זנים C. elegans השתמשו במחקר זה התקבלו ממרכז גנטיקה Caenorhabditis, אשר נתמך על ידי מכוני הבריאות הלאומיים - Office של תשתית תוכניות מחקר (P40 OD010440). עבודה זו נתמכה על ידי NIH: 1R03AG048578-01 Jun ליאנג, הנטר-CCRG 1501 Jun ליאנג ולאחר PSC-הנטר 66184-00 44 ו-45 67248-00 Jun ליאנג. אנו מודים קאתי סבג-דאן בטובך לחלוק לה מרחב מעבדה. כל התמונות פלורסצנטיות נאספו במתקן הליבה במכללת קווינס. אנו מודים וויליאם ג'יי רייס על הערותיו על כתב היד.

1. פתרונות
<ol><li>
NGM צלחות
	<ol>
<li>בבקבוקון Erlenmeyer 2 ל', הוסף דור 3 של NaCl, 17 גרם אגר, 2.5 גר' Peptone 975 מ ל dH2O. כיסוי הפה + בקבוקי שתייה צידניות עם רדיד אלומיניום. אוטוקלב. הבקבוק עבור 50 דק לצנן את זה 20-30 דקות.</li>
		<li>לאחר מכן להוסיף פתרונות סטיריליים: 1 מ"ל של 1 מ' CaCl2, 1 מ"ל של כולסטרול 5 מ"ג/מ"ל אתנול, 1 מ"ל של 1 מ' MgSO4, 25 מ של 1 מ' KPO4 (pH 6.0) מאגר. מערבולת הפתרונות לערבב אותם היטב.</li>
		<li>באמצעות מתקן נוזלי, לוותר על הפתרון NGM צלחות פטרי 60 מ מ. מילוי הלוחות 2/3 מלא של אגר. לאחסן אותם לאוויר ב 4 ° C לשימוש עתידי.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
1 מ'-KPO-4 -מאגר (pH 6.0)
	<ol>
<li>להמיס g 10.832PO ח'4 ו- g 3.56 של K2HPO4 dH2O, ולאחר מכן לכוונן את עוצמת הקול סה כ 100 מ. אוטוקלב הפתרון למשך 15 דקות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
M9
	<ol>
<li>להמיס דור 3 ח'2PO4, 6 גר' נה2HPO4ו- 5 גר' NaCl dH2O, להוסיף 1 מ"ל של 1 מ' MgSO4, ולכוונן את העוצמה הכוללת כדי 1 ל'</li>
	</ol>
</li>
	<li>
µg 10/mL דאפי
	<ol>
<li>להוסיף 1 µL של 10 מ"ג/מ"ל של דאפי לתוך µL 999 של dH2O.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
95% אלכוהול (v/v)
	<ol>
<li>למדוד 95 מ"ל של 100% אלכוהול ומוסיפים מים מזוקקים כדי לכוונן את העוצמה עד 100 מ"ל.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
30% אצטון (v/v)
	<ol>
<li>להוסיף 30 מ של אצטון dH2O ולכוונן את העוצמה סה כ 100 מ.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. עומס חום
<ol><li>ליצור קו מערך extrachromosomal עם מבנה translational של היעד גנים9,10. לחלופין, להשיג קווים אלה מן את Caenorhabditis גנטיקה מרכז (CGC), שהינו משאב ציבורי למחקר C. elegans , או מעבדת מחקר שפורסמו בעבר.</li>
	<li>לשלב את הקווים extrachromosomal הגנום על ידי חשיפת תולעים קרינה-γ Rad 3,8009. לאחר מכן, בחר את הקווים stably ביטוי כך כל בעל חיים מבטא סמן חלבון כגון GFP או רולר.</li>
	<li>כדי להסיר מוטציות שנוצרו במהלך הקרינה, outcross לפחות 2 שורות x. להשתמש הקו הטרנסגניים כדי לזהות שינויים דפוס ביטוי חלבון תחת לחץ.</li>
	<li>הכינו צלחות תולעת NGM כפי שמתואר בשלב 1.1. פסים של שיבוט OP50, התרבות החיידקים בתוך נוזל ציר LB בן לילה. זרע צלחות NGM עם נוזלי OP50 תרבות, דגירה הצלחות בחממה 37 ° C בלילה כדי לגדל דשא חיידקים כמקור מזון לתולעים לקרר את הצלחות בטמפרטורת החדר במשך לפחות 30 דקות לפני השימוש.</li>
	<li>לגדול הקו הטרנסגניים ב- 20 ° C ללא רעב במשך לפחות 2 דורות לפני וזמינותו מתח חום.</li>
	<li>לבחור 8-10 בוגרים gravid (רחם מלא ביצים) צלחת תולעת חדש, אז תן להם להטיל ביצים במשך כ- 3-5 h ולהסיר כל המבוגרים הצלחות.</li>
	<li>כדי לסנכרן את התולעים, תן את הביצים בוקעות ולגדול הזחלים עבור-48 שעות. כדי השלב הרביעי (L4) זחל. לבחון את מבנה הפות שלהן (מבנה חצי ירח) כדי לזהות את הבמה (איור 1, חץ) L411.</li>
	<li>מקום צלחות תולעת עם הזחלים L4 חממה 35 ° C עבור 2 – 5 h להשיג עומס חום. מקום מד חום כדי למדוד במדויק את הטמפרטורה בחממה.</li>
</ol>3. דאפי מכתים
<ol><li>
קיבוע אתנול
	<ol>
<li>להוסיף 10 µL של המאגר M9 במרכז של זכוכית.</li>
		<li>לבחור את התולעים בהלם-חום מהשלב 2.8 ולשים אותם לתוך המאגר M9 בשקופית זכוכית.<ol>
<li>לחלופין, לשטוף את הצלחת עם M9, centrifuge זה ב x 1000 g עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר, ולמחוק את תגובת שיקוע. הוסף את התולעים לשקופית זכוכית.</li>
		</ol>
</li>
		<li>השתמש רקמה רכה כדי לנקז את הנוזל העודף. . זהירות מהמדרגה תחת מיקרוסקופ ויבתר...</li>
		<li>להוסיף 10 µL של אלכוהול 95% על התולעים, ייבש אותן בחוץ. לצפות בתהליך תחת מיקרוסקופ ויבתר, אל תתנו לחיות לתפוס יבש מדי. מיד לאחר האתנול התאדו מן החיות, המשך לשלב הבא. הערה: אתנול מתאדה מהר מאוד.</li>
		<li>חזור על שלב 3.1.4 פעמיים כך התולעים הם קבועים. הערה: זה נורמלי עבור בעלי החיים להיראות כהה יותר, מעוותת.</li>
		<li>להוסיף 10 µL של דאפי (10 µg/mL) את התולעים. מיד לכסות אותם עם coverslip ויסגור את השקופית הכוללת ג'ל לק שקוף.</li>
