Agradecemos a miembros del laboratorio Ninov para comentarios sobre el manuscrito, los miembros del centro de Dresde de terapias regenerativas (CRTD) pescado y microscopía para asistencia técnica. N.N. es apoyado por fondos de la DFG-CRTD, racimo de la excelencia en TU Dresden, Fundación de investigación alemana (DFG) y del centro alemán de investigación de la Diabetes (DZD).

Todos los procedimientos incluyendo temas animal han sido aprobados por la ley de Bienestar Animal y con el permiso de la Landesdirektion Sachsen, Alemania (AZ 24-9168.11-1/2013-14, T12/2016).
1. preparación
Nota: Este protocolo es para ex vivo la proyección de imagen de pez cebra islote principal doble transgénicos TG (ins:nls-Renilla-mKO2; cryaa:CFP); TG (ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry) 19 de pez cebra. En esta línea transgénica, el promotor de la insulina (ins) unidades de expresión específica de células beta de los dos transgenes: nls-Renilla-mKO2, que marca el núcleo de las células beta con monomérica Kusabira naranja 2 (mKO2) fluorescencia; y GCaMP6s15, que emite fluorescencia verde en respuesta al aumento en los niveles de calcio intracelular. La expresión específica de la célula beta de GCaMP6s permite estudiar la capacidad de respuesta de la glucosa de las células beta sin interferencia de los cambios del calcio en los alrededores de tipos celulares.
<ol><li>Preparar caldo fresco de fibrinógeno (10 mg/mL) disolviendo 10 mg de fibrinógeno bovino en 1 mL de Ca2 +/Mg2 +-que contiene solución de sal equilibrada de Hanks (HBSS) en un tubo de centrífuga de 1.5 mL. Vortex vigorosamente hasta que el polvo de fibrinógeno se disuelva completamente. Mantener la solución a temperatura ambiente durante al menos 15 minutos más. Nota: La población puede conservarse a temperatura ambiente durante 2-3 h. descarte la acción si la solución comienza a polimerizar y se vuelve viscosa.</li>
	<li>Preparar la solución de trabajo de fibrinógeno (3,3 mg/mL) diluir la acción del fibrinógeno triple en HBSS. Por ejemplo, mezclar 300 μL del stock de fibrinógeno en 600 μl de HBSS para preparar 900 μl de solución de trabajo de fibrinógeno.</li>
	<li>Preparar solución de trombina (10 U/mL) disolviendo 10 unidades de trombina en 1 mL de HBSS o fosfato tampón salino (PBS). Nota: Esta solución puede ser preparada de antemano, alícuotas en 50 partes de μl y congelada a-20 ° C.</li>
	<li>Preparar 200 mM solución de D-glucosa mediante la disolución de 1,8 g de D-glucosa en 50 mL de agua. Mantenga en 4 ° C para almacenamiento a largo plazo.</li>
	<li>Para preparar 300 mM solución de KCl, disolver 1,1 g de KCl en 50 mL de agua. Mantenga en 4 ° C para almacenamiento a largo plazo.</li>
	<li>Adquirir 35 mm platos de fondo de cristal de diámetro para el montaje de los islotes.</li>
	<li>Para la disección y montaje del islote, usar un microscopio estéreo equipado con lámpara de fluorescencia y filtro rojo cubo (TRITC: excitación: 532 – 554 nm, emisión: 613 – 570 nm; o Texas-rojo: excitación: 540-580 nm, emisión: 592 – 667 nm).</li>
	<li>Para la proyección de imagen la afluencia del calcio en las células beta, uso un microscopio confocal invertido (Zeiss LSM 780 o similar) con 20 X (0.8 NA) objetivo de aire y equipada con un soporte de placa para los platos de fondo de cristal de 35 mm de diámetro.</li>
	<li>Preparar una solución de 200 mg/L de Metanosulfonato sulfonato de metano (MS222) para euthanizing el pez cebra.</li>
	<li>Adquirir platos de Petri de 90 mm para la disección del pez cebra.</li>
</ol>2. pez cebra primaria islote disección y montaje
<ol><li>Eutanasia a un pez con incubación prolongada en MS222. Para esto, suavemente quitar los peces de la pecera con una red de pesca e incubar en una placa Petri que contiene la solución MS222 hasta que el animal no muestre ningún movimiento opercular (branquias); Normalmente, esto toma 5 minutos de traslado de los peces a una placa Petri que contiene la solución HBSS con Ca2 +/Mg2 +.</li>
	<li>
Microscopio estéreo equipado con una lámpara de fluorescencia y filtro rojo cubo, disecar la piel que cubre el lado derecho del abdomen del animal para aislar el páncreas.
	<ol>
<li>Para ello, cortar la piel del pez cebra de boca a la aleta anal con unas pinzas afiladas. Retire la piel cortada para exponer el abdomen; Este recortes expone los órganos internos. Mediante el uso de la fluorescencia roja de mKO2 expresión en las células beta, determinar la localización de los islotes por examen visual bajo el microscopio. Si es necesario, retire los lóbulos del hígado, como podría cubrir el islote, lo que es difícil de encontrar. Nota: El islote principal está situado cerca de la región anterior del abdomen, generalmente en el lado derecho.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Limpie el islote principal retirando cuidadosamente tejido circundante como hígado y adipocitos. Tomar la precaución de no dañar o meter el islote; después de la limpieza de los tejidos circundantes, las células individuales en la superficie del islote ser discernibles.</li>
