabalho de fibrinogênio (3,3 mg/mL). Certifique-se de evitar a secagem do Ilhéu durante as etapas de lavagem, pois se assim resulta na morte celular.</li>
	<li>Lenta e suavemente, adicione 10 µ l da solução de trombina (10 U/mL). O ilhéu e o prato deixe intocado por 15 – 20 min, observar que a gota de fibrinogênio-trombina se torne viscoso e ligeiramente opaco neste momento.</li>
</ol>3. Ex Vivo ao vivo-imagem latente da intensidade de fluorescência GCaMP em ilhotas de Zebrafish primária
<ol><li>Adicionar 200 µ l de HBSS em cima do molde e coloque o prato com cuidado sobre o suporte da placa do microscópio confocal. Use um objectivo de ar X, at 0.8, 20 para a imagem latente confocal. Localize o ilhéu usando a opção brightfield.</li>
	<li>Usando o filtro para fluorescência vermelha para visualizar a fluorescência nuclear mKO2 em células-beta, o foco na ilhota. Núcleos individuais devem ser claramente visíveis.</li>
	<li>Localize um avião claro imagem alterando manualmente o plano focal do microscópio confocal a fim de mover-se através da espessura da ilhota ao longo de seu eixo z. Certifique-se de que o avião de imagem contém um número suficiente (50-100) de células-beta para a imagem latente, e o brilho da fluorescência nuclear mKO2 é uniforme, especialmente no centro da ilha.</li>
	<li>Configurar uma aquisição sequencial para GCaMP6s e mKO2 de fluorescência usando as seguintes configurações no "Menu Setup inteligente": GCaMP6s, excitação: 488 nm, emissão: 500 – 555 nm, falsa-cor: verde (selecione "GFP"); mKO2, excitação: 561 nm (mCherry), de emissão: 570 – 630 nm, falsa-cor: vermelho (selecione "mCherry"). Nota: Com esta configuração, o canal vermelho irá gravar a posição dos núcleos de células beta, enquanto o canal verde irá gravar a intensidade de fluorescência de GCaMP.</li>
	<li>No modo de"aquisição" definir a resolução da imagem a 1.024 x 1.024 pixels, a velocidade em 10 e em média em 1. Iniciar uma contínua gravação selecionando a opção para "Séries temporais", e definindo a "duração" para 500 ciclos, com tempo de aquisição de s aproximadamente 2 por quadro. Nota: Os primeiros 50 quadros do tempo-série correspondem a atividade das células-beta na concentração de glicose de 5 mM. Esta é a resposta de linha de base. Uma resposta beta-célula mostrará depilação e diminuindo a intensidade de fluorescência verde com o tempo. Temos observado que alguns (1 – 5%) das células-beta oscilar em glicose de 5 mM.</li>
	<li>
Fique de olho no ciclo de imagem. Após os primeiros 50 quadros, aumente a concentração de glicose da solução circundante de 10 mM sem parar a gravação.
	<ol>
<li>Sem distorçer a aquisição de imagens, gentilmente Pipete 5 µ l da solução de D-glicose em cima do gel segurando o ilhéu de 200 mM. Adquira 150 quadros na glicose 10 mM. Nota: O aumento da concentração de glicose aumentará o número de células-beta passando por GCaMP fluorescentes oscilações no canal verde.</li>
		<li>Certifique-se de que os núcleos das células permanecem estáveis durante o processo. Se o Ilhéu está tremendo extensivamente durante a aquisição e os núcleos estão se movendo fora do plano focal, descarte a amostra (se necessário).</li>
		<li>Espere um período suficiente para permitir a polimerização do molde de fibrinogênio-trombina para garantir a estabilidade das amostras subsequentes.</li>
	</ol>
</li>
	<li>A 200 quadros, aumente ainda mais a concentração da solução de 20mm suavemente pipetando 10 µ l de 200 milímetros solução de D-glicose. Adquira 150 quadros para a concentração de 20 mM.</li>
	<li>Após 350 quadros, despolarizar o ilhéu com 30 mM de KCl. Para isso, adicione 20 µ l da 300 mM solução KCl. Nesta fase, observe que as oscilações de fluorescência GCaMP6s irão parar e consertar em uma alta intensidade; células-beta que não respondeu a glicose também podem exibir um aumento na intensidade de fluorescência verde sobre adição de KCL.</li>
</ol>4. quantificação do traço de fluorescência GCaMP Beta-células individuais
