Name: analysis of beta-cell function using single-cell resolution calcium imaging in zebrafish islets
Uploaded: 2018-07-03T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets at JoVE.com

Agradecemos a membros do laboratório Ninov para comentários sobre o manuscrito, membros do centro para instalações de peixe e microscopia de Dresden de terapias regenerativas (poucos) para obter assistência técnica. N.N. é suportado pelo financiamento da DFG-poucos, Cluster de excelência no TU-Dresden, Fundação de pesquisa alemã (DFG) e o centro alemão para Diabetes pesquisa (DZD).

Todos os procedimentos, incluindo assuntos animais foram aprovados pelo acto de bem-estar Animal e com a permissão do Landesdirektion Sachsen, Alemanha (AZ 24 – 9168.11 / 1/2013 / 14, T12/2016).
1. preparação
Nota: Este protocolo é para ex vivo por imagens do zebrafish ilhéu primário de duplo Tg transgénicos (ins:nls-Renilla-mKO2; cryaa:CFP); TG (ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry) 19 zebrafish. Nesta linha de transgênicos, o promotor de insulina (ins) conduz a expressão específica de células beta de dois transgenes: nls-Renilla-mKO2, que marca o núcleo das células-beta com monomérico Kusabira laranja 2 (mKO2) fluorescência; e GCaMP6s15, que emite fluorescência verde em resposta ao aumento nos níveis de cálcio intracelular. A expressão de beta-pilha-específico de GCaMP6s permite estudar a glicose-capacidade de resposta das células-beta sem a interferência de alterações de cálcio em torno de tipos de células.
<ol><li>Preparar o estoque fresco fibrinogênio (10 mg/mL) dissolvendo-se 10 mg de fibrinogênio bovino em 1 mL de Ca2 +/ mg2 +-que contém a solução de sal balanceada de Hanks (HBSS) num tubo de centrífuga 1,5 mL. Vórtice vigorosamente até que o pó de fibrinogênio se dissolve completamente. Manter a solução em temperatura ambiente por mais pelo menos de 15 min. Nota: O estoque pode ser mantido em temperatura ambiente por 2 – 3 h.. descarte o estoque se a solução começa a polimerizar-se e torna-se viscoso.</li>
	<li>Prepare a solução de trabalho de fibrinogênio (3,3 mg/mL) diluindo o estoque de fibrinogênio HBSS em triplo. Por exemplo, misture 300 µ l de caldo de fibrinogênio em 600 µ l de HBSS preparar 900 µ l da solução de trabalho de fibrinogênio.</li>
	<li>Preparar a solução de trombina (10 U/mL) dissolvendo-se 10 unidades de trombina em 1 mL de HBSS ou fosfato tampão salino (PBS). Nota: Esta solução pode ser preparada com antecedência, aliquotada em 50 partes µ l e congelada a-20 ° C.</li>
	<li>Prepare 200 mM D-glucosa dissolvendo 1,8 g de D-glicose em 50 mL de água. Manter em 4 ° C para armazenamento a longo prazo.</li>
	<li>Prepare 300 mM solução KCl dissolvendo-se 1,1 g de KCl em 50 mL de água. Manter em 4 ° C para armazenamento a longo prazo.</li>
	<li>Adquirir 35mm pratos de vidro-fundo de diâmetro para a montagem dos ilhéus.</li>
	<li>Para dissecação e fixar o ilhéu, usar um microscópio estéreo equipado com lâmpada de fluorescência e cubo filtro vermelho (TRITC: excitação: 554 – 532 nm, emissão: 613 – 570 nm; ou Texas-vermelho: excitação: 540 – 580 nm, emissão: 592-667 nm).</li>
	<li>Para o influxo de cálcio em células-beta, uso um microscópio confocal invertido (Zeiss LSM 780 ou similar) com 20 X (0,8 NA) objetivo do ar e equipado com um suporte de placa para os pratos de vidro-fundo de diâmetro 35mm de imagem.</li>
	<li>Prepare uma solução de 200 mg/L de sulfonato de metano metanosulfonato (MS222) para eutanásia o zebrafish.</li>
	<li>Requisitar pratos de Petri de 90 mm para a dissecação do zebrafish.</li>
</ol>2. Zebrafish primária ilhéu dissecação e montagem
<ol><li>Eutanásia em um peixe usando incubação prolongada em MS222. Para isso, delicadamente Retire o peixe do aquário usando uma rede de pesca e incube-lo em uma placa de Petri contendo a solução MS222 até que o animal não mostra nenhum movimento de odontódios (brânquias); Normalmente, este leva 5 min. transferência o peixe para um prato de Petri contendo a solução HBSS com Ca2 +/ mg2 +.</li>
	<li>
Sob um microscópio estéreo equipado com uma lâmpada da fluorescência e cubo filtro vermelho, disse a pele que cobre o lado direito do abdômen do animal para isolar o pâncreas.
	<ol>