	<li>Tomar con pipeta una gota de 30 μl de HBSS en el centro de un plato de fondo de cristal. Transferir el islote disecado a esta caída.</li>
	<li>Lave cuidadosamente el islote una vez con HBSS y una vez con 30 μl de la solución de trabajo de fibrinógeno (3,3 mg/mL). Asegúrese de evitar que se sequen del islote durante los pasos de lavado, porque hacerlo así resulta en la muerte celular.</li>
	<li>Despacio y con cuidado añadir 10 μl de la solución de trombina (10 U/mL). Dejar el islote y el plato sin tocar durante 15 – 20 minutos observa que la caída del fibrinógeno trombina será ligeramente opaco y viscoso en este punto.</li>
</ol>3. Ex Vivo vivo-proyección de imagen de GCaMP intensidad de fluorescencia en islotes de pez cebra primaria
<ol><li>Añadir 200 μL de HBSS, en la parte superior del molde y coloque con cuidado el plato en el sostenedor de la placa del microscopio confocal. Usar objetivo 20 X, 0.8 NA, aire para la proyección de imagen confocal. Localice el islote con la opción de brightfield.</li>
	<li>Utilizando el filtro de la fluorescencia roja para ver la fluorescencia mKO2 nuclear de las células beta, se centran en el islote. Núcleos individuales deben ser claramente visibles.</li>
	<li>Ubicar un plano de proyección de imagen claro cambiando manualmente el plano focal del microscopio confocal para moverse a través del espesor de la isla a lo largo de su eje z. Asegúrese de que el plano de proyección de imagen contiene un número suficiente (50-100) de las células beta para la proyección de imagen y el brillo de la fluorescencia nuclear mKO2 es uniforme, especialmente en el centro del islote.</li>
	<li>Configurar una adquisición secuencial para GCaMP6s y mKO2 fluorescencia con la siguiente configuración en el "menú inteligente": GCaMP6s, excitación: 488 nm, emisión: 500 – 555 nm, falso-color: verde (seleccione "GFP"); mKO2, excitación: 561 nm (mCherry), emisión: 570-630 nm, falso-color: rojo (seleccione "mCherry"). Nota: Con esta configuración, el canal rojo registra la posición de los núcleos de la célula beta, mientras que el canal verde será registrar la intensidad de la fluorescencia GCaMP.</li>
	<li>En el "modo de adquisición" configure la resolución de la imagen a 1.024 x 1.024 píxeles, la velocidad en 10 y un promedio de 1. Iniciar una continua grabación seleccionando la opción para "Series de tiempo", y ajuste de la "duración" para los 500 ciclos, con tiempo de la adquisición de aproximadamente 2 s cada fotograma. Nota: Los primeros 50 marcos de la serie de tiempo corresponden a la actividad de las células beta en la concentración de glucosa de 5 mM. Esta es la respuesta de la línea de base. Una célula beta respuesta mostrará encerando y disminuyendo la intensidad de la fluorescencia verde con el tiempo. Hemos observado que algunos (1 – 5%) de las células beta oscilan en 5 mM de glucosa.</li>
	<li>
Mantener un ojo en el ciclo de proyección de imagen. Después de los primeros 50 marcos, aumentar la concentración de glucosa de la solución circundante a 10 mM, sin detener la grabación.
	<ol>
<li>Sin perturbar la adquisición de la imagen, pipetee suavemente 5 μl de la solución de D-glucosa sobre el gel con el islote de 200 mM. Adquirir 150 fotogramas a 10 mM de glucosa. Nota: El aumento de la concentración de glucosa aumentará el número de las células beta que experimentan oscilaciones fluorescentes GCaMP en el canal verde.</li>
		<li>Asegúrese de que los núcleos de las células permanecen estables durante el proceso. Si el islote está sacudiendo extensivamente durante la adquisición y los núcleos se mueven fuera del plano focal, deseche la muestra (si es necesario).</li>
		<li>Esperar un período suficiente de tiempo para permitir la polimerización del molde trombina fibrinógeno con el fin de asegurar la estabilidad de las muestras subsecuentes.</li>
	</ol>
</li>
	<li>En 200 marcos, aumentar aún más la concentración de la solución a 20 mM por suavemente Pipetear 10 μl de la solución de D-glucosa de 200 mM. Adquisición de 150 marcos para la concentración de 20 mM.</li>
	<li>Después de 350 cuadros, despolarizar el islote con 30 mM de KCl. Para ello, añadir 20 μl de la solución madre de KCl de 300 mM. En esta etapa, se observa que las oscilaciones de la fluorescencia GCaMP6s parará y arreglar a una alta intensidad; las células beta que no respondieron a la glucosa también pueden mostrar un aumento en la intensidad de la fluorescencia verde con adición de KCL.</li>