Nota: Para localizar e quantificar as respostas das células-beta individuais para diferentes níveis de glicose, quantificar a intensidade de fluorescência GCaMP durante todo o período de imagem. Quantificação é realizada no celular resolução. Para isso, use FIJI20 para extrair os valores de intensidade de fluorescência GCaMP das imagens (etapas 4.1 – 4.6) e software de planilha ou R21 para realizar a análise (etapas 4.8 – 4,9).
<ol><li>Abra o arquivo de imagem em FIJI, usando a caixa de ferramentas"LSM". Para isso, selecione "Plugin | Caixa de ferramentas LSM | Mostre a caixa de ferramentas LSM". No "Toolbox LSM", clique em "Open LSM" e selecione o arquivo de imagem. Nota: Para formatos não suportados pelo LSM "Toolbox", convertê-los primeiro para tiff para análise.</li>
	<li>Extrair as respostas das células usando a ferramenta de região de interesse (ROI) em FIJI. Abra o "Gerenciador de ROI" no menu "Analisar" em "Ferramentas". Desenhe manualmente o ROI usando a ferramenta de seleção"polígono" localizada na barra de ferramentas.</li>
	<li>Desenhe o ROI no canal vermelho em que os núcleos de células beta são visíveis. Selecione o ROI tal que cobre uma área que é maior do que o núcleo da célula, a fim de incluir alguns do citoplasma da célula. Certifique-se de que a posição de ROI é consistente entre quadros e ajustar a posição, se necessário.</li>
	<li>Adicione o ROIs selecionado para o "Gerenciador de ROI", clicando no botão "Adicionar [t]". Selecionar e adicionar ROIs múltiplos para o ROI para a obtenção de dados em várias células.</li>
	<li>Em seguida, no menu "Analisar", selecione "Definir medidas". Selecione "Densidade integrada" para especificar a extração da intensidade de fluorescência total dentro da área.</li>
	<li>Mudar para o canal verde, contendo a fluorescência GCaMP e selecione "Multi medida" no "Gerenciador de ROI". Nota: Isto irá fornecer as medições de intensidade para as células em toda a série de tempo.</li>
	<li>No caso da posição de ROI precisa ser ajustada devido ao movimento de ilhota, compile manualmente as medições de intensidade em diferentes quadros. Copiar e colar os valores para uma planilha separada.</li>
	<li>Obter os carimbos de hora dos quadros da imagem da caixa de ferramentas"LSM". Uso "aplicar selos | Aplicar selos t | Nome do arquivo | Despejar a textfile"para obter os carimbos de hora. Salvar os carimbos de hora usando a opção "Salvar como", ou copiá-los para a planilha.</li>
	<li>Após compilar os valores de intensidade para todas as células, realize a análise uma célula de cada vez ou automaticamente (por exemplo, usando fórmulas do Excel ou R).</li>
	<li>
Analise as células individuais em duas etapas.
	<ol>
<li>Na primeira etapa, calcule a intensidade de fluorescência acima da linha de base. Para este fim, calcule a intensidade fluorescente de base (F0) como a média das intensidades de fluorescência para os primeiros 50 quadros (glicose de 5 mM). Subtrair a linha de base (F0) toda a série de tempo (F – F0). Nota: algumas células podem mostrar clara GCaMP oscilações sob glicose basal, que normalmente continuam após estimulação com concentrações mais elevadas. Para tais células, somente é possível estimar F0 , tendo a intensidade média dos quadros iniciais no qual as células mostraram uma gota em fluorescência.</li>
		<li>Na segunda etapa da análise, obter a intensidade de fluorescência GCaMP final normalizando a intensidade de fluorescência. Nota: Esta é realizada para remover as diferenças entre ilhotas de animais diferentes. Ilhéus individuais exibem diferentes níveis de emissão de fluorescência após estimulação de glicose.</li>
		<li>Normalize a intensidade da fluorescência, dividindo-o com o valor mais alto de intensidade. Para isso, calcular a intensidade de pico (Fmáx – F0) e dividir os valores basais subtraído pelo pico de intensidade para produzir a final GCaMP a intensidade de fluorescência (F – F0) / (Fmáx – F0).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Descarte as células que não apresentam uma alteração na intensidade após estimulação de KCl, como eles podem ser insalubre ou danificados.</li>
	<li>Para realizar a análise (medidas 4.9 – 4.10) em R, use o script de R (plotcelltrace. R) fornecido com este manuscrito.</li>
</ol>