<li>Para isso, corte a pele do zebrafish da boca a nadadeira anal usando Pinças afiadas. Descascar a pele cortada para expor o abdome; Este recorte expõe os órgãos internos. Usando a fluorescência vermelha de mKO2 expressão em células-beta, verificar a localização dos ilhéus através de exame visual, sob o microscópio. Se necessário, remova os lóbulos do fígado, como eles poderiam cobrir o ilhéu, tornando difícil de encontrar. Nota: O Ilhéu primário está localizado perto da região anterior do abdômen, geralmente no lado direito.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Limpe o ilhéu primário removendo cuidadosamente o tecido circundante como fígado e adipócitos. Tomar precauções para não ferir ou picar o ilhéu; Depois de limpar o tecido circundante, as células individuais na superfície do Ilhéu tornam-se perceptíveis.</li>
	<li>Pipete uma gota de 30 µ l de HBSS no centro de um prato fundo de vidro. Transferi o ilhéu dissecado para essa queda.</li>
	<li>Lave cuidadosamente o ilhéu, uma vez com HBSS e uma vez com 30 µ l da solução de trabalho de fibrinogênio (3,3 mg/mL). Certifique-se de evitar a secagem do Ilhéu durante as etapas de lavagem, pois se assim resulta na morte celular.</li>
	<li>Lenta e suavemente, adicione 10 µ l da solução de trombina (10 U/mL). O ilhéu e o prato deixe intocado por 15 – 20 min, observar que a gota de fibrinogênio-trombina se torne viscoso e ligeiramente opaco neste momento.</li>
</ol>3. Ex Vivo ao vivo-imagem latente da intensidade de fluorescência GCaMP em ilhotas de Zebrafish primária
<ol><li>Adicionar 200 µ l de HBSS em cima do molde e coloque o prato com cuidado sobre o suporte da placa do microscópio confocal. Use um objectivo de ar X, at 0.8, 20 para a imagem latente confocal. Localize o ilhéu usando a opção brightfield.</li>
	<li>Usando o filtro para fluorescência vermelha para visualizar a fluorescência nuclear mKO2 em células-beta, o foco na ilhota. Núcleos individuais devem ser claramente visíveis.</li>
	<li>Localize um avião claro imagem alterando manualmente o plano focal do microscópio confocal a fim de mover-se através da espessura da ilhota ao longo de seu eixo z. Certifique-se de que o avião de imagem contém um número suficiente (50-100) de células-beta para a imagem latente, e o brilho da fluorescência nuclear mKO2 é uniforme, especialmente no centro da ilha.</li>
	<li>Configurar uma aquisição sequencial para GCaMP6s e mKO2 de fluorescência usando as seguintes configurações no "Menu Setup inteligente": GCaMP6s, excitação: 488 nm, emissão: 500 – 555 nm, falsa-cor: verde (selecione "GFP"); mKO2, excitação: 561 nm (mCherry), de emissão: 570 – 630 nm, falsa-cor: vermelho (selecione "mCherry"). Nota: Com esta configuração, o canal vermelho irá gravar a posição dos núcleos de células beta, enquanto o canal verde irá gravar a intensidade de fluorescência de GCaMP.</li>
	<li>No modo de"aquisição" definir a resolução da imagem a 1.024 x 1.024 pixels, a velocidade em 10 e em média em 1. Iniciar uma contínua gravação selecionando a opção para "Séries temporais", e definindo a "duração" para 500 ciclos, com tempo de aquisição de s aproximadamente 2 por quadro. Nota: Os primeiros 50 quadros do tempo-série correspondem a atividade das células-beta na concentração de glicose de 5 mM. Esta é a resposta de linha de base. Uma resposta beta-célula mostrará depilação e diminuindo a intensidade de fluorescência verde com o tempo. Temos observado que alguns (1 – 5%) das células-beta oscilar em glicose de 5 mM.</li>
	<li>
Fique de olho no ciclo de imagem. Após os primeiros 50 quadros, aumente a concentração de glicose da solução circundante de 10 mM sem parar a gravação.
	<ol>
<li>Sem distorçer a aquisição de imagens, gentilmente Pipete 5 µ l da solução de D-glicose em cima do gel segurando o ilhéu de 200 mM. Adquira 150 quadros na glicose 10 mM. Nota: O aumento da concentração de glicose aumentará o número de células-beta passando por GCaMP fluorescentes oscilações no canal verde.</li>
		<li>Certifique-se de que os núcleos das células permanecem estáveis durante o processo. Se o Ilhéu está tremendo extensivamente durante a aquisição e os núcleos estão se movendo fora do plano focal, descarte a amostra (se necessário).</li>
		<li>Espere um período suficiente para permitir a polimerização do molde de fibrinogênio-trombina para garantir a estabilidade das amostras subsequentes.</li>
	</ol>
</li>
	<li>A 200 quadros, aumente ainda mais a concentração da solução de 20mm suavemente pipetando 10 µ l de 200 milímetros solução de D-glicose. Adquira 150 quadros para a concentração de 20 mM.</li>
	<li>Após 350 quadros, despolarizar o ilhéu com 30 mM de KCl. Para isso, adicione 20 µ l da 300 mM solução KCl. Nesta fase, observe que as oscilações de fluorescência GCaMP6s irão parar e consertar em uma alta intensidade; células-beta que não respondeu a glicose também podem exibir um aumento na intensidade de fluorescência verde sobre adição de KCL.</li>