		<li>להציג את החיות לאחר כ 10 דקות על ידי קרינה פלואורסצנטית המיקרוסקופ.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
קיבוע אצטון (גישה אלטרנטיבית)
	<ol>
<li>לשטוף את הצלחת בהלם-חום משלב 2.8 עם M9, centrifuge זה ב x 1000 g עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר, ולמחוק את תגובת שיקוע. לשטוף את גלולה עם 1 מ"ל של dH2O, לאסוף את צניפה, ולמחוק את תגובת שיקוע.</li>
		<li>להוסיף 400 µL של 30% אצטון עבור 15 דקות צנטריפוגה ב x 1000 g עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר וזורקים את תגובת שיקוע. השתמש µL 500 של dH2O לרחוץ את החיות 2 x. למחוק את תגובת שיקוע.</li>
		<li>להוסיף 200 µL של דאפי (10 µg/mL), או 4 x כמות האחסון של התולעים הכולל, בצינור למשך 15 דקות.</li>
		<li>צנטריפוגה ב x 1000 g עבור 1 דקות וזורקים את תגובת שיקוע. לשטוף את צניפה 2 x עם 500 µL של dH2O. למקם את התולעים בשקופיות זכוכית, לכסות אותם עם coverslips, לאטום את השקופית הכוללת ג'ל לק שקוף, ולבחון את החיות תחת מיקרוסקופ זריחה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. מיקרוסקופיים הדמיה
<ol><li>הפעל את מקור האור UV ומיקרוסקופ זריחה. הפעל את המחשב מחובר המיקרוסקופ.</li>
	<li>לטעון את השקופית על המיקרוסקופ זריחה. השתמש עדשה המטרה צריכת חשמל נמוכה (10 X) כדי לאתר את התולעים, להגדיל את כוח ההגדלה 400 X ולהתמקד הדגימה.</li>
	<li>פתח את התוכנה המצורפת עם המיקרוסקופ. לחץ על "רכישת" בתפריט; לחץ על "המצלמה" ובחר את המצלמה מחוברת המיקרוסקופ; פעולה זו מאפשרת המצלמה שנבחר לתקשר עם התוכנה. הערה: מיקרוסקופים שונים עשויים להשתנות במבצע.</li>
	<li>תחת אותו "רכישת", לחץ על "רב-ממדי רכישה". פעולה זו פותחת חלון חדש של ניווט "רב-ממדי רכישה". לחץ על לחצן "רב-ערוצי", והם יופיעו כל הערוצים הזמינים.</li>
	<li>בחר כחול, ירוק, DIC (התערבות דיפרנציאלית חדות) כדי לבחון את הדגימה. בחלון הניווט "רב-ממדי רכישה", להשאיר את "כחול-דאפי", "גרין-GFP", וערוצי "גריי-DIC", "Nomarski" לחץ לחיצה ימנית על ערוצים אחרים, כגון "אדום-rhodamine" ו- "שדה לבן בהיר", לסגור אותם.</li>
	<li>
ראשית, למדוד את זמן החשיפה לכל ערוץ:
	<ol>
<li>שמאל לחץ בערוץ 'בלו-דאפי' כדי לבחור אותו ולאחר מכן לחץ על "מדד" על מנת לקחת את תמונת חיים תחת בערוץ דאפי עם הזמן חשיפה אוטומטית. יופיע חלון חדש עם תמונת בשידור חי.</li>
		<li>בצד שמאל של החלון תמונות בשידור חי, כוונן באופן ידני את זמן החשיפה במידת הצורך להפוך את התמונה כרצונכם.</li>
		<li>לבסוף, לחץ על "אישור" בחלון התמונה בשידור חי. פעולה זו מגדירה את זמן החשיפה תחת בערוץ דאפי.</li>
	</ol>
</li>
	<li>חזור על צעד 4.6 הערוצים האחרים, "ירוק-GFP" ו- "גריי-DIC", "Nomarski", כדי להגדיר את זמני חשיפה עבור ערוצים אלה.</li>
	<li>בחלון הניווט "רב-ממדי רכישה", לחץ על "התחל" כדי לאסוף באופן אוטומטי תמונות 3 תחת 3 ערוצים שונים לפי סדר (ראה לעיל) עם פעמים חשיפה ספציפי כפי שנקבע.</li>
	<li>כדי לשמור את הקובץ, ללכת לתפריט הראשי, לחץ על "קובץ" ואז על "שמירה בשם". קלט שם הקובץ ואת שם התיקיה. שמור את הקובץ כתבנית קובץ ברירת המחדל כדי לשמר מידע הדמיה מפורטת לשימוש עתידי.</li>
	<li>
כדי לייצא את הקובץ בתבניות אחרות:
	<ol>
<li>ללכת "קובץ" ולחץ על "ייצוא". פעולה זו תפתח את חלון הגדרות ייצוא.</li>
		<li>להגדיר שם קובץ ותיקיה. בדוק "ליצור תיקיית פרויקט" טוב יותר לארגן את הנתונים. התוכנה גם מאפשרת למשתמש לציין 4 אפשרויות אחרות: "צור מיזוג תמונות", "השתמש צבע לתמונות ערוץ", "שימוש ערוץ שמות", "תמונה ממוזג בלבד".</li>
		<li>בחרו סוג הקובץ הרצויה מהתפריט הנפתח, כגון "טיף", "BMP", "PSD", או "JPG" וסוגים אחרים. ואז לחץ על "התחל" כדי לייצא.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Essers, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FOXO+transcription+factor+activation+by+oxidative+stress+mediated+by+the+small+GTPase+Ral+and+JNK.">FOXO transcription factor activation by oxidative stress mediated by the small GTPase Ral and JNK.</a> The EMBO Journal. 23 (24), 4802-4812 (2004).</li><li>Oh, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JNK+regulates+lifespan+in+Caenorhabditis+elegans+by+modulating+nuclear+translocation+of+forkhead+transcription+factor/DAF-16.">JNK regulates lifespan in Caenorhabditis elegans by modulating nuclear translocation of forkhead transcription factor/DAF-16.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (12), 4494-4499 (2005).</li><li>Gross, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase+cleaved+BID+targets+mitochondria+and+is+required+for+cytochrome+c+release,+while+BCL-XL+prevents+this+release+but+not+tumor+necrosis+factor-R1/Fas+death.">Caspase cleaved BID targets mitochondria and is required for cytochrome c release, while BCL-XL prevents this release but not tumor necrosis factor-R1/Fas death.