<ol>
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Os autores declaram não concorrentes interesses financeiros.

Aqui vamos demonstrar uma técnica para a quantificação de células beta glicose capacidade de resposta na resolução de célula única. Isto é possibilitado pela concentração de cálcio intracelular, utilizando um indicador de cálcio geneticamente codificado, GCaMP6s de monitoramento. A atividade de células beta é capturado ex vivo montando o Ilhéu em um molde de fibrinogênio-trombina. Uma etapa crítica do protocolo é a estabilidade do molde. Tempo suficiente deve ser dada para o fibrinogênio dissolver na solução HBSS. Sem isso, o molde não polimerizar-se suficientemente para fornecer estabilidade durante a sessão de imagens. Um ilhéu montado no molde de fibrinogênio-trombina e imersos em meios de cultura celular pode permanecer viável pelo menos uma semana (dados não mostrados). Alternativas para o molde de fibrinogênio-trombina, como agarose de baixo ponto de fusão, podem ser utilizadas para montar o ilhéu22. Outro parâmetro crítico é a dissecção da ilhota. Durante esta etapa, o tecido circundante a ilhota precisa ser removido sem ferir ou picar o ilhéu. Uma dissecação hábil vem com prática.
Uma limitação do protocolo de imagem é a restrição a um avião confocal de ilhota. Isso é feito para capturar a dinâmica do influxo de cálcio dentro beta-células individuais. Um Z-pilha através de toda espessura da ilhota leva à baixa de imagem velocidades e perda de sinal oscilatório de células individuais. Esta limitação pode ser melhorada usando meios mais rápidos de confocal de imagem tais como a microscopia de disco giratório, para permitir a captura a dinâmica de cálcio em 3 dimensões. Outra fronteira seria na vivo cálcio imagem12. A natureza transparente do zebrafish embrião ou o uso de cepas de pigmento-menos de zebrafish adultos23 poderia abrir a possibilidade para na vivo de imagens no futuro.
A imagem da atividade de células beta em alta resolução espacial e temporal permite investigar a heterogeneidade funcional entre beta-células individuais. Esta abordagem pode ajudar a lançar luz sobre a existência de sub-populações de células beta. Recentemente, vários estudos têm demonstrado a existência de sub-populações em células-beta nominalmente homogênea24,25,26. Ex vivo de imagem pode ser combinada com repórteres genéticos para caracterizar da resposta do subpopulação de glicose. Além disso, combinando a configuração de imagem com estimulação farmacológica pode permitir para rastreio de compostos que poderiam melhorar a funcionalidade de células beta.
Em resumo, a técnica aqui apresentada permite a quantificação e comparação entre a capacidade de resposta de glicose para beta-células individuais. Ele fornece uma janela direta para funções de células beta, um parâmetro importante no desenvolvimento do diabetes.