</ol>4. quantificação do traço de fluorescência GCaMP Beta-células individuais
Nota: Para localizar e quantificar as respostas das células-beta individuais para diferentes níveis de glicose, quantificar a intensidade de fluorescência GCaMP durante todo o período de imagem. Quantificação é realizada no celular resolução. Para isso, use FIJI20 para extrair os valores de intensidade de fluorescência GCaMP das imagens (etapas 4.1 – 4.6) e software de planilha ou R21 para realizar a análise (etapas 4.8 – 4,9).
<ol><li>Abra o arquivo de imagem em FIJI, usando a caixa de ferramentas"LSM". Para isso, selecione "Plugin | Caixa de ferramentas LSM | Mostre a caixa de ferramentas LSM". No "Toolbox LSM", clique em "Open LSM" e selecione o arquivo de imagem. Nota: Para formatos não suportados pelo LSM "Toolbox", convertê-los primeiro para tiff para análise.</li>
	<li>Extrair as respostas das células usando a ferramenta de região de interesse (ROI) em FIJI. Abra o "Gerenciador de ROI" no menu "Analisar" em "Ferramentas". Desenhe manualmente o ROI usando a ferramenta de seleção"polígono" localizada na barra de ferramentas.</li>
	<li>Desenhe o ROI no canal vermelho em que os núcleos de células beta são visíveis. Selecione o ROI tal que cobre uma área que é maior do que o núcleo da célula, a fim de incluir alguns do citoplasma da célula. Certifique-se de que a posição de ROI é consistente entre quadros e ajustar a posição, se necessário.</li>
	<li>Adicione o ROIs selecionado para o "Gerenciador de ROI", clicando no botão "Adicionar [t]". Selecionar e adicionar ROIs múltiplos para o ROI para a obtenção de dados em várias células.</li>
	<li>Em seguida, no menu "Analisar", selecione "Definir medidas". Selecione "Densidade integrada" para especificar a extração da intensidade de fluorescência total dentro da área.</li>
	<li>Mudar para o canal verde, contendo a fluorescência GCaMP e selecione "Multi medida" no "Gerenciador de ROI". Nota: Isto irá fornecer as medições de intensidade para as células em toda a série de tempo.</li>
	<li>No caso da posição de ROI precisa ser ajustada devido ao movimento de ilhota, compile manualmente as medições de intensidade em diferentes quadros. Copiar e colar os valores para uma planilha separada.</li>
	<li>Obter os carimbos de hora dos quadros da imagem da caixa de ferramentas"LSM". Uso "aplicar selos | Aplicar selos t | Nome do arquivo | Despejar a textfile"para obter os carimbos de hora. Salvar os carimbos de hora usando a opção "Salvar como", ou copiá-los para a planilha.</li>
	<li>Após compilar os valores de intensidade para todas as células, realize a análise uma célula de cada vez ou automaticamente (por exemplo, usando fórmulas do Excel ou R).</li>
	<li>
Analise as células individuais em duas etapas.
	<ol>
<li>Na primeira etapa, calcule a intensidade de fluorescência acima da linha de base. Para este fim, calcule a intensidade fluorescente de base (F0) como a média das intensidades de fluorescência para os primeiros 50 quadros (glicose de 5 mM). Subtrair a linha de base (F0) toda a série de tempo (F – F0). Nota: algumas células podem mostrar clara GCaMP oscilações sob glicose basal, que normalmente continuam após estimulação com concentrações mais elevadas. Para tais células, somente é possível estimar F0 , tendo a intensidade média dos quadros iniciais no qual as células mostraram uma gota em fluorescência.</li>
		<li>Na segunda etapa da análise, obter a intensidade de fluorescência GCaMP final normalizando a intensidade de fluorescência. Nota: Esta é realizada para remover as diferenças entre ilhotas de animais diferentes. Ilhéus individuais exibem diferentes níveis de emissão de fluorescência após estimulação de glicose.</li>
		<li>Normalize a intensidade da fluorescência, dividindo-o com o valor mais alto de intensidade. Para isso, calcular a intensidade de pico (Fmáx – F0) e dividir os valores basais subtraído pelo pico de intensidade para produzir a final GCaMP a intensidade de fluorescência (F – F0) / (Fmáx – F0).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Descarte as células que não apresentam uma alteração na intensidade após estimulação de KCl, como eles podem ser insalubre ou danificados.</li>
	<li>Para realizar a análise (medidas 4.9 – 4.10) em R, use o script de R (plotcelltrace. R) fornecido com este manuscrito.</li>
</ol>

