Bu çalışmada kullanılan C. elegans suşları Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından - Office of araştırma altyapı programları (P40 OD010440) desteklenen Caenorhabditis genetik Merkezi'nden elde edilmiştir. Bu eser NIH tarafından desteklenmiştir: 1R03AG048578-01 Jun Liang, Jun Liang ve PSC CUNY-CCRG 1501-CUNY 66184-00 44 ve 67248-00 45 Jun Liang için. Cathy Savage-Dunn nazikçe onu laboratuvar alanı paylaşımı için teşekkür ederiz. Tüm floresans görüntüleri Queens Koleji çekirdek tesisinde toplanmıştır. William J. Rice el yazması üzerine onun yorum için teşekkür.

1. çözümler
<ol><li>
NGM plakaları
	<ol>
<li>Bir 2 L Erlenmeyer şişesi, NaCl, 3 g, agar 17 g, pepton 2.5 g ve dH2O. kapak alüminyum folyo ile balonun ağzı 975 mL ekleyin. Otoklav şişesi 50 dk. 20-30 dakika sakin ol.</li>
		<li>Sonra steril çözümleri ekleyin: 1 mL 1 M CaCl2, 5 mg/mL kolesterol etanol içinde 1 mL, 1 M MgSO41 mL ve 1 M KPO4 (pH 6.0) arabelleği 25 mL. Onları iyice karıştırın çözümleri girdap.</li>
		<li>Sıvı Sabunluk kullanarak, 60 mm Petri plakaları NGM çözümü dağıtmak. Ağar kaplamalar 2/3 tam dolgusuna. Onları ileride kullanmak üzere 4 ° C'de hava geçirmez bir kap içinde saklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
1 M KPO4 arabellek (pH 6.0)
	<ol>
<li>KH2PO4 10.83 g ve 3.56 g K2HPO4 ' te dH2O çalışma geçiyoruz, o zaman 100 ml toplam ses seviyesini. Basınçlı kap 15dk için çözüm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
M9
	<ol>
<li>3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO dağıtılması4ve 5 gram NaCl dH2O, 1 M MgSO41 mL ekleyin ve 1 m'ye toplam ses seviyesini</li>
	</ol>
</li>
	<li>
10 µg/mL DAPI
	<ol>
<li>10 mg/ml DAPI dH2O. 999 µL içine 1 µL Ekle</li>
	</ol>
</li>
	<li>
% 95 alkol (v/v)
	<ol>
<li>95 mL %100 alkol ölçmek ve ses seviyesini 100 ml distile su ekleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
% 30 aseton (v/v)
	<ol>
<li>30 mL aseton dH2için O ekleyin ve toplam ses seviyesini 100 ml.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. ısı stres
<ol><li>Hedef genlerin9,10translasyonel bir yapı ile bir extrachromosomal dizi satırı oluşturmak. Alternatif olarak, bu satırları üzerinden Caenorhabditis genetik Merkezi ( C. elegans araştırma için bir kamu kaynağı olan CGC), veya daha önce yayımlanmış araştırma laboratuvarı alabilirsiniz.</li>
	<li>Extrachromosomal satırları solucanlar 3.800 Rad γ-radyasyon9açarak genom entegre. Sonra her hayvan bir işaretleyici protein GFP veya silindir gibi ifade eder stabil ifade çizgileri seçin.</li>
	<li>Radyasyon sırasında oluşturulan mutasyonlar kaldırmak için çizgiler en az 2 outcross x. Protein ifade deseni değişiklikleri stres altında transgenik bu cümleyi.</li>
	<li>NGM solucan plakaları 1.1. adımda açıklandığı şekilde hazırlayın. Bir OP50 klon çizgi ve sıvı LB suyu bakterilerde gecede kültür. Solucanlar için bir besin kaynağı olarak bir bakteri çim büyümeye sıvı OP50 NGM pilakalar kültür ve 37 ° C kuluçka plakaları kuluçkaya tohum gecede. Plakalar için kullanmadan önce en az 30 dakika oda sıcaklığında sakin.</li>
	<li>20 ° C ısı stres tahlil öncesinde en az 2 nesiller için açlık olmadan transgenik satırında büyümek.</li>
	<li>8-10 genç gravid yetişkin (rahim yumurta ile dolu) bir yeni solucan plaka, sonra onları yumurtlamak için yaklaşık 3-5 h let için almak ve tüm yetişkin plakalar kaldırın.</li>
	<li>Solucanlar eşitlemek için yumurta yumurtadan ve larvaları yaklaşık 48 saat için dördüncü larva (L4) sahne alanı'na büyümeye izin. L4 sahne (Şekil 1, ok)11tanımlamak için onların vulva yapısı (yarım ay yapısı) inceleyin.</li>
	<li>Isı stres ulaşmak 2-5 h için 35 ° C kuluçka L4 larvaları ile solucan tabak koyun. Bir termometre doğru ısısını ölçmek için kuluçka makinesine koyun.</li>
</ol>3. DAPI boyama
<ol><li>
Etanol fiksasyon
	<ol>
<li>10 µL M9 arabelleği bir cam slayt ortasına ekleyin.</li>
		<li>Isı şok solucanlar adım 2.8 toplar ve onları koyardım M9 arabelleğine cam slayt üzerinde.<ol>
<li>Alternatif olarak, M9 ile plaka uzakta yıkama, 1000 x g oda sıcaklığında 1 dk. için de santrifüj kapasitesi ve süpernatant atmak. Solucanlar için cam slayt ekleyin.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Herhangi bir aşırı sıvı boşaltmak için yumuşak bir doku kullanın. Diseksiyon mikroskop altında bu adıma dikkat et.</li>
		<li>10 µL % 95 alkol solucanlar üzerine eklemek ve onları kurutma. Diseksiyon mikroskop altında süreci izlemek ve çok kuru olsun hayvan izin vermeyin. Sonra hemen etanol hayvanlardan buharlaşıp vardır, sonraki adıma geçin. Not: Etanol çok hızlı buharlaşır.</li>
		<li>Adımı yineleyin 3.1.4 iki kez böylece solucanlar sabit. Not: Bu hayvanlar için karanlık ve çarpık bakmak normaldir.</li>
		<li>DAPI 10 µL ekleyin (10 µg/mL) solucanlar için. Hemen onları bir coverslip ile karşılamak ve şeffaf oje jel içeren slaydı mühür.</li>
		<li>Floresan mikroskop üzerinde yaklaşık 10 dakika sonra hayvanlar görüntüleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Aseton fiksasyon (alternatif bir yaklaşım)
	<ol>
<li>Adım 2.8 M9 ile ısı şok plaka uzakta yıkama, 1000 x g oda sıcaklığında 1 dk. için de santrifüj kapasitesi ve süpernatant atmak. Pelet dH2O 1 mL ile yıkayın, Pelet toplamak ve süpernatant atın.</li>
		<li>1000 x g için oda sıcaklığında 1 dk 400 µL % 30 aseton 15 dk. santrifüj ekleyin ve süpernatant atın. Hayvanlar 2 yıkamak için dH2O 500 µL kullanın x. Süpernatant atmak.</li>
		<li>DAPI 200 µL ekleyin (10 µg/mL), veya 4 x tüp 15 dakika içinde toplam solucanlar birim miktarı.</li>
		<li>1000 x g 1 dk. için de santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın. Pelet 2 yıkama x 500 µL dH2O. ile solucanlar cam slaytlarda yer, onları coverslips ile karşılamak, şeffaf oje jel içeren slaydı mühür ve floresan mikroskop altında hayvanlar gözlemlemek.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. mikroskobik görüntüleme
<ol><li>UV ışık kaynağı ve floresan mikroskop açın. Mikroskop için bağlı olduğu bilgisayarda açın.</li>