Nossa glicose no sangue é mantida em uma estreita faixa, em grande parte devido a função do pâncreas endócrino. A função endócrina do pâncreas é executada por ilhotas de Langerhans, que contêm células secretoras de hormônio. As beta-células secretoras de insulina são responsáveis pela redução dos níveis de glicose sanguínea após uma refeição contendo carboidratos. A secreção de insulina inadequada de células beta pode resultar em diabetes1, que é caracterizada por glicemia alta sustentada. Tipo 1 e Diabetes tipo 2, que atualmente atinge mais de 400 milhões de pessoas no mundo, leva a morbidade e mortalidade2. Investigando os fatores moleculares e ambientais que contribuem para a disfunção da célula beta, entenderemos melhor como diabetes tipo 2 começa e progride. Além disso, a capacidade de diferenciar células estaminais humanas em células-beta funcional em vitro pode fornecer uma fonte de novas células-beta das terapias de reposição celular no Diabetes tipo 1. Para este fim, é importante estudar a função da célula beta e maturação em organismos-modelo genético a fim de obter o conhecimento necessário para fazer as células-beta funcionais em um prato.
Funcionalidade de células beta pode ser monitorada no nível de conjunto-ilhéu por quantificar a quantidade total de insulina secretada em resposta à glicose-estimulação. Esta abordagem cumulativa estuda o ilhéu como um único grupo de células sem diferenciação individual Propriedades da célula. No entanto, a análise das respostas de glicose de beta-células individuais revelou uma diversidade nas propriedades funcionais das células beta e a presença de heterogeneidade3. Para avaliar a função das células beta-individuais, é possível monitorar as alterações intracelulares que levam à secreção de insulina4. A secreção de insulina é precedida por uma entrada de glicose para as células-beta. A glicose que entra nas células-beta é rapidamente metabolizada a ATP. Altas concentrações de ATP intracelulares diminuem a probabilidade aberta de canais de íons de potássio sensíveis ao ATP levando a despolarização da célula beta. Despolarização abre os canais iônicos de cálcio voltagem-sensíveis e aumenta cálcio intracelular. Por sua vez, cálcio desencadeia a exocitose de insulina, que é liberada na circulação e reduz os níveis de glicose através da promoção da utilização de glicose5,6,7.
Várias estratégias foram aplicadas para investigar a função das células beta, incluindo monitoramento do potencial de membrana8, visualização directa de insulina-vesículas de exocitose9e quantificação de intracelular Ca2 + afluxo como um proxy para glicose-resposta10. Entre eles, imagem latente de intracelular Ca2 + fornece a vantagem da extrapolação da análise de várias células individuais dentro da mesma ilhéu11,12, permitindo a comparação direta da glicose-resposta entre beta-células individuais. Concentração de Ca2 + intracelular pode ser monitorada usando corantes fluorescentes sensíveis ao cálcio13 ou cálcio geneticamente codificado indicadores (GECIs)14. Considerando que o cálcio-indicador corantes falta especificidade de tipo de célula, GECIs pode ser expressa em um tipo específico de célula pelos promotores específicos. Além disso, a nova geração do GECIs, tais como GCaMP6, fornece a melhor relação sinal-ruído juntamente com mais rápido temporal dinâmica15. Aqui descrevemos o utilitário da novo-geração do GECIs, em particular GCaMP6s, Visualizar o cálcio em células-beta em resolução de célula única. Podemos aplicar esse método para o ilhéu primário zebrafish como nosso modelo de escolha. Durante o desenvolvimento embrionário, células-beta no Ilhéu do primário originam a dorsal e ventral do pâncreas botões16. A ilha principal está localizada em uma posição anatômica estereotipada dentro do pâncreas zebrafish, permitindo a sua fácil identificação e isolamento. Células-beta no Ilhéu do primário são necessárias para glicose-regulamento, conforme sua genética ablação leva à hiperglicemia17,18. Além disso, estas células-beta se tornar glicose responsivo durante o início do zebrafish desenvolvimento19. Este protocolo pode ser também aplicado a imagem latente as ilhotas secundárias, que se formam durante as fases pós-embrionárias. O protocolo permite a imagem beta-células ex vivo, em fases posteriores de desenvolvimento e sob as concentrações de glucose definidos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1034">
	<tbody>
		<tr height="79">
			<td height="79" style="height:79px;width:276px;">Transgenic Zebrafish line: Tg(ins:nls-Renilla-mKO2; cryaa:CFP); Tg(ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry)</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:291px;">By request from authors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:276px;">Stereo microscope</td>
			<td style="width:123px;">ZEISS</td>
			<td style="width:344px;">495015-0001-000</td>
			<td style="width:291px;">SteREO Discovery.V8</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:276px;">Fluorescence lamp</td>
			<td style="width:123px;">ZEISS</td>
			<td style="width:344px;">423013-9010-000</td>
			<td style="width:291px;">Illuminator HXP 120 V</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:276px;">Red Filter Cube</td>
			<td style="width:123px;">ZEISS</td>
			<td style="width:344px;">000000-1114-462&#160;</td>
			<td style="width:291px;">Filter set 45 HQ TexasRed</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:276px;">Confocal Microscope</td>
			<td style="width:123px;">ZEISS</td>
			<td style="width:344px;">LSM 780</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bovine fibrinogen</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td>F8630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HBSS (Hanks&#39; Balanced Salt solution)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Thrombin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">D-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">35 mm diameter glass-bottom dishes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>150680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">tricaine methane sulfonate</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;">E10521&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:276px;">Fine Forceps</td>
			<td style="width:123px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:344px;">11445-12</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:276px;">FIJI, using ImageJ Version: 2.0.0-rc-43/1.50e</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:291px;">https://fiji.sc/</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:276px;">R, version 3.2.4</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:291px;">https://www.r-project.org/</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:276px;">RStudio</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:291px;">https://www.rstudio.com/</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:276px;">plotcelltrace.R</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:291px;">A custom script provided with the manuscript</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of beta-cell function using single-cell resolution calcium imaging in zebrafish islets