</a> The Journal of Biological Chemistry. 274 (2), 1156-1163 (1999).</li><li>Doerflinger, M., Glab, J. A., Puthalakath, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BH3-only+proteins:+a+20-year+stock-take.">BH3-only proteins: a 20-year stock-take.</a> The FEBS Journal. 282 (6), 1006-1016 (2015).</li><li>Mayorova, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+containing+aragonite+crystals+mediate+responses+to+gravity+in+Trichoplax+adhaerens+(Placozoa),+an+animal+lacking+neurons+and+synapses.">Cells containing aragonite crystals mediate responses to gravity in Trichoplax adhaerens (Placozoa), an animal lacking neurons and synapses.</a> PLoS One. 13 (1), e0190905 (2018).</li><li>Terron-Camero, L. C., Molina-Moya, E., Sanz-Fernandez, M., Sandalio, L. M., Romero-Puertas, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+reactive+oxygen+and+nitrogen+species+(ROS/RNS)+during+hypersensitive+cell+death.">Detection of reactive oxygen and nitrogen species (ROS/RNS) during hypersensitive cell death.</a> Methods in Molecular Biology. , 97-105 (2018).</li><li>Pedrazzini, E., Vitale, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+biosynthesis+and+maturation+in+the+ER.">Protein biosynthesis and maturation in the ER.</a> Methods in Molecular Biology. , 179-189 (2018).</li><li>Liang, J., Shaulov, Y., Savage-Dunn, C., Boissinot, S., Hoque, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloride+intracellular+channel+proteins+respond+to+heat+stress+in+Caenorhabditis+elegans.">Chloride intracellular channel proteins respond to heat stress in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS One. 12 (9), e0184308 (2017).</li><li>Evans, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+and+microinjection.">Transformation and microinjection.</a> Wormbook. , (2006).</li><li>Mello, C., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+transformation.">DNA transformation.</a> Methods in Cell Biology. 48, 451-482 (1995).</li><li>Yochem, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nomarski+images+for+learning+the+anatomy,+with+tips+for+mosaic+analysis.">Nomarski images for learning the anatomy, with tips for mosaic analysis.</a> Wormbook. , (2006).</li><li>Dulhunty, A., Gage, P., Curtis, S., Chelvanayagam, G., Board, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glutathione+transferase+structural+family+includes+a+nuclear+chloride+channel+and+a+ryanodine+receptor+calcium+release+channel+modulator.">The glutathione transferase structural family includes a nuclear chloride channel and a ryanodine receptor calcium release channel modulator.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276 (5), 3319-3323 (2001).</li><li>Suh, K. S., Malik, M., Shukla, A., Yuspa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLIC4,+skin+homeostasis+and+cutaneous+cancer:+surprising+connections.">CLIC4, skin homeostasis and cutaneous cancer: surprising connections.</a> Molecular Carcinogenesis. 46 (8), 599-604 (2007).</li><li>Yao, Q., Qu, X., Yang, Q., Wei, M., Kong, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLIC4+mediates+TGF-beta1-induced+fibroblast-to-myofibroblast+transdifferentiation+in+ovarian+cancer.">CLIC4 mediates TGF-beta1-induced fibroblast-to-myofibroblast transdifferentiation in ovarian cancer.</a> Oncology Reports. 22 (3), 541-548 (2009).</li><li>Ronnov-Jessen, L., Villadsen, R., Edwards, J. C., Petersen, O. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+a+chloride+intracellular+channel+gene,+CLIC4,+in+transforming+growth+factor-beta1-mediated+conversion+of+fibroblasts+to+myofibroblasts.">Differential expression of a chloride intracellular channel gene, CLIC4, in transforming growth factor-beta1-mediated conversion of fibroblasts to myofibroblasts.</a> The American Journal of Pathology. 161 (2), 471-480 (2002).</li><li>He, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+CLIC4+in+the+host+innate+responses+to+bacterial+lipopolysaccharide.">Role of CLIC4 in the host innate responses to bacterial lipopolysaccharide.