	<li>Floresan mikroskop slaytta yükleyin. Solucanlar bulmak, 400 X büyütme gücünü arttırın ve numune üzerinde odaklanmak için bir düşük güç objektif lens (10 X) kullanın.</li>
	<li>Mikroskop ile sağlanan yazılımını açın. "Alma" menüsünde'ı tıklatın; "Kamera" tıklayın ve mikroskop için bağlı kamera seçin; Bu yazılım ile iletişim kurmak seçili kamera sağlar. Not: Farklı mikroskoplar işleminde değişiklik gösterebilir.</li>
	<li>Altında aynı "alma", "Çok boyutlu edinme"'ı tıklatın. Bu yeni bir "Çok boyutlu edinme" gezinti penceresi açar. "Çok kanallı" düğmesini ve tüm kanallar görüntülenir.</li>
	<li>Mavi, yeşil ve numune gözlemlemek için DIC (diferansiyel girişim kontrast) seçin. "Çok boyutlu edinme" Gezinti penceresinde "Mavi-DAPI", "Yeşil-GFP" ve "Gri-DIC", "Nomarski" kanallarda bırakın; "Kırmızı-rodamine" ve "beyaz parlak alan", gibi diğer kanallar sağ tıklayın onları kapatın.</li>
	<li>
İlk olarak, pozlama süresi her kanal için tedbir:
	<ol>
<li>Seçin ve sonra otomatik çekim hızı ile DAPI kanalın altında canlı bir görüntü çekmek için "Ölçü" tıklayın "Mavi-DAPI" kanal sol tıklatın. Canlı bir görüntü ile yeni bir pencere açılacaktır.</li>
		<li>Canlı görüntü penceresinin sol tarafında el ile istediğiniz gibi resim yapmak gerekirse çekim hızı ayarlayın.</li>
		<li>Son olarak "Tamam tıklayın" canlı görüntü penceresinde. Bu çekim hızı DAPI kanalın altında ayarlar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Diğer kanallar, "Yeşil-GFP" ve "Gri-pozlama süreleri bu kanallar için ayarlamak için DIC", "Nomarski" için 4,6 arasındaki adımları yineleyin.</li>
	<li>"Çok boyutlu edinme" Gezinti penceresinde otomatik olarak 3 resim sipariş (bkz. yukarıda) belirtildiği gibi belirli pozlama süreleri ile 3 farklı kanalların altında toplamak için "Başlat" tıklayın.</li>
	<li>Kurtarmak belgili tanımlık eğe için ana menüye gidin, "Dosya" ve sonra "Kaydet"'i tıklatın. Dosya adını ve klasör adını girin. İleride detaylı görüntüleme bilgileri korumak için varsayılan dosya biçimi olarak kaydedin.</li>
	<li>
Diğer biçimlerde dosyasını dışa aktarmak için:
	<ol>
<li>Gitgidmek "Eğe" ve tıkırtı üstünde "ihracat yapmak". Bu bir dışa aktarma ayarı pencere açılacaktır.</li>
		<li>Dosya adı ve klasör ayarlayın. "Bir proje klasörü için daha iyi oluşturmak" verileri düzenlemek kontrol edin. Yazılım aynı zamanda 4 diğer seçenekleri belirtmek kullanıcı sağlar: "Generate birleştirilmiş görüntüler"kanal görüntülerde renk kullanın",", "Kanal adları kullan" ve "Yalnızca birleştirilmiş resim".</li>
		<li>Açılan menüden "TIF", "BMP", "PSD", veya "JPG" ve diğer türleri gibi istediğiniz dosya türünü seçin. O zaman tıkırtı üstünde "ihracat Başlat".</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Essers, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FOXO+transcription+factor+activation+by+oxidative+stress+mediated+by+the+small+GTPase+Ral+and+JNK.">FOXO transcription factor activation by oxidative stress mediated by the small GTPase Ral and JNK.</a> The EMBO Journal. 23 (24), 4802-4812 (2004).</li><li>Oh, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JNK+regulates+lifespan+in+Caenorhabditis+elegans+by+modulating+nuclear+translocation+of+forkhead+transcription+factor/DAF-16.">JNK regulates lifespan in Caenorhabditis elegans by modulating nuclear translocation of forkhead transcription factor/DAF-16.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (12), 4494-4499 (2005).</li><li>Gross, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase+cleaved+BID+targets+mitochondria+and+is+required+for+cytochrome+c+release,+while+BCL-XL+prevents+this+release+but+not+tumor+necrosis+factor-R1/Fas+death.">Caspase cleaved BID targets mitochondria and is required for cytochrome c release, while BCL-XL prevents this release but not tumor necrosis factor-R1/Fas death.</a> The Journal of Biological Chemistry. 274 (2), 1156-1163 (1999).</li><li>Doerflinger, M., Glab, J. A., Puthalakath, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BH3-only+proteins:+a+20-year+stock-take.">BH3-only proteins: a 20-year stock-take.</a> The FEBS Journal. 282 (6), 1006-1016 (2015).</li><li>Mayorova, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+containing+aragonite+crystals+mediate+responses+to+gravity+in+Trichoplax+adhaerens+(Placozoa),+an+animal+lacking+neurons+and+synapses.">Cells containing aragonite crystals mediate responses to gravity in Trichoplax adhaerens (Placozoa), an animal lacking neurons and synapses.</a> PLoS One. 13 (1), e0190905 (2018).</li><li>Terron-Camero, L. C., Molina-Moya, E., Sanz-Fernandez, M., Sandalio, L. M., Romero-Puertas, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+reactive+oxygen+and+nitrogen+species+(ROS/RNS)+during+hypersensitive+cell+death.">Detection of reactive oxygen and nitrogen species (ROS/RNS) during hypersensitive cell death.</a> Methods in Molecular Biology. , 97-105 (2018).</li><li>Pedrazzini, E., Vitale, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+biosynthesis+and+maturation+in+the+ER.">Protein biosynthesis and maturation in the ER.</a> Methods in Molecular Biology. , 179-189 (2018).</li><li>Liang, J., Shaulov, Y., Savage-Dunn, C., Boissinot, S., Hoque, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloride+intracellular+channel+proteins+respond+to+heat+stress+in+Caenorhabditis+elegans.">Chloride intracellular channel proteins respond to heat stress in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS One. 12 (9), e0184308 (2017).</li><li>Evans, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+and+microinjection.">Transformation and microinjection.</a> Wormbook. , (2006).</li><li>Mello, C., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+transformation.">DNA transformation.</a> Methods in Cell Biology. 48, 451-482 (1995).</li><li>Yochem, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nomarski+images+for+learning+the+anatomy,+with+tips+for+mosaic+analysis.">Nomarski images for learning the anatomy, with tips for mosaic analysis.