As células-beta do pâncreas respondem ao aumento das concentrações de glicose do sangue através da secreção da hormona insulina. A disfunção das células beta leva a hiperglicemia e consequências graves, com risco de vida. Compreensão de como as células-beta operam sob condições fisiológicas e que fatores genéticos e ambientais podem causar sua disfunção pode levar a melhores opções de tratamento para pacientes diabéticos. A capacidade de medir os níveis de cálcio em células-beta serve como um importante indicador da função de células beta, como o fluxo de liberação de insulina de gatilhos de íons de cálcio. Aqui descrevemos um protocolo para monitorar o influxo de cálcio glicose-estimulada em células-beta do zebrafish usando GCaMP6s, um sensor geneticamente codificado de cálcio. O método permite o monitoramento da dinâmica de cálcio intracelular com resolução de célula única em ex vivo montado ilhotas. A glicose-capacidade de resposta das células-beta dentro da mesma ilha pode ser capturado simultaneamente sob concentrações diferentes de glicose, que sugere a presença de heterogeneidade funcional entre as células-beta do zebrafish. Além disso, a técnica fornece a alta resolução temporal e espacial, que revela a natureza oscilatória o influxo de cálcio após estimulação de glicose. Nossa abordagem abre as portas para usar o zebrafish como um modelo para investigar a contribuição de fatores genéticos e ambientais para a função de células beta e disfunção.

Usando o protocolo descrito acima, foram analisadas as respostas de glicose das células-beta em um ilhéu de um zebrafish pós fertilização (dpf) de 45 dias. Para isso, a ilhota principal foi dissecada de um animal euthanized e montada no molde trombina fibrinogênio em um prato fundo de vidro. O ilhéu foi imerso em HBSS contendo glicose de 5 mM. A concentração de glicose foi aumentada de forma faseada de 10 mM e 20 mM. As respostas das células-beta para o aumento das concentrações de glicose foram gravadas. Finalmente, as células-beta foram despolarizadas usando 30 mM KCl (Figura 1). A despolarização usando KCl induz a entrada de cálcio nas células-beta saudáveis.
Usando a FIJI e um software de análise de dados, a intensidade de fluorescência GCaMP6s de beta-células individuais é extraída e normalizado (Figura 2). Como visto o rastreamento da intensidade de fluorescência, beta-células individuais exibem oscilações na GCaMP6s de fluorescência após estimulação de glicose, que para após estimulação de KCl. A técnica fornece uma resolução de celular de glicose-capacidade de resposta da célula beta- e uma janela em sua funcionalidade.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57851/57851fig1.jpg"> Figura 1: Ex vivo ao vivo-imagem latente do influxo de cálcio usando GCaMP6s em células-beta do zebrafish. Uma ilhota primária de Tg(ins:nls-Renilla-mKO2); TG(ins:GCaMP6s) zebrafish (45 dpf) foi montado no molde de fibrinogênio-trombina e incubada com glicose de 5 mM (basal). Células-beta foram rotuladas com um marcador vermelho nuclear, enquanto a fluorescência de GCaMP6s está presente no canal verde. O ilhéu foi estimulado com uma glicose-rampa consistindo de incubação sequencial com 10 mM e 20 mM D-glicose e despolarizada através da adição de 30 mM que KCl. setas marcam beta-células individuais, cuja actividade foi analisada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57851/57851fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57851/57851fig2.jpg"> Figura 2: normalizado GCaMP6s intensidade de fluorescência-traço beta-células individuais. Normalizado GCaMP6s fluorescência intensidade-rastreamento para as células-beta marcado com setas na Figura 1. O eixo x indica o tempo em segundos. No topo, barras mostram a concentração de glicose e de KCl no meio HBSS. O eixo y denota a intensidade de fluorescência normalizado durante a série de tempo. Por isso, intensidade da linha de base (F0) é calculada como a média intensidade durante incubação em glicose de 5 mM. Isto é subtraído os todo série de tempo dados (F - F0). A intensidade de linha de base é normalizada pela intensidade máxima exibida pela célula (F - F0) / (Fmáx- F0). O registo normalizado mostra uma resposta oscilatória das células beta à glicose, que estabiliza quando as células são despolarizadas com 30 mM KCl. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57851/57851fig2large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Funcionalidade de células beta é importante para a homeostase de glicose sanguínea, que é avaliada em célula única resolução usando um repórter geneticamente codificado para o influxo de cálcio.