</a> European Journal of Immunology. 41 (5), 1221-1230 (2011).</li><li>Zhong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+CLIC4+enhances+autophagy+and+triggers+mitochondrial+and+ER+stress-induced+apoptosis+in+human+glioma+U251+cells+under+starvation.">Inhibition of CLIC4 enhances autophagy and triggers mitochondrial and ER stress-induced apoptosis in human glioma U251 cells under starvation.</a> PLoS One. 7 (6), e39378 (2012).</li><li>Liang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+schnurri+homolog+sma-9+mediates+stage-+and+cell+type-specific+responses+to+DBL-1+BMP-related+signaling.">The Caenorhabditis elegans schnurri homolog sma-9 mediates stage- and cell type-specific responses to DBL-1 BMP-related signaling.</a> Development. 130 (26), 6453-6464 (2003).</li><li>Leopold, L. E., Heestand, B. N., Seong, S., Shtessel, L., Ahmed, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+pairing+during+meiosis+triggers+multigenerational+transgene+silencing+in+Caenorhabditis+elegans.">Lack of pairing during meiosis triggers multigenerational transgene silencing in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (20), E2667-E2676 (2015).</li><li>Schultz, R. D., Bennett, E. E., Ellis, E. A., Gumienny, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+extracellular+matrix+organization+by+BMP+signaling+in+Caenorhabditis+elegans.">Regulation of extracellular matrix organization by BMP signaling in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS One. 9 (7), e101929 (2014).</li><li>Matus, D. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasive+cell+fate+requires+G1+cell-cycle+arrest+and+histone+deacetylase-mediated+changes+in+gene+expression.">Invasive cell fate requires G1 cell-cycle arrest and histone deacetylase-mediated changes in gene expression.</a> Developmental Cell. 35 (2), 162-174 (2015).</li><li>Reddy, K. C., Villeneuve, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+HIM-17+links+chromatin+modification+and+competence+for+initiation+of+meiotic+recombination.">C. elegans HIM-17 links chromatin modification and competence for initiation of meiotic recombination.</a> Cell. 118 (4), 439-452 (2004).</li><li>Ames, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-cell-autonomous+role+of+BEC-1/BECN1/Beclin1+in+coordinating+cell-cycle+progression+and+stem+cell+proliferation+during+germline+development.">A non-cell-autonomous role of BEC-1/BECN1/Beclin1 in coordinating cell-cycle progression and stem cell proliferation during germline development.</a> Current Biology. 27 (6), 905-913 (2017).</li><li>Pekar, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+the+environment,+DAF-7/TGFbeta+signaling+and+LAG-2/DSL+ligand+expression+in+the+germline+stem+cell+niche.">Linking the environment, DAF-7/TGFbeta signaling and LAG-2/DSL ligand expression in the germline stem cell niche.</a> Development. 144 (16), 2896-2906 (2017).</li><li>Schvarzstein, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+helicase+HIM-6/BLM+both+promotes+MutSgamma-dependent+crossovers+and+antagonizes+MutSgamma-independent+interhomolog+associations+during+caenorhabditis+elegans+meiosis.">DNA helicase HIM-6/BLM both promotes MutSgamma-dependent crossovers and antagonizes MutSgamma-independent interhomolog associations during caenorhabditis elegans meiosis.</a> Genetics. 198 (1), 193-207 (2014).</li><li>Flemming, A. J., Shen, Z. Z., Cunha, A., Emmons, S. W., Leroi, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+polyploidization+and+cellular+proliferation+drive+body+size+evolution+in+nematodes.">Somatic polyploidization and cellular proliferation drive body size evolution in nematodes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (10), 5285-5290 (2000).</li><li>Nagamatsu, Y., Ohshima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+for+the+control+of+body+size+by+a+G-kinase+and+a+downstream+TGFbeta+signal+pathway+in+Caenorhabditis+elegans.">Mechanisms for the control of body size by a G-kinase and a downstream TGFbeta signal pathway in Caenorhabditis elegans.</a> Genes to Cells. 9 (1), 39-47 (2004).</li></ol>