</ol>4. cuantificación de GCaMP fluorescencia traza para cada de las células Beta
Nota: Para localizar y cuantificar las respuestas de células beta individuales a diferentes niveles de la glucosa, cuantificar la intensidad de fluorescencia de GCaMP durante todo el período de proyección de imagen. La cuantificación se realiza en celulares de resolución. Para ello, usar FIJI20 para extraer los valores de intensidad de fluorescencia de GCaMP de las imágenes (pasos 4.1-4.6) y software de hoja de cálculo o R21 para llevar a cabo análisis (pasos 4.8-4.9).
<ol><li>Abra el archivo de imagen en FIJI utilizando la "caja de herramientas de LSM". Para ello, seleccione "Plugin | LSM Toolbox | Mostrar herramientas LSM". En la "LSM caja de herramientas", haz clic en "Open LSM" y seleccione el archivo de imagen. Nota: Para formatos no soportados por la "caja de herramientas de LSM", convertirlos primero a tiff para el análisis.</li>
	<li>Extracto de las respuestas de las células mediante la herramienta de región de interés (ROI) en FIJI. Abra el "Administrador de retorno de la inversión" en el menú "Analizar" en "Herramientas". Dibujar manualmente el ROI con la "herramienta de selección de polígono" situada en la barra de herramientas.</li>
	<li>Dibujar el retorno de la inversión en el canal rojo en el que los núcleos de la célula beta son accesibles. Seleccione el ROI que cubre un área que es más grande que el núcleo de la célula con el fin de incluir algunas de citoplasma de la célula. Asegurarse de que la posición de retorno de la inversión es constante entre marcos y ajuste la posición si es necesario.</li>
	<li>Añadir el ROIs seleccionados al "Administrador de ROI" haciendo clic en el botón "Agregar [t]". Seleccione y agregue ROIs múltiples para el retorno de la inversión para la obtención de datos en varias celdas.</li>
	<li>A continuación, en el menú "Analizar", seleccione "Establecer medidas". Seleccione "Densidad integrada" para especificar la extracción de la intensidad de fluorescencia total dentro del área.</li>
	<li>Cambio al canal verde que contiene la fluorescencia GCaMP y seleccione "Multi medida" en el "Administrador de ROI". Nota: Esto le dará las mediciones de intensidad de las células a lo largo de la serie de tiempo.</li>
	<li>En el caso de la posición de retorno de la inversión necesita ser ajustado debido al movimiento del islote, compilar manualmente las medidas de intensidad en diferentes marcos. Copiar y pegar los valores a una hoja de cálculo separada.</li>
	<li>Obtener las marcas de hora de los marcos de imagen de"LSM". Uso "aplicar sellos | Aplique sellos t | Nombre de archivo | Volcado a archivo de texto"para obtener las marcas de hora. Guardar las marcas de tiempo utilizando la opción "Guardar como" o copiar en la hoja de cálculo.</li>
	<li>A recopilación de los valores de intensidad para todas las células, realizar el análisis una célula en un momento o automáticamente (por ejemplo, usando fórmulas de Excel o R).</li>
	<li>
Análisis de células individuales en dos pasos.
	<ol>
<li>En el primer paso, calcular la intensidad de fluorescencia por encima de la línea de base. Para ello, calcular la intensidad de línea de base fluorescente (F0) como el promedio de las intensidades de fluorescencia para los primeros 50 marcos (glucosa 5 mM). Luego restar toda la serie de tiempo la línea de base (F0) (F – F0). Nota: algunas células pueden mostrar claro GCaMP las oscilaciones bajo glucosa basal, que suele seguir estimulación con concentraciones más altas. Para tales células, sólo es posible estimar F0 tomando la intensidad media de los fotogramas iniciales en el que las células mostraron una caída en fluorescencia.</li>
		<li>En el segundo paso del análisis, obtener la intensidad de fluorescencia de GCaMP final la normalización de la intensidad de fluorescencia. Nota: Esto se realiza para eliminar las diferencias entre islotes de diferentes animales. Islotes individuales muestran diferentes niveles de emisión de fluorescencia sobre el estímulo de glucosa.</li>
		<li>Normalizar la intensidad de fluorescencia dividiendo con el valor más alto de intensidad. Para ello, calcular la intensidad máxima (Fmax F0) y dividir los valores de referencia restado intensidad máxima a la intensidad de fluorescencia de GCaMP final (F-F0) / (Fmax F0).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Deseche las células que no presentan un cambio en intensidad Tras estimulación de KCl, que sean insalubres o dañadas.</li>
	<li>Para realizar el análisis (pasos 4.9-4.10) en R, use el script de R (plotcelltrace. R) proporcionado con este manuscrito.</li>
</ol>