</a> Wormbook. , (2006).</li><li>Dulhunty, A., Gage, P., Curtis, S., Chelvanayagam, G., Board, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glutathione+transferase+structural+family+includes+a+nuclear+chloride+channel+and+a+ryanodine+receptor+calcium+release+channel+modulator.">The glutathione transferase structural family includes a nuclear chloride channel and a ryanodine receptor calcium release channel modulator.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276 (5), 3319-3323 (2001).</li><li>Suh, K. S., Malik, M., Shukla, A., Yuspa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLIC4,+skin+homeostasis+and+cutaneous+cancer:+surprising+connections.">CLIC4, skin homeostasis and cutaneous cancer: surprising connections.</a> Molecular Carcinogenesis. 46 (8), 599-604 (2007).</li><li>Yao, Q., Qu, X., Yang, Q., Wei, M., Kong, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLIC4+mediates+TGF-beta1-induced+fibroblast-to-myofibroblast+transdifferentiation+in+ovarian+cancer.">CLIC4 mediates TGF-beta1-induced fibroblast-to-myofibroblast transdifferentiation in ovarian cancer.</a> Oncology Reports. 22 (3), 541-548 (2009).</li><li>Ronnov-Jessen, L., Villadsen, R., Edwards, J. C., Petersen, O. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+a+chloride+intracellular+channel+gene,+CLIC4,+in+transforming+growth+factor-beta1-mediated+conversion+of+fibroblasts+to+myofibroblasts.">Differential expression of a chloride intracellular channel gene, CLIC4, in transforming growth factor-beta1-mediated conversion of fibroblasts to myofibroblasts.</a> The American Journal of Pathology. 161 (2), 471-480 (2002).</li><li>He, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+CLIC4+in+the+host+innate+responses+to+bacterial+lipopolysaccharide.">Role of CLIC4 in the host innate responses to bacterial lipopolysaccharide.</a> European Journal of Immunology. 41 (5), 1221-1230 (2011).</li><li>Zhong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+CLIC4+enhances+autophagy+and+triggers+mitochondrial+and+ER+stress-induced+apoptosis+in+human+glioma+U251+cells+under+starvation.">Inhibition of CLIC4 enhances autophagy and triggers mitochondrial and ER stress-induced apoptosis in human glioma U251 cells under starvation.</a> PLoS One. 7 (6), e39378 (2012).</li><li>Liang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+schnurri+homolog+sma-9+mediates+stage-+and+cell+type-specific+responses+to+DBL-1+BMP-related+signaling.">The Caenorhabditis elegans schnurri homolog sma-9 mediates stage- and cell type-specific responses to DBL-1 BMP-related signaling.</a> Development. 130 (26), 6453-6464 (2003).</li><li>Leopold, L. E., Heestand, B. N., Seong, S., Shtessel, L., Ahmed, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+pairing+during+meiosis+triggers+multigenerational+transgene+silencing+in+Caenorhabditis+elegans.">Lack of pairing during meiosis triggers multigenerational transgene silencing in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (20), E2667-E2676 (2015).</li><li>Schultz, R. D., Bennett, E. E., Ellis, E. A., Gumienny, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+extracellular+matrix+organization+by+BMP+signaling+in+Caenorhabditis+elegans.">Regulation of extracellular matrix organization by BMP signaling in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS One. 9 (7), e101929 (2014).</li><li>Matus, D. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasive+cell+fate+requires+G1+cell-cycle+arrest+and+histone+deacetylase-mediated+changes+in+gene+expression.">Invasive cell fate requires G1 cell-cycle arrest and histone deacetylase-mediated changes in gene expression.</a> Developmental Cell. 35 (2), 162-174 (2015).</li><li>Reddy, K. C., Villeneuve, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+HIM-17+links+chromatin+modification+and+competence+for+initiation+of+meiotic+recombination.">C. elegans HIM-17 links chromatin modification and competence for initiation of meiotic recombination.</a> Cell. 118 (4), 439-452 (2004).</li><li>Ames, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-cell-autonomous+role+of+BEC-1/BECN1/Beclin1+in+coordinating+cell-cycle+progression+and+stem+cell+proliferation+during+germline+development.">A non-cell-autonomous role of BEC-1/BECN1/Beclin1 in coordinating cell-cycle progression and stem cell proliferation during germline development.</a> Current Biology. 27 (6), 905-913 (2017).</li><li>Pekar, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+the+environment,+DAF-7/TGFbeta+signaling+and+LAG-2/DSL+ligand+expression+in+the+germline+stem+cell+niche.">Linking the environment, DAF-7/TGFbeta signaling and LAG-2/DSL ligand expression in the germline stem cell niche.</a> Development. 144 (16), 2896-2906 (2017).</li><li>Schvarzstein, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+helicase+HIM-6/BLM+both+promotes+MutSgamma-dependent+crossovers+and+antagonizes+MutSgamma-independent+interhomolog+associations+during+caenorhabditis+elegans+meiosis.">DNA helicase HIM-6/BLM both promotes MutSgamma-dependent crossovers and antagonizes MutSgamma-independent interhomolog associations during caenorhabditis elegans meiosis.</a> Genetics. 198 (1), 193-207 (2014).</li><li>Flemming, A. J., Shen, Z. Z., Cunha, A., Emmons, S. W., Leroi, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+polyploidization+and+cellular+proliferation+drive+body+size+evolution+in+nematodes.">Somatic polyploidization and cellular proliferation drive body size evolution in nematodes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (10), 5285-5290 (2000).</li><li>Nagamatsu, Y., Ohshima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+for+the+control+of+body+size+by+a+G-kinase+and+a+downstream+TGFbeta+signal+pathway+in+Caenorhabditis+elegans.">Mechanisms for the control of body size by a G-kinase and a downstream TGFbeta signal pathway in Caenorhabditis elegans.</a> Genes to Cells. 9 (1), 39-47 (2004).</li></ol>