Análise da função de células Beta utilizando imagens de cálcio de célula única resolução em ilhotas de Zebrafish

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to ...

analysis-beta-cell-function-using-single-cell-resolution-calcium

Research

JoVE Journal

Biology

14.6K visualizações.  TU Dresden. Funcionalidade de células beta é importante para a homeostase de glicose sanguínea, que é avaliada em célula única resolução usando um repórter geneticamente codificado para o influxo de cálcio.

Vídeo: Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish1-5. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adult zabrafish. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish with our simple custom-built apparatus using a new protocol which is established in our lab. Both our apparatus and step-by-step procedure of OKR in adult zebrafish are illustrated in this video. In addition, the measurements of the larval OKR, as well as the optomotor response (OMR) test of adult zebrafish, are also demonstrated in this video. This OKR assay of adult zebrafish in our experiment may last for up to 4 hours. Such OKR test applied in adult fish will benefit to visual function investigation more efficiently when the adult fish vision system is manipulated.
Su-Qi Zou and Wu Yin contributed equally to this paper.

Optokinetic response has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adults1-5. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish using a new protocol which is established in our lab.

Usando a resposta optocinético para estudar a função visual de zebrafish

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the ...

Biologia

Single Cell Fate Mapping in Zebrafish

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, lymphatic, and blood vessel lineages arise in developing embryos requires fate mapping and lineage tracing of undifferentiated precursor cells. Recently, photoactivatable proteins which include: Eos1, 2, PAmCherry3, Kaede4-7, pKindling8, and KikGR9, 10 have received wide interest as cell tracing probes. The fluorescence spectrum of these photosensitive proteins can be easily converted with UV excitation, allowing a population of cells to be distinguished from adjacent ones. However, the photoefficiency of the activated protein may limit long-term cell tracking11. As an alternative to photoactivatable proteins, caged fluorescein-dextran has been widely used in embryo model systems7, 12-14. Traditionally, to uncage fluorescein-dextran, UV excitation from a fluorescence lamp house or a single photon UV laser has been used; however, such sources limit the spatial resolution of photoactivation. Here we report a protocol to fate map, lineage trace, and detect single labeled cells. Single cells in embryos injected with caged fluorescein-dextran are photoactivated with near-infrared laser pulses produced from a titanium sapphire femtosecond laser. This laser is customary in all two-photon confocal microscopes such as the LSM 510 META NLO microscope used in this paper. Since biological tissue is transparent to near-infrared irradiation15, the laser pulses can be focused deep within the embryo without uncaging cells above or below the selected focal plane. Therefore, non-linear two-photon absorption is induced only at the geometric focus to uncage fluorescein-dextran in a single cell. To detect the cell containing uncaged fluorescein-dextran, we describe a simple immunohistochemistry protocol16 to rapidly visualize the activated cell. The activation and detection protocol presented in this paper is versatile and can be applied to any model system. 
Note: The reagents used in this protocol can be found in the table appended at the end of the article.

A method is described to photoactivate single cells containing a caged fluorescent protein using two-photon absorption from a Ti:Sapphire femtosecond laser oscillator. To fate map the photoactivated cell, immunohistochemistry is used. This technique can be applied to any cell type.

Mapeamento Destino única célula em Zebrafish

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, ...

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression both in terms of tissue distribution and developmental stage. Protocols are described for the use of WISH of zebrafish embryos using antisense RNA probes labeled with digoxigenin. Probes are generated by incorporating digoxigenin-linked nucleotides through in vitro transcription of gene templates that have been cloned and linearized. The chorions of embryos harvested at defined developmental stages are removed before incubation with specific probes. Following a washing procedure to remove excess probe, embryos are incubated with anti-digoxigenin antibody conjugated with alkaline phosphatase. By employing a chromogenic substrate for alkaline phosphatase, specific gene expression can be assessed. Depending on the level of gene expression the entire procedure can be completed within 2-3 days.