<ol>
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Los autores no declaran a intereses financieros en competencia.

Aquí se demuestra una técnica para la cuantificación de la capacidad de respuesta de glucosa células beta en resolución unicelular. Esto es posible mediante el control de la concentración de calcio intracelular mediante un indicador de calcio codificado genéticamente, GCaMP6s. La actividad de la célula beta es capturado ex vivo montando el islote en un molde de trombina fibrinógeno. Un paso fundamental del protocolo es la estabilidad del molde. Tiempo suficiente se debe prestar para que el fibrinógeno disolver en la solución HBSS. Sin esto, el molde no polimerizar suficientemente para proporcionar estabilidad durante la sesión de imágenes. Un islote montadas en molde de trombina fibrinógeno e inmersos en medios de cultivo celular puede permanecer viable durante por lo menos una semana (datos no mostrados). Alternativas para el molde del fibrinógeno trombina, como la agarosa de la bajo-derretir, pueden ser utilizadas para montar el islote22. Otro parámetro importante es la disección del islote. Durante este paso, el tejido que rodea el islote debe removerse sin dañar o meter el islote. Una hábil disección viene con la práctica.
Una limitación del Protocolo de imagen es la restricción a un solo plano confocal del islote. Esto se hace para capturar la dinámica de la afluencia del calcio dentro de las individuales de células beta. Una pila de Z a través de todo el espesor de la isla conduce a bajas velocidades de imagen y la pérdida de señal oscilatoria de células individuales. Esta limitación podría mejorarse mediante el uso de medios más rápidos-proyección de imagen confocal como microscopía de disco giratorio, para capturar la dinámica del calcio en 3 dimensiones. Otra frontera sería en vivo calcio imagen12. La naturaleza transparente del embrión de pez cebra o el uso de cepas menos pigmento de pez cebra adultos23 podría abrir la posibilidad de que en vivo la proyección de imagen en el futuro.
La proyección de imagen de la actividad de células beta en la alta resolución espacial y temporal permite para investigar la heterogeneidad funcional entre individuales de las células beta. Este enfoque puede ayudar a arrojar luz sobre la existencia de subpoblaciones de células beta. Recientemente, varios estudios han demostrado la existencia de subpoblaciones en la nominalmente homogénea de las células beta24,25,26. Ex vivo la proyección de imagen puede combinarse con reporteros genéticas para la caracterización de la respuesta de la sub-población a la glucosa. Además, la combinación de la configuración de imagen con estimulación farmacológica permite para la detección de compuestos que podrían mejorar la funcionalidad de la célula beta.
En Resumen, la técnica presentada aquí permite la cuantificación y la comparación de la capacidad de respuesta de glucosa para cada de las células beta. Proporciona una ventana directa a la funcionalidad de la célula beta, un parámetro importante en el desarrollo de la diabetes.