המחברים יש ריהצהל.

מאמר זה הציג שיטה מהירה ויעילה כדי לוודא שינויים subcellular חלבון של הציטופלסמה את הגרעין. הביטוי חלבון הוצג על ידי היתוך GFP, בעוד המבנה גרעין אומתה על ידי דאפי מכתים (איור 3). מאז immunostaining C. elegans חלבונים הוא מאתגר, הגרסא subcellular המקומית חלבון C. elegans רוב מאופיינים על-ידי תיו?...

שינוי של לוקליזציה subcellular חלבון הוא מנגנון משותף בתגובה לאותות פנימיים או חיצוניים כגון עומס חום, הרעבה, סטרס חמצוני, אפופטוזיס, זירחון חלבונים ועוד. לדוגמה, עומס חום גורם שייך FOXO הדף היומי-16 רוברטסונית גרעיני1,2, ואת החלבון BCL-2 פרו-אפופטוטיים להיפגע שההצעה translocates המיטוכונדריה עם מותו המקבל איתות3,4. טכניקות שונות זמינים לזהות שינויים אלה. שילוב של סופג המערבי ובידוד מבחינה ביוכימית subcellular מבנים (למשל, המיטוכונדריה או הגרעינים) טוב להשיג את המטרה3. עם זאת, זה דורש של נוגדנים ספציפיים נגד החלבון עניין. לפיכך, נוגדן ומבוססת הופך המפתח להצלחה. גישה חלופית היא תווית שונה מבנים subcellular או organelles עם סמנים שונים כגון חלבון פלורסצנטיות ירוק (GFP), חלבון פלואורסצנטי אדום (RFP), חלבון פלורסצנטיות צהוב (YFP) mCherry, ולאחר בינתיים תווית החלבון של עניין עם סמנים אחרים. לאחר מכן, לבחון אותם תחת מיקרוסקופ קונפוקלי למקם את מטרות5,6. איזוטופים רדיואקטיביים הינם בחירה חלופיים עבור תיוג חלבונים היעד וכן ואז זיהוי שלהם לוקליזציה subcellular7. עם זאת, שיטה זו מחייבת הכשרה מתאימה וטיפול פסולת רדיואקטיבית. בנסיבות כגון חוסר נוגדנים ספציפיים, העדר של סמן ראוי, או את scarceness של ציוד כגון מיקרוסקופ קונפוקלי, גישה אלטרנטיבית צריך להיחשב. כדי לזהות חלבונים גרעיניים התקה, זה מושך רק לסמן את היעד החלבונים עם סמן, כתם גרעינים עם הכימית כימית 4', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) מאז זה רק דורש מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית רגילה.
Immunolabeling C. elegans עם נוגדנים הוא מאתגר בשל החדירות הנמוכה של קליפת או את הקוטיקולה סילוק המקיפים את החיה. בינתיים, מאז C. elegans חלבונים מתבדרת באופן משמעותי מן orthologs חוליות שלהם, כמה חברות מסחריות לספק C. elegans עם מוצרים ספציפיים. . קשה לי מעבדה קטנה ליצירת נוגדנים C. elegans עבור עצמם. חוקרים בקהילה מרבים להשתמש חלבונים מתויג כסמני להפגין ביטוי חלבון לוקליזציה או הגן. מאמר זה משתמש טקרמ-1::GFP בתור דוגמה לאתר חלבון התקה גרעיני תחת מתח חום8. משולב translational טקרמ-1::gfp לתוך הגנום בעלי חיים משמש לבטא stably את הגן עם gfp פיוז'ן. המחקר הראה שכי טקרמ-1 מתבטאת המעי, לגוף החומה שרירים אחרים מבני subcellular8. פרוטוקול זה מדגים כיצד לסנכרן תולעים. כדי השלב הרביעי זחל (L4), לבצע חום מתח הניסוי, ואת התנהגות דאפי מכתים, אתנול קיבעון, קיבוע אצטון, הדמיה במיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית רגילה.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>40043</td>
			<td>both Hoechst 33258 and Hoechst 33342 also works well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OP50</td>
			<td>CGC</td>
			<td>OP50</td>
			<td>https://cgc.umn.edu/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://cgc.umn.edu/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kim Wipe</td>
			<td>Kimberly-Clark Corporation</td>
			<td></td>
			<td>soft tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss&#160; AX10</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovision Rel 4.8</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>microscope software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioCam MR Rev3</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>digital camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparent nail polish gel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm petri dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-20 &#181;L pipettor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20-200 &#181;L pipettor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200-1000 &#181;L pipettor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-200 &#181;L pipet tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200-1000 &#181;L pipet tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum wire worm pick</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting protein subcellular localization by green fluorescence protein tagging and 4',6-diamidino-2-phenylindole staining in caenorhabditis elegans