<ol>
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Os autores declaram não concorrentes interesses financeiros.

Aqui vamos demonstrar uma técnica para a quantificação de células beta glicose capacidade de resposta na resolução de célula única. Isto é possibilitado pela concentração de cálcio intracelular, utilizando um indicador de cálcio geneticamente codificado, GCaMP6s de monitoramento. A atividade de células beta é capturado ex vivo montando o Ilhéu em um molde de fibrinogênio-trombina. Uma etapa crítica do protocolo é a estabilidade do molde. Tempo suficiente deve ser dada para o fibrinogênio dissolver na solução HBSS. Sem isso, o molde não polimerizar-se suficientemente para fornecer estabilidade durante a sessão de imagens. Um ilhéu montado no molde de fibrinogênio-trombina e imersos em meios de cultura celular pode permanecer viável pelo menos uma semana (dados não mostrados). Alternativas para o molde de fibrinogênio-trombina, como agarose de baixo ponto de fusão, podem ser utilizadas para montar o ilhéu22. Outro parâmetro crítico é a dissecção da ilhota. Durante esta etapa, o tecido circundante a ilhota precisa ser removido sem ferir ou picar o ilhéu. Uma dissecação hábil vem com prática.
Uma limitação do protocolo de imagem é a restrição a um avião confocal de ilhota. Isso é feito para capturar a dinâmica do influxo de cálcio dentro beta-células individuais. Um Z-pilha através de toda espessura da ilhota leva à baixa de imagem velocidades e perda de sinal oscilatório de células individuais. Esta limitação pode ser melhorada usando meios mais rápidos de confocal de imagem tais como a microscopia de disco giratório, para permitir a captura a dinâmica de cálcio em 3 dimensões. Outra fronteira seria na vivo cálcio imagem12. A natureza transparente do zebrafish embrião ou o uso de cepas de pigmento-menos de zebrafish adultos23 poderia abrir a possibilidade para na vivo de imagens no futuro.
A imagem da atividade de células beta em alta resolução espacial e temporal permite investigar a heterogeneidade funcional entre beta-células individuais. Esta abordagem pode ajudar a lançar luz sobre a existência de sub-populações de células beta. Recentemente, vários estudos têm demonstrado a existência de sub-populações em células-beta nominalmente homogênea24,25,26. Ex vivo de imagem pode ser combinada com repórteres genéticos para caracterizar da resposta do subpopulação de glicose. Além disso, combinando a configuração de imagem com estimulação farmacológica pode permitir para rastreio de compostos que poderiam melhorar a funcionalidade de células beta.
Em resumo, a técnica aqui apresentada permite a quantificação e comparação entre a capacidade de resposta de glicose para beta-células individuais. Ele fornece uma janela direta para funções de células beta, um parâmetro importante no desenvolvimento do diabetes.