Nuestra glucosa en sangre se mantiene en un margen estrecho, en gran parte debido a la función del páncreas endocrino. La función endocrina del páncreas se realiza por los islotes de Langerhans, que contienen células secretoras de hormonas. Las células beta secretoras de insulina están responsables de reducir los niveles de glucosa en sangre después de una comida que contiene hidratos de carbono. Secreción inadecuada de insulina de células beta puede resultar en diabetes1, que se caracteriza por glucemia alta sostenida. Tipo 1 y tipo 2 Diabetes, que actualmente afecta a más de 400 millones de personas en todo el mundo, conduce a la morbilidad y la mortalidad2. Investigando los factores moleculares y ambientales que contribuyen a la disfunción de células beta, entenderemos mejor cómo diabetes tipo 2 se inicia y progresa. Además, la capacidad de diferenciar células madre humanas en células beta funcionales en vitro puede proporcionar una fuente de nuevas células beta para terapias de reemplazo celular en la Diabetes de tipo 1. Para ello, es importante estudiar la función de células beta y la maduración en organismos modelo genética con el fin de adquirir los conocimientos necesarios para hacer funcional de las células beta en un plato.
Funcionalidad de la célula beta puede controlarse en el plano de conjunto-islote mediante la cuantificación de la cantidad total de insulina secretada en respuesta al estímulo de glucosa. Este enfoque acumulativo estudia el islote como un único grupo de células sin diferenciar propiedades individuales de la célula. Sin embargo, el análisis de las respuestas de glucosa de células beta individuales reveló una diversidad en las propiedades funcionales de las células beta y la presencia de heterogeneidad3. Para evaluar la función de individual de las células beta, es posible monitorizar los cambios intracelulares que conducen a la secreción de insulina4. La secreción de insulina es precedida por una entrada de la glucosa en las células beta. La glucosa que entra en las células beta se metaboliza rápidamente a ATP. Altas concentraciones de ATP intracelulares disminuyen la probabilidad abierta de los canales de ion de potasio ATP-sensibles a la despolarización de la célula beta. Despolarización abre los canales de iones de calcio sensibles al voltaje y aumenta el calcio intracelular. A su vez, calcio desencadena la exocitosis de la insulina, que se libera en la circulación y reduce los niveles de glucosa promoviendo la utilización de la glucosa5,6,7.
Varias estrategias se han aplicado para investigar la función de las células beta, incluyendo el monitoreo del potencial de la membrana8, la visualización directa de la insulina-vesículas exocitosis9y cuantificación de Ca intracelular2 + afluencia como un proxy para glucosa respuesta10. Entre ellos, la proyección de imagen de Ca intracelular2 + proporciona la ventaja de la ampliación del análisis a varias células individuales en el mismo islote11,12, lo que permite la comparación directa de la capacidad de respuesta de glucosa entre individuales-las células beta. Concentración de Ca2 + intracelular puede controlarse usando colorantes fluorescentes sensibles a calcio13 o calcio genéticamente codificado indicadores (GECIs)14. Mientras que la especificidad de tipo de la célula falta calcio indicador tintes, GECIs puede expresarse en un tipo de célula específica por promotores específicos. Además, la nueva generación de GECIs, como GCaMP6, proporciona mejor relación de señal a ruido junto con el más rápido de la dinámica temporal15. Aquí describimos la utilidad de la nueva generación de GECIs, en particular GCaMP6s, para visualizar calcio en las células beta en resolución unicelular. Aplicamos este método al islote principal del pez cebra como modelo de elección. Durante el desarrollo embrionario, las células beta en el islote principal originan la dorsal y ventral páncreas yemas16. El islote principal está situado en una posición anatómica estereotipada en el páncreas de pez cebra, lo que permite su fácil identificación y el aislamiento. Las células beta en el islote principal son necesarias para la regulación de la glucosa, como la ablación genética conduce a hiperglucemia17,18. Además, estas células beta se convierten en glucosa responden durante temprano pez cebra desarrollo19. Este protocolo puede aplicarse también a la proyección de imagen los islotes secundarios, que forman durante las etapas post-embrionarias. El protocolo permite imagen beta de células ex vivo, en etapas posteriores de desarrollo y en las concentraciones de glucosa definida.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1034">
	<tbody>
		<tr height="79">
			<td height="79" style="height:79px;width:276px;">Transgenic Zebrafish line: Tg(ins:nls-Renilla-mKO2; cryaa:CFP); Tg(ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry)</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:291px;">By request from authors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:276px;">Stereo microscope</td>
			<td style="width:123px;">ZEISS</td>
			<td style="width:344px;">495015-0001-000</td>
			<td style="width:291px;">SteREO Discovery.V8</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:276px;">Fluorescence lamp</td>
			<td style="width:123px;">ZEISS</td>
			<td style="width:344px;">423013-9010-000</td>
			<td style="width:291px;">Illuminator HXP 120 V</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:276px;">Red Filter Cube</td>
			<td style="width:123px;">ZEISS</td>
			<td style="width:344px;">000000-1114-462&#160;</td>
			<td style="width:291px;">Filter set 45 HQ TexasRed</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:276px;">Confocal Microscope</td>
			<td style="width:123px;">ZEISS</td>
			<td style="width:344px;">LSM 780</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bovine fibrinogen</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td>F8630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HBSS (Hanks&#39; Balanced Salt solution)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Thrombin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">D-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">35 mm diameter glass-bottom dishes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>150680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">tricaine methane sulfonate</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;">E10521&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:276px;">Fine Forceps</td>
			<td style="width:123px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:344px;">11445-12</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:276px;">FIJI, using ImageJ Version: 2.0.0-rc-43/1.50e</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:291px;">https://fiji.sc/</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:276px;">R, version 3.2.4</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:291px;">https://www.r-project.org/</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:276px;">RStudio</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:291px;">https://www.rstudio.com/</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:276px;">plotcelltrace.R</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:291px;">A custom script provided with the manuscript</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of beta-cell function using single-cell resolution calcium imaging in zebrafish islets

Las células beta pancreáticas responden al aumentar las concentraciones de glucosa de la sangre secretando la hormona insulina. La disfunción de las células beta conduce a hiperglucemia y consecuencias graves, potencialmente mortales. Entender cómo las células beta funcionan bajo condiciones fisiológicas y qué factores genéticos y ambientales podrían causar su disfunción podría conducir a mejores opciones de tratamiento para los pacientes diabéticos. La capacidad de medir niveles de calcio en las células beta es un indicador importante de la función de células beta, como la afluencia de calcio iones desencadena la liberación de insulina. Aquí se describe un protocolo para el monitoreo de la afluencia del calcio estimulada por la glucosa en las células beta pez cebra utilizando GCaMP6s, un sensor genéticamente codificado de calcio. El método permite el control de la dinámica del calcio intracelular con resolución unicelular en islotes ex vivo montado. La respuesta de la glucosa de las células beta en el mismo islote puede capturar simultáneamente con concentraciones diferentes de glucosa, que sugiere la presencia de heterogeneidad funcional entre las células beta de pez cebra. Además, la técnica proporciona alta resolución temporal y espacial, que revela la naturaleza oscilatoria de la afluencia del calcio sobre el estímulo de glucosa. Nuestro enfoque abre las puertas para utilizar el pez cebra como modelo para investigar la contribución de factores genéticos y ambientales en función de las células beta y la disfunción.