זה פרוטוקול, קרינה פלואורסצנטית ירוק (GFP) פיוז'ן חלבון ו 4', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) צביעת משמשים כדי לעקוב אחר שינויים לוקליזציה subcellular חלבון; בפרט, התקה גרעיני תחת חום להדגיש תנאי. חלבונים מגיבים אותות בהתאמה עד חיצוניים ופנימיים. מנגנון משותף היא לשנות לוקליזציה subcellular שלה. מאמר זה מתאר פרוטוקול כדי לעקוב אחר לוקליזציה חלבון שלא דורש נוגדן, תיוג רדיואקטיבי או מיקרוסקופ קונפוקלי. במאמר זה, משמש GFP כדי לתייג את היעד חלבון טקרמ-1 ב- C. elegans, חבר של משפחת חלבונים (CLICs) של ערוץ תאיים כלוריד כולל יונקים CLIC4. קו הטרנסגניים translational משולב טקרמ-1::gfp (עם מקדם מכירות ו רצף הגן המלא) נוצרה על ידי שינוי, γ-קרינה, stably מבטא את הגן gfp. מחקרים אחרונים הראו כי על עומס חום, סטרס חמצוני לא, 1::GFP טקרמ מצטבר בגרעין. חופפים את האות ה-GFP עם מבנה הגרעינים והן את דאפי אותות מאשר את השינויים לוקליזציה subcellular טקרמ-1 תחת לחץ... פרוטוקול זה מציג שתי שיטות קיבוע שונות דאפי מכתים: קיבוע אתנול, קיבוע אצטון. פרוטוקול מכתימים דאפי שהוצגו במאמר זה הוא מהיר ויעיל ושומר את האות ה-GFP והן את השינויים subcellular לוקליזציה של חלבון. שיטה זו דורשת רק מיקרוסקופ זריחה עם Nomarski, מסנן FITC מסנן דאפי. היא מתאימה עבור הגדרה מעבדה קטנה, סטודנט לתואר ראשון מחקר, מחקר תלמיד תיכון וכיתות ביוטכנולוגיה.

חלבונים תאיים ערוץ כלוריד (לחץ על כד) הם חלבונים רב תכליתי מאוד נשמרים על פני מינים12. הרבה מחקרים מראים כי CLICs לווסת לחץ הסלולר autophagy, אפופטוזיס, carcinogenesis, אנגיוגנזה, התגובה החיסונית מולדת מקרופאג מערכת בתרבית של13,14,<sup class="xr...

Watch this Scientific Journal Video about Detecting Protein Subcellular Localization by Green Fluorescence Protein Tagging and 4',6-Diamidino-2-phenylindole Staining in Caenorhabditis elegans at JoVE.

Detecting Protein Subcellular Localization by Green Fluorescence Protein Tagging and 4',6-Diamidino-2-phenylindole Staining in Caenorhabditis elegans

פרוטוקול זה מדגים כיצד לעקוב אחר חלבונים גרעיניים התקה תחת עומס חום באמצעות של זריחה ירוק (GFP) פיוז'ן חלבון כסמן ו 4', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) מכתים. דאפי מכתים פרוטוקול מהיר ושומר את האותות לוקליזציה subcellular GFP וחלבון.

גילוי חלבונים לוקליזציה Subcellular על ידי ירוק פלורסצנטיות חלבון Tagging ו 4', 6-Diamidino-2-phenylindole מכתים ב Caenorhabditis elegans

In this protocol, a green fluorescence protein (GFP) fusion protein and 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) staining are used to track protein ...

detecting-protein-subcellular-localization-green-fluorescence-protein

Research

JoVE Journal

Biology

Detecting Protein Subcellular Localization by Green Fluorescence Protein Tagging and 4',6-Diamidino-2-phenylindole Staining in Caenorhabditis elegans

9.5K Views.  Borough of Manhattan Community College/CUNY. פרוטוקול זה מדגים כיצד לעקוב אחר חלבונים גרעיניים התקה תחת עומס חום באמצעות של זריחה ירוק (GFP) פיוז'ן חלבון כסמן ו 4', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) מכתים. דאפי מכתים פרוטוקול מהיר ושומר את האותות לוקליזציה subcellular GFP וחלבון.