Yazarlar bildirmek için bir şey yok.

Bu makale için çekirdek sitoplazma protein hücre altı değişiklikleri doğrulamak için hızlı ve etkili bir yöntem mevcuttur. Çekirdek yapı (Şekil 3) boyama DAPI tarafından doğrulandı ise protein ifade GFP füzyon tarafından gösterildi. İmmunostaining C. elegans proteinler zor olduğundan, çoğu C. elegans protein hücre altı yerelleştirmeler GFP, Laz, mCherry ve diğerleri gibi işaret proteinler ile etiketleyerek karakterizedir18,19 , 20 , 21. Bu makalede, gfp hedef gen exl-1 etiketlemek için onun protein hücrede yerleşimi göstermek için kullanılmıştır. Nükleer yerelleştirme onaylamak için DAPI boyama kullanıldı. İki farklı yöntemi sunuldu DAPI boyama için. Her ikisi de etkin bir şekilde iyi bir çalışma zaman çerçevesinde (az 1 h) solucanlar güçlü çekirdek gösterdi. Etanol fiksasyon (50'den az solucanlar toplama) bir kalite gözlem gibi bir küçük örnek koleksiyon için uygundur. Solucanlar tamamen kurumasını önlemek için anahtardır. Bir kez solucanlar % 95 alkol buharlaşır, hemen bir sonraki adıma geçin. Aseton fiksasyon (50'den fazla hayvan toplama) kantitatif analiz gibi büyük ölçekli örnek koleksiyonu için uygundur. Ancak, örnek yıkama birden çok adımı nedeniyle, bazı örnek kaybolacak. Böylece, dikkatle süpernatant kaldırmak ve mümkün olduğu kadar çok solucanlar korumak için önerilir. Bir kez onlar mühürlü, aseton fiksasyon kaynaklanan slaytlar 4 ° C'de bir hafta boyunca saklanabilir
Bu iletişim kuralı diğer proteinler hücre altı yerelleştirme değişiklikleri izlemek için faiz için ayarlanabilir. Burada sunulan ısı stres yanı sıra, diğer stres deneyleri, oksidatif stres, ağır metal stres, diyet kısıtlamaları ve diğerleri gibi tabi. Protein hücre altı yerelleştirme değişikliği de ilgi proteinin genetik arka plan değişikliği tarafından muayene. Örneğin, böylece roman genetik etkileşim tespit transgenik satır farklı bir mutantın arka plana geçti. RNA müdahale (RNAi) da belirli genler vurmak ve elde edilen protein hücre altı yerelleştirme değişiklik araştırmak için uygulanabilir. Bu uygulamalarını yeni düzenleyici bileşenleri tanımlamak için yüksek ilgi vardır. Bilinmeyen bir protein için çeşitli deneysel koşullar, test reaktif konsantrasyonları gibi stres süreyi ve solucanların belirli gelişim aşamalarında test edilmelidir. Bizim çalışmada, farklı süreler, 5 h ve farklı ısı stres sıcaklıklar 30 dk dan denedik. 35 ° c 3 h için bir ısı şok bir protein nükleer translocation açıkça göstermektedir.
DAPI boyama ek uygulamalar arasında mayoz ve mitoz işleminin incelenmesi germline hücreleri22,23,24,25, özellikle de solucan ve bir sayısı içinde çekirdek sayısı bir genetik mutantın arka plan20,26,27.