Utilizando el protocolo descrito anteriormente, se analizaron las respuestas de la glucosa de las células beta en un islote de un pez cebra después fertilización (dpf) de 45 días. Para ello, el islote principal fue disecado de un sacrificio animal y montado en el molde de trombina fibrinógeno en un plato de fondo de cristal. El islote estaba inmerso en HBSS que contiene 5 mM de glucosa. Aumentó la concentración de glucosa de manera escalonada a 10 mM y 20 mM. Se registraron las respuestas de las células beta a las crecientes concentraciones de glucosa. Por último, las células beta se despolarizado con 30 mM KCl (figura 1). La despolarización con KCl induce la entrada de calcio en la salud de las células beta.
Uso de FIJI y un software de análisis de datos, la intensidad de fluorescencia de GCaMP6s de individual de las células beta se extrae y normalizó (figura 2). Vista desde el rastro de la intensidad de la fluorescencia, individual de las células beta mostrarán oscilaciones de GCaMP6s Fluorescencia Tras estimulación con glucosa, que se detiene sobre el estímulo de KCl. La técnica proporciona una solución celular glucosa-capacidad de respuesta de la célula beta y una ventana en su funcionalidad.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57851/57851fig1.jpg"> Figura 1: Ex vivo vivo-proyección de imagen del influjo de calcio mediante GCaMP6s en pez cebra células beta. Un islote principal de Tg(ins:nls-Renilla-mKO2); TG(ins:GCaMP6s) pez cebra (45 PD) fue montado en molde de trombina fibrinógeno e incubada con glucosa de 5 mM (basal). Las células beta fueron etiquetadas con un marcador rojo nuclear, mientras que la fluorescencia de GCaMP6s está presente en el canal verde. El islote era estimulado con una rampa de glucosa que consiste en la incubación secuencial con 10 mM y 20 mM D-glucosa y despolarizado mediante la adición de 30 mM que KCl. puntas marcan beta-células individuales cuya actividad era analizada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57851/57851fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57851/57851fig2.jpg"> Figura 2: normalizado GCaMP6s fluorescencia intensidad-rastro de células beta individuales. Normalizado GCaMP6s fluorescencia intensidad-rastro de las células beta con puntas de flecha en la figura 1. El eje x indica el tiempo en segundos. En la parte superior, barras representan la concentración de glucosa y KCl en el medio HBSS. El eje y indica la intensidad de fluorescencia normalizado durante la serie de tiempo. Para ello, intensidad de línea de base (F0) se calcula como la intensidad media durante la incubación en 5 mM de glucosa. Esto se resta de los datos de series de tiempo completos (F - F0). Intensidad de base se normaliza por la intensidad máxima de la célula (F - F0) / (Fmax- F0). El rastro normalizado muestra una respuesta oscilatoria de las células beta a la glucosa, que se estabiliza cuando las células son despolarizadas con 30 mM de KCl. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57851/57851fig2large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Funcionalidad de la célula beta es importante para la homeostasis de la glucosa en sangre, que es evaluada en unicelulares resolución usando un reportero genéticamente codificado para la afluencia del calcio.

Análisis de la función de célula Beta usando proyección de imagen de resolución sola célula calcio en islotes de pez cebra

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to ...

analysis-beta-cell-function-using-single-cell-resolution-calcium

Research

JoVE Journal

Biology

14.6K vistas.  TU Dresden. Funcionalidad de la célula beta es importante para la homeostasis de la glucosa en sangre, que es evaluada en unicelulares resolución usando un reportero genéticamente codificado para la afluencia del calcio.

Video: Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish1-5. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adult zabrafish. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish with our simple custom-built apparatus using a new protocol which is established in our lab. Both our apparatus and step-by-step procedure of OKR in adult zebrafish are illustrated in this video. In addition, the measurements of the larval OKR, as well as the optomotor response (OMR) test of adult zebrafish, are also demonstrated in this video. This OKR assay of adult zebrafish in our experiment may last for up to 4 hours. Such OKR test applied in adult fish will benefit to visual function investigation more efficiently when the adult fish vision system is manipulated.
Su-Qi Zou and Wu Yin contributed equally to this paper.

Optokinetic response has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adults1-5. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish using a new protocol which is established in our lab.

Usando la respuesta de optocinético para estudiar la función visual del pez cebra

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the ...

Investigación

Biología

Single Cell Fate Mapping in Zebrafish

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, lymphatic, and blood vessel lineages arise in developing embryos requires fate mapping and lineage tracing of undifferentiated precursor cells. Recently, photoactivatable proteins which include: Eos1, 2, PAmCherry3, Kaede4-7, pKindling8, and KikGR9, 10 have received wide interest as cell tracing probes. The fluorescence spectrum of these photosensitive proteins can be easily converted with UV excitation, allowing a population of cells to be distinguished from adjacent ones. However, the photoefficiency of the activated protein may limit long-term cell tracking11. As an alternative to photoactivatable proteins, caged fluorescein-dextran has been widely used in embryo model systems7, 12-14. Traditionally, to uncage fluorescein-dextran, UV excitation from a fluorescence lamp house or a single photon UV laser has been used; however, such sources limit the spatial resolution of photoactivation. Here we report a protocol to fate map, lineage trace, and detect single labeled cells. Single cells in embryos injected with caged fluorescein-dextran are photoactivated with near-infrared laser pulses produced from a titanium sapphire femtosecond laser. This laser is customary in all two-photon confocal microscopes such as the LSM 510 META NLO microscope used in this paper. Since biological tissue is transparent to near-infrared irradiation15, the laser pulses can be focused deep within the embryo without uncaging cells above or below the selected focal plane. Therefore, non-linear two-photon absorption is induced only at the geometric focus to uncage fluorescein-dextran in a single cell. To detect the cell containing uncaged fluorescein-dextran, we describe a simple immunohistochemistry protocol16 to rapidly visualize the activated cell. The activation and detection protocol presented in this paper is versatile and can be applied to any model system. 
Note: The reagents used in this protocol can be found in the table appended at the end of the article.