Nossa glicose no sangue é mantida em uma estreita faixa, em grande parte devido a função do pâncreas endócrino. A função endócrina do pâncreas é executada por ilhotas de Langerhans, que contêm células secretoras de hormônio. As beta-células secretoras de insulina são responsáveis pela redução dos níveis de glicose sanguínea após uma refeição contendo carboidratos. A secreção de insulina inadequada de células beta pode resultar em diabetes1, que é caracterizada por glicemia alta sustentada. Tipo 1 e Diabetes tipo 2, que atualmente atinge mais de 400 milhões de pessoas no mundo, leva a morbidade e mortalidade2. Investigando os fatores moleculares e ambientais que contribuem para a disfunção da célula beta, entenderemos melhor como diabetes tipo 2 começa e progride. Além disso, a capacidade de diferenciar células estaminais humanas em células-beta funcional em vitro pode fornecer uma fonte de novas células-beta das terapias de reposição celular no Diabetes tipo 1. Para este fim, é importante estudar a função da célula beta e maturação em organismos-modelo genético a fim de obter o conhecimento necessário para fazer as células-beta funcionais em um prato.
Funcionalidade de células beta pode ser monitorada no nível de conjunto-ilhéu por quantificar a quantidade total de insulina secretada em resposta à glicose-estimulação. Esta abordagem cumulativa estuda o ilhéu como um único grupo de células sem diferenciação individual Propriedades da célula. No entanto, a análise das respostas de glicose de beta-células individuais revelou uma diversidade nas propriedades funcionais das células beta e a presença de heterogeneidade3. Para avaliar a função das células beta-individuais, é possível monitorar as alterações intracelulares que levam à secreção de insulina4. A secreção de insulina é precedida por uma entrada de glicose para as células-beta. A glicose que entra nas células-beta é rapidamente metabolizada a ATP. Altas concentrações de ATP intracelulares diminuem a probabilidade aberta de canais de íons de potássio sensíveis ao ATP levando a despolarização da célula beta. Despolarização abre os canais iônicos de cálcio voltagem-sensíveis e aumenta cálcio intracelular. Por sua vez, cálcio desencadeia a exocitose de insulina, que é liberada na circulação e reduz os níveis de glicose através da promoção da utilização de glicose5,6,7.
Várias estratégias foram aplicadas para investigar a função das células beta, incluindo monitoramento do potencial de membrana8, visualização directa de insulina-vesículas de exocitose9e quantificação de intracelular Ca2 + afluxo como um proxy para glicose-resposta10. Entre eles, imagem latente de intracelular Ca2 + fornece a vantagem da extrapolação da análise de várias células individuais dentro da mesma ilhéu11,12, permitindo a comparação direta da glicose-resposta entre beta-células individuais. Concentração de Ca2 + intracelular pode ser monitorada usando corantes fluorescentes sensíveis ao cálcio13 ou cálcio geneticamente codificado indicadores (GECIs)14. Considerando que o cálcio-indicador corantes falta especificidade de tipo de célula, GECIs pode ser expressa em um tipo específico de célula pelos promotores específicos. Além disso, a nova geração do GECIs, tais como GCaMP6, fornece a melhor relação sinal-ruído juntamente com mais rápido temporal dinâmica15. Aqui descrevemos o utilitário da novo-geração do GECIs, em particular GCaMP6s, Visualizar o cálcio em células-beta em resolução de célula única. Podemos aplicar esse método para o ilhéu primário zebrafish como nosso modelo de escolha. Durante o desenvolvimento embrionário, células-beta no Ilhéu do primário originam a dorsal e ventral do pâncreas botões16. A ilha principal está localizada em uma posição anatômica estereotipada dentro do pâncreas zebrafish, permitindo a sua fácil identificação e isolamento. Células-beta no Ilhéu do primário são necessárias para glicose-regulamento, conforme sua genética ablação leva à hiperglicemia17,18. Além disso, estas células-beta se tornar glicose responsivo durante o início do zebrafish desenvolvimento19. Este protocolo pode ser também aplicado a imagem latente as ilhotas secundárias, que se formam durante as fases pós-embrionárias. O protocolo permite a imagem beta-células ex vivo, em fases posteriores de desenvolvimento e sob as concentrações de glucose definidos.

<table><tbody><tr><td>Transgenic Zebrafish line: Tg(ins:nls-Renilla-mKO2; cryaa:CFP); Tg(ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry)</td><td></td><td></td><td>By request from authors</td></tr><tr><td>Stereo microscope</td><td>ZEISS</td><td>495015-0001-000</td><td>SteREO Discovery.V8</td></tr><tr><td>Fluorescence lamp</td><td>ZEISS</td><td>423013-9010-000</td><td>Illuminator HXP 120 V</td></tr><tr><td>Red Filter Cube</td><td>ZEISS</td><td>000000-1114-462&amp;nbsp;</td><td>Filter set 45 HQ TexasRed</td></tr><tr><td>Confocal Microscope</td><td>ZEISS</td><td>LSM 780</td><td></td></tr><tr><td>Bovine fibrinogen</td><td>Sigma</td><td>F8630</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (Hanks&#039; Balanced Salt solution)</td><td>ThermoFisher</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>Thrombin</td><td>Sigma</td><td>T4648</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>35 mm diameter glass-bottom dishes</td><td>ThermoFisher</td><td>150680</td><td></td></tr><tr><td>tricaine methane sulfonate</td><td>Sigma</td><td>E10521&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fine Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11445-12</td><td></td></tr><tr><td>FIJI, using ImageJ Version: 2.0.0-rc-43/1.50e</td><td></td><td></td><td>https://fiji.sc/</td></tr><tr><td>R, version 3.2.4</td><td></td><td></td><td>https://www.r-project.org/</td></tr><tr><td>RStudio</td><td></td><td></td><td>https://www.rstudio.com/</td></tr><tr><td>plotcelltrace.R</td><td></td><td></td><td>A custom script provided with the manuscript</td></tr></tbody></table>

analysis of beta-cell function using single-cell resolution calcium imaging in zebrafish islets