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

The zebrafish, a small tropical fish, has become a popular model for studying gene function during vertebrate development and disease. The temporal and spatial expression of target genes can be determined by in situ hybridization. Our improved protocol allows for the detection of low abundant transcripts with low non-specific background signal.

Alta resolução Monte Whole<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridização dentro embriões Zebrafish para estudar a expressão gênica e função

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic tools have been introduced, including multiple strategies for inducing mutations and generating transgenic lines. However, large-scale screening is limited by traditional genotyping methods, which are time-consuming and labor-intensive. Here we describe a technique to analyze zebrafish genotypes by PCR combined with high-resolution melting analysis (HRMA).&#160;This approach is rapid, sensitive, and inexpensive, with lower risk of contamination artifacts.&#160;Genotyping by PCR with HRMA can be used for embryos or adult fish, including in high-throughput screening protocols.

PCR combined with high-resolution melt analysis (HRMA) is demonstrated as a rapid and efficient method to genotype zebrafish.

Rápida e eficiente Zebrafish Genotipagem Usando PCR com alta resolução Análise Melt

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys are composed of functional units known as nephrons, which are highly conserved with other vertebrates, including mammals. Research in zebrafish has recently demonstrated that two distinctive phenomena transpire after adult nephrons incur damage: first, there is robust regeneration within existing nephrons that replaces the destroyed tubule epithelial cells; second, entirely new nephrons are produced from renal progenitors in a process known as neonephrogenesis. In contrast, humans and other mammals seem to have only a limited ability for nephron epithelial regeneration. To date, the mechanisms responsible for these kidney regeneration phenomena remain poorly understood. Since adult zebrafish kidneys undergo both nephron epithelial regeneration and neonephrogenesis, they provide an outstanding experimental paradigm to study these events. Further, there is a wide range of genetic and pharmacological tools available in the zebrafish model that can be used to delineate the cellular and molecular mechanisms that regulate renal regeneration. One essential aspect of such research is the evaluation of nephron structure and function. This protocol describes a set of labeling techniques that can be used to gauge renal composition and test nephron functionality in the adult zebrafish kidney. Thus, these methods are widely applicable to the future phenotypic characterization of adult zebrafish kidney injury paradigms, which include but are not limited to, nephrotoxicant exposure regimes or genetic methods of targeted cell death such as the nitroreductase mediated cell ablation technique. Further, these methods could be used to study genetic perturbations in adult kidney formation and could also be applied to assess renal status during chronic disease modeling.

The zebrafish adult kidney is an excellent system for renal regeneration and disease studies. An essential aspect of such research is the assessment of nephron structure and function. This protocol describes several methodologies that can be implemented to assess nephron tubule composition and to evaluate renal reabsorption.

Análise de Composição Nephron e função no rim adulto Zebrafish

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...

Evaluation of Zebrafish Kidney Function Using a Fluorescent Clearance Assay

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish kidney develops and functions in almost the same way as humans. A major difference in the construction of the human kidney is the presence of millions of nephrons compared to the zebrafish that has only two. However, simplifying such a complex system into basic functional units has aided our understanding of how the kidney develops and operates. In zebrafish, the midline located glomerulus is responsible for the initial blood filtration into two pronephric tubules that diverge to run bilaterally down the embryonic axis before fusing to each other at the cloaca. The pronephric tubules are heavily populated by motile cilia that facilitate the movement of filtrate along the segmented tubule, allowing the exchange of various solutes before finally exiting via the cloaca2-4. Many genes responsible for CKD, including those related to ciliogenesis, have been studied in zebrafish5. However, a major draw back has been the difficulty in evaluating zebrafish kidney function after genetic manipulation. Traditional assays to measure kidney dysfunction in humans have proved non translational to zebrafish, mainly due to their aquatic environment and small size. For example, it is not physically possible to extract blood from embryonic staged fish for analysis of urea and creatinine content, as they are too small. In addition, zebrafish do not produce enough urine for testing on a simple proteinuria &#8216;dipstick&#8217;, which is often performed during initial patient examinations. We describe a fluorescent assay that utilizes the optical transparency of the zebrafish to quantitatively monitor the clearance of a fluorescent dye, over time, from the vasculature and out through the kidney, to give a read out of renal function1,6-9.