A method is described to photoactivate single cells containing a caged fluorescent protein using two-photon absorption from a Ti:Sapphire femtosecond laser oscillator. To fate map the photoactivated cell, immunohistochemistry is used. This technique can be applied to any cell type.

Sola célula de mapeado de destino en el pez cebra

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, ...

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression both in terms of tissue distribution and developmental stage. Protocols are described for the use of WISH of zebrafish embryos using antisense RNA probes labeled with digoxigenin. Probes are generated by incorporating digoxigenin-linked nucleotides through in vitro transcription of gene templates that have been cloned and linearized. The chorions of embryos harvested at defined developmental stages are removed before incubation with specific probes. Following a washing procedure to remove excess probe, embryos are incubated with anti-digoxigenin antibody conjugated with alkaline phosphatase. By employing a chromogenic substrate for alkaline phosphatase, specific gene expression can be assessed. Depending on the level of gene expression the entire procedure can be completed within 2-3 days.

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

The zebrafish, a small tropical fish, has become a popular model for studying gene function during vertebrate development and disease. The temporal and spatial expression of target genes can be determined by in situ hybridization. Our improved protocol allows for the detection of low abundant transcripts with low non-specific background signal.

Alta resolución todo el montaje de<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación en embriones de pez cebra para estudiar la expresión génica y la función

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic tools have been introduced, including multiple strategies for inducing mutations and generating transgenic lines. However, large-scale screening is limited by traditional genotyping methods, which are time-consuming and labor-intensive. Here we describe a technique to analyze zebrafish genotypes by PCR combined with high-resolution melting analysis (HRMA).&#160;This approach is rapid, sensitive, and inexpensive, with lower risk of contamination artifacts.&#160;Genotyping by PCR with HRMA can be used for embryos or adult fish, including in high-throughput screening protocols.

PCR combined with high-resolution melt analysis (HRMA) is demonstrated as a rapid and efficient method to genotype zebrafish.

Rápido y Eficiente de pez cebra Genotipado Utilizando PCR con análisis del derretimiento de alta resolución

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys are composed of functional units known as nephrons, which are highly conserved with other vertebrates, including mammals. Research in zebrafish has recently demonstrated that two distinctive phenomena transpire after adult nephrons incur damage: first, there is robust regeneration within existing nephrons that replaces the destroyed tubule epithelial cells; second, entirely new nephrons are produced from renal progenitors in a process known as neonephrogenesis. In contrast, humans and other mammals seem to have only a limited ability for nephron epithelial regeneration. To date, the mechanisms responsible for these kidney regeneration phenomena remain poorly understood. Since adult zebrafish kidneys undergo both nephron epithelial regeneration and neonephrogenesis, they provide an outstanding experimental paradigm to study these events. Further, there is a wide range of genetic and pharmacological tools available in the zebrafish model that can be used to delineate the cellular and molecular mechanisms that regulate renal regeneration. One essential aspect of such research is the evaluation of nephron structure and function. This protocol describes a set of labeling techniques that can be used to gauge renal composition and test nephron functionality in the adult zebrafish kidney. Thus, these methods are widely applicable to the future phenotypic characterization of adult zebrafish kidney injury paradigms, which include but are not limited to, nephrotoxicant exposure regimes or genetic methods of targeted cell death such as the nitroreductase mediated cell ablation technique. Further, these methods could be used to study genetic perturbations in adult kidney formation and could also be applied to assess renal status during chronic disease modeling.

The zebrafish adult kidney is an excellent system for renal regeneration and disease studies. An essential aspect of such research is the assessment of nephron structure and function. This protocol describes several methodologies that can be implemented to assess nephron tubule composition and to evaluate renal reabsorption.

Análisis de Composición Nephron y función en el riñón adultos de pez cebra

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...

Evaluation of Zebrafish Kidney Function Using a Fluorescent Clearance Assay

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish kidney develops and functions in almost the same way as humans. A major difference in the construction of the human kidney is the presence of millions of nephrons compared to the zebrafish that has only two. However, simplifying such a complex system into basic functional units has aided our understanding of how the kidney develops and operates. In zebrafish, the midline located glomerulus is responsible for the initial blood filtration into two pronephric tubules that diverge to run bilaterally down the embryonic axis before fusing to each other at the cloaca. The pronephric tubules are heavily populated by motile cilia that facilitate the movement of filtrate along the segmented tubule, allowing the exchange of various solutes before finally exiting via the cloaca2-4. Many genes responsible for CKD, including those related to ciliogenesis, have been studied in zebrafish5. However, a major draw back has been the difficulty in evaluating zebrafish kidney function after genetic manipulation. Traditional assays to measure kidney dysfunction in humans have proved non translational to zebrafish, mainly due to their aquatic environment and small size. For example, it is not physically possible to extract blood from embryonic staged fish for analysis of urea and creatinine content, as they are too small. In addition, zebrafish do not produce enough urine for testing on a simple proteinuria &#8216;dipstick&#8217;, which is often performed during initial patient examinations. We describe a fluorescent assay that utilizes the optical transparency of the zebrafish to quantitatively monitor the clearance of a fluorescent dye, over time, from the vasculature and out through the kidney, to give a read out of renal function1,6-9.