Protein hücre altı yerelleştirme değişikliği yanıt olarak dahili veya harici sinyaller ısı stres, açlık, oksidatif stres, apoptozis, protein fosforilasyon ve diğerleri gibi ortak bir mekanizmadır. Örneğin, ısı stres FOXO üye DAF-16 nükleer translocation1,2ve3,4sinyal alıcı ölümü üzerine mitokondri için teklif translocates pro-apoptotik BCL-2 protein neden olmaktadır. Çeşitli teknikler bu değişiklikleri algılamak kullanılabilir. Western blot ve biyokimyasal olarak izole hücre altı yapıları (Örneğin, mitokondri veya çekirdek) bir arada de hedef3elde edebiliriz. Ancak, spesifik bir antikor protein ilgi karşı gerektirir. Böylece, köklü bir antikor başarı için anahtar olur. Farklı hücre altı yapıları veya organelleri yeşil floresans protein (GFP), kırmızı floresans protein (RFP), sarı floresans protein (YFP) ve mCherry gibi çeşitli işaretçileri olan etiket ve bu arada protein etiket için alternatif bir yaklaşımdır ilgi diğer işaretleri ile. O zaman, onları hedef5,6yerelleştirmek için confocal mikroskop altında gözlemlemek. Radyoaktif izotoplar hedef proteinler etiketleme ve onların hücre altı yerelleştirme7algılama için alternatif bir seçimdir. Ancak, bu yöntem uygun eğitim ve radyoaktif atıkların işlenmesi gerekir. Spesifik bir antikor eksikliği, uygun bir işaretleyici yokluğu veya ekipman confocal mikroskop gibi scarceness gibi bu şartlar altında başka bir yaklaşım dikkate alınması gerekiyor. Protein nükleer translocation tanımlamak için sadece bir işaretleyici ile hedef proteinler etiketlemek için ve çekirdeklerin Kimyasal reaktif 4', 6-diamidino-2-phenylindole (Bu sadece normal floresan mikroskop gerektirdiğinden DAPI) ile leke için çekici.
Immunolabeling C. elegans antikorlar ile yumurta kabuğu veya hayvan çevreleyen kolajen kütikül düşük geçirgenliği nedeniyle meydan okuyor. Bu arada, C. elegans proteinler--dan onların omurgalı orthologs önemli ölçüde farklı olduğu için birkaç ticari şirketler ile belirli ürünler C. elegans sağlar. C. elegans antikorlar kendileri için üretmek küçük bir laboratuvar için zordur. Araştırmacılar toplumda sık sık tagged proteinler protein yerelleştirme veya gen ifade göstermek için imleyicileri kullanın. Bu makale EXL-1::GFP bir protein nükleer translocation ısı stres8altında izlemek için örnek olarak kullanılmıştır. Bir entegre translasyonel exl-1::gfp içine hayvan genom stabil gen gfp füzyon ile ifade etmek için kullanılır. Araştırma exl-1 bağırsak, vücut duvar kas ve diğer hücre altı yapıları8ifade edilir gösterdi. Bu iletişim kuralı, solucanlar dördüncü larva (L4) sahneye eşleştirir, ısı stres deney ve davranış DAPI boyama, etanol fiksasyonu, aseton fiksasyon ve görüntüleme düzenli floresan mikroskop altında gerçekleştirmek gösterilmiştir.