The zebrafish is a popular tool to model chronic kidney disease (CKD). However, their small size makes it impossible to evaluate renal function using traditional methods. We describe a fluorescent dye kidney clearance assay1 that allows quantitative analysis of zebrafish kidney function in CKD.

Avaliação da Função Renal Zebrafish Usando um teste de eliminação fluorescente

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

De alta resolução de imagem Time-lapse e análise automatizada de microtúbulos Dynamics em Viver umbilical humano Células Endoteliais da Veia

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

CUBIC Protocol Visualizes Protein Expression at Single Cell Resolution in Whole Mount Skin Preparations

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium covering most of our body, and epidermal appendages such as the hair follicles and sweat glands. The epidermis undergoes regeneration throughout life and in response to injury. This is enabled by K14-expressing basal epidermal stem/progenitor cell populations that are tightly regulated by multiple regulatory mechanisms active within the epidermis and between epidermis and dermis. This article describes a simple method to clarify full thickness mouse skin biopsies, and visualize K14 protein expression patterns, Ki67 labeled proliferating cells, Nile Red labeled sebocytes, and DAPI nuclear labeling at single cell resolution in 3D. This method enables accurate assessment and quantification of skin anatomy and pathology, and of abnormal epidermal phenotypes in genetically modified mouse lines. The CUBIC protocol is the best method available to date to investigate molecular and cellular interactions in full thickness skin biopsies at single cell resolution.

This report describes a CUBIC protocol to clarify full thickness mouse skin biopsies, and visualize protein expression patterns, proliferating cells, and sebocytes at the single cell resolution in 3D. This method enables accurate assessment of skin anatomy and pathology, and of abnormal epidermal phenotypes in genetically modified mouse lines.

Protocolo CUBIC Visualiza Protein Expression na resolução única célula em preparações e peles, inteiros Mount

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium ...

A Rapid Automated Protocol for Muscle Fiber Population Analysis in Rat Muscle Cross Sections Using Myosin Heavy Chain Immunohistochemistry

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle composition. Various time-consuming methods have traditionally been used to study fiber populations in many fields of research. However, recently developed immunohistochemical methods based on myosin heavy chain protein expression provide a quick alternative to identify multiple fiber types in a single section. Here, we present a rapid, reliable and reproducible protocol for improved staining quality, allowing automatic acquisition of whole cross sections and automatic quantification of fiber populations with ImageJ. For this purpose, embedded skeletal muscles are cut in cross sections, stained using myosin heavy chains antibodies with secondary fluorescent antibodies and DAPI for cell nuclei staining. Whole cross sections are then scanned automatically using a slide scanner to obtain high-resolution composite pictures of the entire specimen. Fiber population analyses are subsequently performed to quantify slow, intermediate and fast fibers using an automated macro for ImageJ. We have previously shown that this method can identify fiber populations reliably to a degree of &#177;4%. In addition, this method reduces inter-user variability and time per analyses significantly using the open source platform ImageJ.

Here, we present a protocol for rapid muscle fiber analyses, which allows improved staining quality, and thereby automatic acquisition and quantification of fiber populations using the freely available software ImageJ.

Um Protocolo Automatizado Rápido para Muscle Fiber Análise População em músculo secções transversais Usando Cadeia miosina pesada Imunohistoquímica

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle ...

Single-Cell Resolution Three-Dimensional Imaging of Intact Organoids

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development and function as well as disease. Fluorescence microscopy has played a major role in characterizing their cellular composition in detail and demonstrating their similarity to the tissue they originate from. In this article, we present a comprehensive protocol for high-resolution 3D imaging of whole organoids upon immunofluorescent labeling. This method is widely applicable for imaging of organoids differing in origin, size and shape. Thus far we have applied the method to airway, colon, kidney, and liver organoids derived from healthy human tissue, as well as human breast tumor organoids and mouse mammary gland organoids. We use an optical clearing agent, FUnGI, which enables the acquisition of whole 3D organoids with the opportunity for single-cell quantification of markers. This three-day protocol from organoid harvesting to image analysis is optimized for 3D imaging using confocal microscopy.

The entire 3D structure and cellular content of organoids, as well as their phenotypic resemblance to the original tissue can be captured using the single-cell resolution 3D imaging protocol described here. This protocol can be applied to a wide range of organoids varying in origin, size and shape.

Resolução unicelular imagens tridimensionais de organoides intactos

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development ...