The zebrafish is a popular tool to model chronic kidney disease (CKD). However, their small size makes it impossible to evaluate renal function using traditional methods. We describe a fluorescent dye kidney clearance assay1 that allows quantitative analysis of zebrafish kidney function in CKD.

Evaluación del pez cebra función renal mediante un ensayo de Liquidación fluorescente

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

-Alta resolución de imagen de lapso de tiempo y análisis automatizado de los microtúbulos en la dinámica de estar umbilical humana Las células endoteliales de vena

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

CUBIC Protocol Visualizes Protein Expression at Single Cell Resolution in Whole Mount Skin Preparations

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium covering most of our body, and epidermal appendages such as the hair follicles and sweat glands. The epidermis undergoes regeneration throughout life and in response to injury. This is enabled by K14-expressing basal epidermal stem/progenitor cell populations that are tightly regulated by multiple regulatory mechanisms active within the epidermis and between epidermis and dermis. This article describes a simple method to clarify full thickness mouse skin biopsies, and visualize K14 protein expression patterns, Ki67 labeled proliferating cells, Nile Red labeled sebocytes, and DAPI nuclear labeling at single cell resolution in 3D. This method enables accurate assessment and quantification of skin anatomy and pathology, and of abnormal epidermal phenotypes in genetically modified mouse lines. The CUBIC protocol is the best method available to date to investigate molecular and cellular interactions in full thickness skin biopsies at single cell resolution.

This report describes a CUBIC protocol to clarify full thickness mouse skin biopsies, and visualize protein expression patterns, proliferating cells, and sebocytes at the single cell resolution in 3D. This method enables accurate assessment of skin anatomy and pathology, and of abnormal epidermal phenotypes in genetically modified mouse lines.

Protocolo CÚBICO Visualiza la expresión de la proteína en la resolución de la celda individual en su totalidad para la piel Mount

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium ...

A Rapid Automated Protocol for Muscle Fiber Population Analysis in Rat Muscle Cross Sections Using Myosin Heavy Chain Immunohistochemistry

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle composition. Various time-consuming methods have traditionally been used to study fiber populations in many fields of research. However, recently developed immunohistochemical methods based on myosin heavy chain protein expression provide a quick alternative to identify multiple fiber types in a single section. Here, we present a rapid, reliable and reproducible protocol for improved staining quality, allowing automatic acquisition of whole cross sections and automatic quantification of fiber populations with ImageJ. For this purpose, embedded skeletal muscles are cut in cross sections, stained using myosin heavy chains antibodies with secondary fluorescent antibodies and DAPI for cell nuclei staining. Whole cross sections are then scanned automatically using a slide scanner to obtain high-resolution composite pictures of the entire specimen. Fiber population analyses are subsequently performed to quantify slow, intermediate and fast fibers using an automated macro for ImageJ. We have previously shown that this method can identify fiber populations reliably to a degree of &#177;4%. In addition, this method reduces inter-user variability and time per analyses significantly using the open source platform ImageJ.

Here, we present a protocol for rapid muscle fiber analyses, which allows improved staining quality, and thereby automatic acquisition and quantification of fiber populations using the freely available software ImageJ.

Un Protocolo Automatizado Rápido de Fibra Análisis Población en músculo de rata Secciones representativas Uso de la cadena pesada de miosina inmunohistoquímica

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle ...

Single-Cell Resolution Three-Dimensional Imaging of Intact Organoids

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development and function as well as disease. Fluorescence microscopy has played a major role in characterizing their cellular composition in detail and demonstrating their similarity to the tissue they originate from. In this article, we present a comprehensive protocol for high-resolution 3D imaging of whole organoids upon immunofluorescent labeling. This method is widely applicable for imaging of organoids differing in origin, size and shape. Thus far we have applied the method to airway, colon, kidney, and liver organoids derived from healthy human tissue, as well as human breast tumor organoids and mouse mammary gland organoids. We use an optical clearing agent, FUnGI, which enables the acquisition of whole 3D organoids with the opportunity for single-cell quantification of markers. This three-day protocol from organoid harvesting to image analysis is optimized for 3D imaging using confocal microscopy.

The entire 3D structure and cellular content of organoids, as well as their phenotypic resemblance to the original tissue can be captured using the single-cell resolution 3D imaging protocol described here. This protocol can be applied to a wide range of organoids varying in origin, size and shape.

Imagen tridimensional de resolución de una sola célula de organoides intactos

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development ...