As células-beta do pâncreas respondem ao aumento das concentrações de glicose do sangue através da secreção da hormona insulina. A disfunção das células beta leva a hiperglicemia e consequências graves, com risco de vida. Compreensão de como as células-beta operam sob condições fisiológicas e que fatores genéticos e ambientais podem causar sua disfunção pode levar a melhores opções de tratamento para pacientes diabéticos. A capacidade de medir os níveis de cálcio em células-beta serve como um importante indicador da função de células beta, como o fluxo de liberação de insulina de gatilhos de íons de cálcio. Aqui descrevemos um protocolo para monitorar o influxo de cálcio glicose-estimulada em células-beta do zebrafish usando GCaMP6s, um sensor geneticamente codificado de cálcio. O método permite o monitoramento da dinâmica de cálcio intracelular com resolução de célula única em ex vivo montado ilhotas. A glicose-capacidade de resposta das células-beta dentro da mesma ilha pode ser capturado simultaneamente sob concentrações diferentes de glicose, que sugere a presença de heterogeneidade funcional entre as células-beta do zebrafish. Além disso, a técnica fornece a alta resolução temporal e espacial, que revela a natureza oscilatória o influxo de cálcio após estimulação de glicose. Nossa abordagem abre as portas para usar o zebrafish como um modelo para investigar a contribuição de fatores genéticos e ambientais para a função de células beta e disfunção.

Usando o protocolo descrito acima, foram analisadas as respostas de glicose das células-beta em um ilhéu de um zebrafish pós fertilização (dpf) de 45 dias. Para isso, a ilhota principal foi dissecada de um animal euthanized e montada no molde trombina fibrinogênio em um prato fundo de vidro. O ilhéu foi imerso em HBSS contendo glicose de 5 mM. A concentração de glicose foi aumentada de forma faseada de 10 mM e 20 mM. As respostas das células-beta para o aumento das concentrações de glicose foram gravadas. Finalmente, as células-beta foram despolarizadas usando 30 mM KCl (Figura 1). A despolarização usando KCl induz a entrada de cálcio nas células-beta saudáveis.
Usando a FIJI e um software de análise de dados, a intensidade de fluorescência GCaMP6s de beta-células individuais é extraída e normalizado (Figura 2). Como visto o rastreamento da intensidade de fluorescência, beta-células individuais exibem oscilações na GCaMP6s de fluorescência após estimulação de glicose, que para após estimulação de KCl. A técnica fornece uma resolução de celular de glicose-capacidade de resposta da célula beta- e uma janela em sua funcionalidade.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57851/57851fig1.jpg"> Figura 1: Ex vivo ao vivo-imagem latente do influxo de cálcio usando GCaMP6s em células-beta do zebrafish. Uma ilhota primária de Tg(ins:nls-Renilla-mKO2); TG(ins:GCaMP6s) zebrafish (45 dpf) foi montado no molde de fibrinogênio-trombina e incubada com glicose de 5 mM (basal). Células-beta foram rotuladas com um marcador vermelho nuclear, enquanto a fluorescência de GCaMP6s está presente no canal verde. O ilhéu foi estimulado com uma glicose-rampa consistindo de incubação sequencial com 10 mM e 20 mM D-glicose e despolarizada através da adição de 30 mM que KCl. setas marcam beta-células individuais, cuja actividade foi analisada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57851/57851fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57851/57851fig2.jpg"> Figura 2: normalizado GCaMP6s intensidade de fluorescência-traço beta-células individuais. Normalizado GCaMP6s fluorescência intensidade-rastreamento para as células-beta marcado com setas na Figura 1. O eixo x indica o tempo em segundos. No topo, barras mostram a concentração de glicose e de KCl no meio HBSS. O eixo y denota a intensidade de fluorescência normalizado durante a série de tempo. Por isso, intensidade da linha de base (F0) é calculada como a média intensidade durante incubação em glicose de 5 mM. Isto é subtraído os todo série de tempo dados (F - F0). A intensidade de linha de base é normalizada pela intensidade máxima exibida pela célula (F - F0) / (Fmáx- F0). O registo normalizado mostra uma resposta oscilatória das células beta à glicose, que estabiliza quando as células são despolarizadas com 30 mM KCl. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57851/57851fig2large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Funcionalidade de células beta é importante para a homeostase de glicose sanguínea, que é avaliada em célula única resolução usando um repórter geneticamente codificado para o influxo de cálcio.