<table><tbody><tr><td>DAPI</td><td>Biotium</td><td>40043</td><td>both Hoechst 33258 and Hoechst 33342 also works well</td></tr><tr><td>OP50</td><td>CGC</td><td>OP50</td><td>https://cgc.umn.edu/</td></tr><tr><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td></td><td></td><td>https://cgc.umn.edu/</td></tr><tr><td>Kim Wipe</td><td>Kimberly-Clark Corporation</td><td></td><td>soft tissue</td></tr><tr><td>Zeiss&amp;nbsp; AX10</td><td>Zeiss</td><td></td><td>fluorescence microscope</td></tr><tr><td>Axiovision Rel 4.8</td><td>Zeiss</td><td></td><td>microscope software</td></tr><tr><td>AxioCam MR Rev3</td><td>Zeiss</td><td></td><td>digital camera</td></tr><tr><td>Incubator&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro centrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transparent nail polish gel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>60 mm petri dishes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass slides</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass coverslips</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-20 &amp;micro;L pipettor</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20-200 &amp;micro;L pipettor</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>200-1000 &amp;micro;L pipettor</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-200 &amp;micro;L pipet tips</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>200-1000 &amp;micro;L pipet tips</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Platinum wire worm pick</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

detecting protein subcellular localization by green fluorescence protein tagging and 4',6-diamidino-2-phenylindole staining in caenorhabditis elegans