Video: Detecting Protein Subcellular Localization by Green Fluorescence Protein Tagging and 4',6-Diamidino-2-phenylindole Staining in Caenorhabditis elegans

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

הכתמה של חלבונים עם ג&#39;ל Coomassie G-250 ללא חומצה אצטית ממס אורגני

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

באמצעות מערכת GELFREE 8100 ההיפוך חלוקה על ההיפוך חלוקה משקל מבוסס מולקולרית עם שלב החילוץ נוזלי

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

בסיסי<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; שיטות: סנכרון תצפית

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Preparation of the Mgm101 Recombination Protein by MBP-based Tagging Strategy

The MGM101 gene was identified 20 years ago for its role in the maintenance of mitochondrial DNA. Studies from several groups have suggested that the Mgm101 protein is involved in the recombinational repair of mitochondrial DNA. Recent investigations have indicated that Mgm101 is related to the Rad52-type recombination protein family. These proteins form large oligomeric rings and promote the annealing of homologous single stranded DNA molecules. However, the characterization of Mgm101 has been hindered by the difficulty in producing the recombinant protein. Here, a reliable procedure for the preparation of recombinant Mgm101 is described. Maltose Binding Protein (MBP)-tagged Mgm101 is first expressed in Escherichia coli. The fusion protein is initially purified by amylose affinity chromatography. After being released by proteolytic cleavage, Mgm101 is separated from MBP by cationic exchange chromatography. Monodispersed Mgm101 is then obtained by size exclusion chromatography. A yield of ~0.87 mg of Mgm101 per liter of bacterial culture can be routinely obtained. The recombinant Mgm101 has minimal contamination of DNA. The prepared samples are successfully used for biochemical, structural and single particle image analyses of Mgm101. This protocol may also be used for the preparation of other large oligomeric DNA-binding proteins that may be misfolded and toxic to bacterial cells.

The yeast mitochondrial nucleoid protein, Mgm101, is a Rad52-type recombination protein that forms large oligomeric rings. A protocol is described to prepare soluble recombinant Mgm101 using the Maltose Binding Protein (MBP)-tagging strategy coupled with cation exchange and size exclusion chromatography.

הכנה של חלבון רקומבינציה Mgm101 ידי אסטרטגיה תיוג מבוססת MBP

The MGM101 gene was identified 20 years ago for its role in the maintenance of mitochondrial DNA. Studies from several groups have suggested that the ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) is an in vivo method to monitor such interactions in plant cells. In the presented protocol the investigated candidate proteins are fused to complementary halves of fluorescent proteins and the respective constructs are introduced into plant cells via agrobacterium-mediated transformation. Subsequently, the proteins are transiently expressed in tobacco leaves and the restored fluorescent signals can be detected with a confocal laser scanning microscope in the intact cells. This allows not only visualization of the interaction itself, but also the subcellular localization of the protein complexes can be determined. For this purpose, marker genes containing a fluorescent tag can be coexpressed along with the BiFC constructs, thus visualizing cellular structures such as the endoplasmic reticulum, mitochondria, the Golgi apparatus or the plasma membrane. The fluorescent signal can be monitored either directly in epidermal leaf cells or in single protoplasts, which can be easily isolated from the transformed tobacco leaves. BiFC is ideally suited to study protein-protein interactions in their natural surroundings within the living cell. However, it has to be considered that the expression has to be driven by strong promoters and that the interaction partners are modified due to fusion of the relatively large fluorescence tags, which might interfere with the interaction mechanism. Nevertheless, BiFC is an excellent complementary approach to other commonly applied methods investigating protein-protein interactions, such as coimmunoprecipitation, in vitro pull-down assays or yeast-two-hybrid experiments.

Formation of protein complexes in vivo can be visualized by bimolecular fluorescence complementation. Interaction partners are fused to complementary parts of fluorescent tags and transiently expressed in tobacco leaves, resulting in a reconstituted fluorescent signal upon close proximity of the two proteins.