Análise da função de células Beta utilizando imagens de cálcio de célula única resolução em ilhotas de Zebrafish

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to ...

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Research

JoVE Journal

Biology

14.7K visualizações.  TU Dresden. Funcionalidade de células beta é importante para a homeostase de glicose sanguínea, que é avaliada em célula única resolução usando um repórter geneticamente codificado para o influxo de cálcio.

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Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been described at the morphological level, little is known about the molecular basis of cellular changes that occur as the organism develops. With recent advancements in microfluidics and multiplexing technologies, it is now possible to characterize gene expression in single cells. This allows for investigation of heterogeneity between individual cells of specific cell populations to identify and classify cell subtypes, characterize intermediate states that occur during cell differentiation, and explore differential cellular responses to stimuli. This study describes a protocol to isolate viable, single cells from zebrafish embryos for high throughput multiplexing assays. This method may be rapidly applied to any zebrafish embryonic cell type with fluorescent markers. An extension of this method may also be used in combination with high throughput sequencing technologies to fully characterize the transcriptome of single cells. As proof of principle, the relative abundance of cardiac differentiation markers was assessed in isolated, single cells derived from nkx2.5 positive cardiac progenitors. By evaluation of gene expression at the single cell level and at a single time point, the data support a model in which cardiac progenitors coexist with differentiating progeny. The method and work flow described here is broadly applicable to the zebrafish research community, requiring only a labeled transgenic fish line and access to microfluidics technologies.

This protocol describes a method for isolating single cells from zebrafish embryos, enriching for cells of interest, capturing zebrafish cells in microfluidic based single cell multiplex systems, and assessing gene expression from single cells.

Isolamento e caracterização de células individuais de embriões Zebrafish

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Biologia do Desenvolvimento

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

Vivem de imagem do cérebro Zebrafish embrionárias por microscopia confocal

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Biologia

Simultaneous Calcium Imaging and Glucose Stimulation in Living Zebrafish to Investigate In Vivo &#946;-Cell Function

The pancreatic &#946;-cells sustain systemic glucose homeostasis by producing and secreting insulin according to the blood glucose levels. Defects in &#946;-cell function are associated with hyperglycemia that can lead to diabetes. During the process of insulin secretion, &#946;-cells experience an influx of Ca2+. Thus, imaging the glucose-stimulated Ca2+ influx using genetically encoded calcium indicators (GECIs) provides an avenue to studying &#946;-cell function. Previously, studies showed that isolated zebrafish islets expressing GCaMP6s exhibit significant Ca2+ activity upon stimulation with defined glucose concentrations. However, it is paramount to study how &#946;-cells respond to glucose not in isolation, but in their native environment, where they are systemically connected, vascularized, and densely innervated. To this end, the study leveraged the optical transparency of the zebrafish larvae at early stages of development to illuminate &#946;-cell activity in vivo. Here, a detailed protocol for Ca2+ imaging and glucose stimulation to investigate &#946;-cell function in vivo is presented. This technique allows to monitor the coordinated Ca2+ dynamics in &#946;-cells with single-cell resolution. Additionally, this method can be applied to work with any injectable solution such as small molecules or peptides. Altogether, the protocol illustrates the potential of the zebrafish model to investigate islet coordination in vivo and to characterize how environmental and genetic components might affect &#946;-cell function.

Here, the study presents a protocol for calcium imaging and glucose stimulation of the pancreatic &#946;-cells of the zebrafish in vivo.

The pancreatic &#946;-cells sustain systemic glucose homeostasis by producing and secreting insulin according to the blood glucose levels. Defects in ...

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory stimuli that mechanically deflect apical protrusions called hair bundles. Deflection opens mechanotransduction (MET) channels in hair bundles, leading to an influx of cations, including calcium. This cation influx depolarizes the cell and opens voltage-gated calcium channels located basally at the hair-cell presynapse. In mammals, hair cells are encased in bone, and it is challenging to functionally assess these activities in vivo. In contrast, larval zebrafish are transparent and possess an externally located lateral-line organ that contains hair cells. These hair cells are functionally and structurally similar to mammalian hair cells and can be functionally assessed in vivo. This article outlines a technique that utilizes a genetically encoded calcium indicator (GECI), GCaMP6s, to measure stimulus-evoked calcium signals in zebrafish lateral-line hair cells. GCaMP6s can be used, along with confocal imaging, to measure in vivo calcium signals at the apex and base of lateral-line hair cells. These signals provide a real-time, quantifiable readout of both mechanosensation- and presynapse-dependent calcium activities within these hair cells. These calcium signals also provide important functional information regarding how hair cells detect and transmit sensory stimuli. Overall, this technique generates useful data about relative changes in calcium activity in vivo. It is less well-suited for quantification of the absolute magnitude of calcium changes. This in vivo technique is sensitive to motion artifacts. A reasonable amount of practice and skill are required for proper positioning, immobilization, and stimulation of larvae. Ultimately, when properly executed, the protocol outlined in this article provides a powerful way to collect valuable information about the activity of hair-cells in their natural, fully integrated states within a live animal.