Bu iletişim kuralı, bir yeşil floresans protein (GFP) füzyon protein ve 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) boyama protein hücre altı yerelleştirme değişiklikleri; izlemek için kullanılır Özellikle, bir ısı altında nükleer translocation stres durumu. Proteinler buna bağlı olarak dış ve iç sinyalleri tepki. Onun hücre altı yerelleştirme değiştirmek için ortak bir mekanizmadır. Bu makalede bir antikor, radyoaktif etiketleme veya confocal mikroskop gerektirmez protein yerelleştirme izlemek için bir iletişim kuralı. Bu makalede, GFP memeli CLIC4 de dahil olmak üzere klorür hücre içi kanal proteinleri (CLICs) ailesinin C. elegans, üye EXL-1 hedef protein etiketlemek için kullanılır. Bir entegre translasyonel exl-1::gfp transgenik satır (bir organizatörü ve tam gen sıralaması) dönüştürme ve γ-radyasyon tarafından oluşturulmuş ve stabil gfpve gen ifade eder. Son araştırma ısı stres, değil oksidatif stres, EXL-1::GFP çekirdeğinde biriken gösterdi. GFP sinyal çekirdek yapısı ve DAPI ile örtüşen sinyalleri stres altında EXL-1 hücre altı yerelleştirme değişiklikleri onaylar. Bu iletişim kuralı DAPI boyama için iki farklı fiksasyon yöntemi sunar: etanol fiksasyon ve aseton fiksasyon. Bu makalede sunulan DAPI boyama iletişim kuralı hızlı ve verimli ve GFP sinyal hem protein hücre altı yerelleştirme değişiklikleri korur. Bu yöntem yalnızca Nomarski, FITC filtre ve DAPI filtre ile floresan mikroskop gerektirir. Bir küçük laboratuvar ayarı, lisans öğrencisi araştırma, lise öğrenci araştırma ve biyoteknoloji derslik için uygundur.

Klorür hücre içi kanal proteinler (klik) türler12arasında son derece korunmuş çok fonksiyonlu proteinlerdir. CLICs hücresel stres, autophagy, apoptozis, karsinojenezis, anjiogenez ve makrofaj doğuştan gelen bağışıklık yanıtı memeli sistem13,14,15,16 düzenleyen çok araştırma gösterir ,17. C. elegansiçinde iki CLIC homologs vardır: exl-1 ve hariç-4. Bizim yeni çalışma exl-1 hayvan stres yönetimi8düzenleyen gösterdi. Biz bir translasyonel exl-1::gfp yapı bir hayvan genom entegre ve stabil bir GFP ile gen exl-1 (Şekil 2A ve 2B) bir işareti olarak ifade transgenik satırlarının oluşturulduğu. Güçlü GFP sinyal çekirdek yapısı ile (2 C - anlaE) ile çakışıyor bu yana ısı stres altında EXL-1::GFP çekirdeği bağırsak bölgesinde birikir. Hücre altı yerelleştirme onaylamak için DAPI boyama bir yaklaşım çekirdeklerin leke için kullanıldı. Etanol fiksasyon DAPI boyama gösterir açık çekirdeği hayvan vücuttaki (Şekil 3B) için kullanma. Aseton fiksasyon da benzer sonuçlar (Şekil 3E) elde. Üst üste gelen GFP ve DAPI sinyalleri EXL-1::GFP gerçekten çekirdek (Şekil 3 c, F) bağırsak bölgesinde birikmiş onaylayın.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57914/57914fig1.jpg"> Resim 1: Bir dördüncü larva (L4) görüntülerini C. elegans farklı büyütme güçleri altında sahne. (A) 63 X, (B) 115 X ve (C) 400 X büyütme gücü. Oklar L4 solucan vulva işaret; yarım ay yapısı unutmayın. Ölçek çubuğu tüm görüntülerde 100 µm =. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57914/57914fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57914/57914fig2.jpg"> Şekil 2: ısı stres altında EXL-1::GFP bağırsak çekirdekleri içinde birikir. Isı şok önce bir bağırsak bölgesinin (A) Normaski görüntü. (B) güçlü bir GFP sinyal instestinal bölgesinde Isı şok önce gözlendi. (C) Normaski görüntü Isı şok (çekirdeklerin okları gelin bağırsak bölgesinin) sonra bağırsak bölgesinin. (D) güçlü bir GFP sinyal ısı şoktan sonra birikir. (E) görüntü GFP ve Normaski denk geliyor. Tüm fotoğraflar 400 X büyütme gücü ile çekilmiştir. Ölçek çubuğu tüm görüntülerde 50 µm =. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57914/57914fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57914/57914fig3.jpg"> Şekil 3: EXL-1::GFP nükleer translocation olduğunu doğruladı tarafından DAPI boyama. (A-C) Etanol fiksasyon DAPI boyama için kullanma. (D-F) Aseton fiksasyon DAPI boyama için kullanma. A ve Dyeşil renk GFP sinyal bağırsak bölgesinde gösterir. B ve E, mavi renk DAPI boyama tarafından çekirdek gösterir. C ve F GFP, DAPI ve Normaski üst üste gelen görüntülerini göster. Ölçek çubuğu tüm görüntülerde 50 µm =. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57914/57914fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Ek şekil: Numune aseton fiksasyon korur ve 60 gün sonra aseton fiksasyon, GFP ve DAPI hala observable sinyaller. (A) için GFP yeşildir. (B) mavi için DAPI sinyaldir. (C) görüntü GFP, DAPI ve DIC denk geliyor. Tüm resimler altında 400 X büyütme güç alınır. Ölçek çubuğu 50 mikron =. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57914/supplemental_figure.pdf">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Detecting Protein Subcellular Localization by Green Fluorescence Protein Tagging and 4',6-Diamidino-2-phenylindole Staining in Caenorhabditis elegans at JoVE.