חלבונים אינטראקציות דמיינו ידי bimolecular הקרינה complementation בProtoplasts הטבק ועלים

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

הקרנה ירוקה פלורסנט מבוסס חלבון ביטוי של החלבונים ממברנה ב<em&gt; Coli Escherichia</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Quantitation of Protein Expression and Co-localization Using Multiplexed Immuno-histochemical Staining and Multispectral Imaging

Immunohistochemistry is a commonly used clinical and research lab detection technique for investigating protein expression and localization within tissues. Many semi-quantitative systems have been developed for scoring expression using immunohistochemistry, but inherent subjectivity limits reproducibility and accuracy of results. Furthermore, the investigation of spatially overlapping biomarkers such as nuclear transcription factors is difficult with current immunohistochemistry techniques. We have developed and optimized a system for simultaneous investigation of multiple proteins using high throughput methods of multiplexed immunohistochemistry and multispectral imaging. Multiplexed immunohistochemistry is performed by sequential application of primary antibodies with secondary antibodies conjugated to horseradish peroxidase or alkaline phosphatase. Different chromogens are used to detect each protein of interest. Stained slides are loaded into an automated slide scanner and a protocol is created for automated image acquisition. A spectral library is created by staining a set of slides with a single chromogen on each. A subset of representative stained images are imported into multispectral imaging software and an algorithm for distinguishing tissue type is created by defining tissue compartments on images. Subcellular compartments are segmented by using hematoxylin counterstain and adjusting the intrinsic algorithm. Thresholding is applied to determine positivity and protein co-localization. The final algorithm is then applied to the entire set of tissues. Resulting data allows the user to evaluate protein expression based on tissue type (ex. epithelia vs. stroma) and subcellular compartment (nucleus vs. cytoplasm vs. plasma membrane). Co-localization analysis allows for investigation of double-positive, double-negative, and single-positive cell types. Combining multispectral imaging with multiplexed immunohistochemistry and automated image acquisition is an objective, high-throughput method for investigation of biomarkers within tissues.

Immunohistochemistry is a powerful lab technique for evaluating protein localization and expression within tissues. Current semi-automated methods for quantitation introduce subjectivity and often create irreproducible results. Herein, we describe methods for multiplexed immunohistochemistry and objective quantitation of protein expression and co-localization using multispectral imaging.

כימות של ביטוי חלבון ו Co-לוקליזציה שימוש חיסונית-histochemical Multiplexed מכתים והדמיה Multispectral

Immunohistochemistry is a commonly used clinical and research lab detection technique for investigating protein expression and localization within ...

Quantitative Localization of a Golgi Protein by Imaging Its Center of Fluorescence Mass

The Golgi complex consists of serially stacked membrane cisternae which can be further categorized into sub-Golgi regions, including the cis-Golgi, medial-Golgi, trans-Golgi and trans-Golgi network. Cellular functions of the Golgi are determined by the characteristic distribution of its resident proteins. The spatial resolution of conventional light microscopy is too low to resolve sub-Golgi structure or cisternae. Thus, the immuno-gold electron microscopy is a method of choice to localize a protein at the sub-Golgi level. However, the technique and instrument are beyond the capability of most cell biology labs. We describe here our recently developed super-resolution method called Golgi protein localization by imaging centers of mass (GLIM) to systematically and quantitatively localize a Golgi protein. GLIM is based on standard fluorescence labeling protocols and conventional wide-field or confocal microscopes. It involves the calibration of chromatic-shift aberration of the microscopic system, the image acquisition and the post-acquisition analysis. The sub-Golgi localization of a test protein is quantitatively expressed as the localization quotient. There are four main advantages of GLIM; it is rapid, based on conventional methods and tools, the localization result is quantitative, and it affords ~ 30 nm practical resolution along the Golgi axis. Here we describe the detailed protocol of GLIM to localize a test Golgi protein.

The precise localization of Golgi residents is essential for understanding the cellular functions of the Golgi. However, conventional optical microscopy is unable to resolve the sub-Golgi structure. Here we describe the protocol for a conventional microscopy based super-resolution method to quantitatively determine the sub-Golgi localization of a protein.

לוקליזציה כמותית של חלבון גולג'י על ידי הדמיה המסה מרכז של זריחה

The Golgi complex consists of serially stacked membrane cisternae which can be further categorized into sub-Golgi regions, including the cis-Golgi, ...

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These age-associated disorders are characterized by the appearance of protein aggregates with fibrillary structure in the brains of these patients. Exactly why normally soluble proteins undergo an aggregation process remains poorly understood. The discovery that protein aggregation is not limited to disease processes and instead part of the normal aging process enables the study of the molecular and cellular mechanisms that regulate protein aggregation, without using ectopically expressed human disease-associated proteins. Here we describe methodologies to examine inherent protein aggregation in Caenorhabditis elegans through complementary approaches. First, we examine how to grow large numbers of age-synchronized C. elegans to obtain aged animals and we present the biochemical procedures to isolate highly-insoluble-large aggregates. In combination with a targeted genetic knockdown, it is possible to dissect the role of a gene of interest in promoting or preventing age-dependent protein aggregation by using either a comprehensive analysis with quantitative mass spectrometry or a candidate-based analysis with antibodies. These findings are then confirmed by in vivo analysis with transgenic animals expressing fluorescent-tagged aggregation-prone proteins. These methods should help clarify why certain proteins are prone to aggregate with age and ultimately how to keep these proteins fully functional.

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

The goal of the method presented here is to explore protein aggregation during normal aging in the model organism C. elegans. The protocol represents a powerful tool to study the highly insoluble large aggregates that form with age and to determine how changes in proteostasis impact protein aggregation.

שיטות מחקר לשינויים הגלום צבירת חלבון עם הגיל ב Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...