The zebrafish is a model system that has many valuable features including optical clarity, rapid external development, and, of particular importance to the field of hearing and balance, externally located sensory hair cells. This article outlines how transgenic zebrafish can be used to assay both hair-cell mechanosensation and presynaptic function in toto.

Na imagem latente de cálcio Vivo de células de cabelo linha Lateral no Zebrafish Larval

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory ...

Neurociência

In vivo Imagens de todo o cérebro de larvas de peixe-zebra

In Vivo Whole-Brain Imaging of Zebrafish Larvae Using Three-Dimensional Fluorescence Microscopy

As a vertebrate model animal, larval zebrafish are widely used in neuroscience and provide a unique opportunity to monitor whole-brain activity at the cellular resolution. Here, we provide an optimized protocol for performing whole-brain imaging of larval zebrafish using three-dimensional fluorescence microscopy, including sample preparation and immobilization, sample embedding, image acquisition, and visualization after imaging. The current protocol enables in vivo imaging of the structure and neuronal activity of a larval zebrafish brain at a cellular resolution for over 1 h using confocal microscopy and custom-designed fluorescence microscopy. The critical steps in the protocol are also discussed, including sample mounting and positioning, preventing bubble formation and dust in the agarose gel, and avoiding motion in images caused by incomplete solidification of the agarose gel and paralyzation of the fish. The protocol has been validated and confirmed in multiple settings. This protocol can be easily adapted for imaging other organs of a larval zebrafish.

Autor em destaque: Imagem in vivo de larvas de peixe-zebra usando microscopia de fluorescência tridimensional  

Presented here is a protocol for in vivo whole-brain imaging of larval zebrafish using three-dimensional fluorescence microscopy. The experimental procedure includes sample preparation, image acquisition, and visualization.

In vivo Imagem do cérebro inteiro de larvas de peixe-zebra usando microscopia de fluorescência tridimensional

As a vertebrate model animal, larval zebrafish are widely used in neuroscience and provide a unique opportunity to monitor whole-brain activity at the ...

Rastreamento de Comportamento e Padrão de Atividade Neural no Prosencéfalo do Peixe-Zebra

Two-Photon Calcium Imaging of Forebrain Activity in Behaving Adult Zebrafish

Adult zebrafish (Danio rerio) exhibit a rich repertoire of behaviors for studying cognitive functions. They also have a miniature brain that can be used for measuring activities across brain regions through optical imaging methods. However, reports on the recording of brain activity in behaving adult zebrafish have been scarce. The present study describes procedures to perform two-photon calcium imaging in the dorsal forebrain of adult zebrafish. We focus on steps to restrain adult zebrafish from moving their heads, which provides stability that enables laser scanning imaging of the brain activity. The head-restrained animals can freely move their body parts and breathe without aids. The procedure aims to shorten the time of head restraint surgery, minimize brain motion, and maximize the number of neurons recorded. A setup for presenting an immersive visual environment during calcium imaging is also described here, which can be used to study neural correlates underlying visually triggered behaviors.

Autor em destaque: Avanços na pesquisa do cérebro do peixe-zebra adulto 

Here, we present a protocol to perform two-photon calcium imaging in the dorsal forebrain of adult zebrafish.

Imagem de cálcio de dois fótons da atividade do prosencéfalo em peixes-zebra adultos com comportamento

Adult zebrafish (Danio rerio) exhibit a rich repertoire of behaviors for studying cognitive functions. They also have a miniature brain that can be used ...

Análise da função de células Beta utilizando imagens de cálcio de célula única resolução em ilhotas de Zebrafish

Resumo

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Simultaneous Calcium Imaging and Glucose Stimulation in Living Zebrafish to Investigate In Vivo β-Cell Function

Na imagem latente de cálcio Vivo de células de cabelo linha Lateral no Zebrafish Larval

In vivo Imagem do cérebro inteiro de larvas de peixe-zebra usando microscopia de fluorescência tridimensional

In vivo Imagem do cérebro inteiro de larvas de peixe-zebra usando microscopia de fluorescência tridimensional

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Imagem de cálcio de dois fótons da atividade do prosencéfalo em peixes-zebra adultos com comportamento

Imagem de cálcio de dois fótons da atividade do prosencéfalo em peixes-zebra adultos com comportamento

Imagem de cálcio de dois fótons da atividade do prosencéfalo em peixes-zebra adultos com comportamento