Detecting Protein Subcellular Localization by Green Fluorescence Protein Tagging and 4',6-Diamidino-2-phenylindole Staining in Caenorhabditis elegans

Bu iletişim kuralı bir protein nükleer translocation ısı stres altında bir yeşil floresans protein (GFP) füzyon proteini bir işaretleyici olarak ve 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) kullanarak izlemek gösterilmiştir boyama. İletişim kuralı boyama DAPI hızlı ve GFP ve protein hücre altı yerelleştirme sinyalleri korur.

Protein hücre altı yerelleştirme yeşil floresans Protein etiketleme ve 4', 6-Diamidino-2-phenylindole Caenorhabditis elegans içinde boyama tarafından tespit

In this protocol, a green fluorescence protein (GFP) fusion protein and 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) staining are used to track protein ...

detecting-protein-subcellular-localization-green-fluorescence-protein

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

Detecting Protein Subcellular Localization by Green Fluorescence Protein Tagging and 4',6-Diamidino-2-phenylindole Staining in Caenorhabditis elegans

9.5K Görüntüleme.  Borough of Manhattan Community College/CUNY. Bu iletişim kuralı bir protein nükleer translocation ısı stres altında bir yeşil floresans protein (GFP) füzyon proteini bir işaretleyici olarak ve 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) kullanarak izlemek gösterilmiştir boyama. İletişim kuralı boyama DAPI hızlı ve GFP ve protein hücre altı yerelleştirme sinyalleri korur.

Video: Detecting Protein Subcellular Localization by Green Fluorescence Protein Tagging and 4',6-Diamidino-2-phenylindole Staining in Caenorhabditis elegans

The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging

The four C. elegans excretory canals are narrow tubes extended through the length of the animal from a single cell, with almost equally far extended intracellular endotubes that build and stabilize the lumen with a membrane and submembraneous cytoskeleton of apical character. The excretory cell expands its length approximately 2,000 times to generate these canals, making this model unique for the in vivo assessment of de novo polarized membrane biogenesis, intracellular lumen morphogenesis and unicellular tubulogenesis. The protocol presented here shows how to combine standard labeling, gain- and loss-of-function genetic or RNA interference (RNAi)-, and microscopic approaches to use this model to visually dissect and functionally analyze these processes on a molecular level. As an example of a labeling approach, the protocol outlines the generation of transgenic animals with fluorescent fusion proteins for live analysis of tubulogenesis. As an example of a genetic approach, it highlights key points of a visual RNAi-based interaction screen designed to modify a gain-of-function cystic canal phenotype. The specific methods described are how to: label and visualize the canals by expressing fluorescent proteins; construct a targeted RNAi library and strategize RNAi screening for the molecular analysis of canal morphogenesis; visually assess modifications of canal phenotypes; score them by dissecting fluorescence microscopy; characterize subcellular canal components at higher resolution by confocal microscopy; and quantify visual parameters. The approach is useful for the investigator who is interested in taking advantage of the C. elegans excretory canal for identifying and characterizing genes involved in the phylogenetically conserved processes of intracellular lumen and unicellular tube morphogenesis.

The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging

The C. elegans excretory canal is a unique single-cell model for the visual in vivo analysis of de novo polarized membrane biogenesis. This protocol describes a combination of standard genetic/RNAi and imaging approaches, adaptable for the identification and characterization of molecules directing unicellular tubulogenesis, and apical membrane and lumen biogenesis.

C. elegans Excretory kanal hücre içi Lumen morfogenez ve In Vivo polarize membran Biyogenez tek bir hücrede için bir Model olarak: etiketleme GFP-füzyon, RNAi etkileşimi ekran ve görüntüleme

The four C. elegans excretory canals are narrow tubes extended through the length of the animal from a single cell, with almost equally far extended ...

Gelişim Biyolojisi

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein are molecular motors that regulate anterograde and retrograde transport, respectively. These motors use microtubule networks as rails. Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a powerful model organism to study axonal transport and IFT in vivo. Here, I describe a protocol to observe axonal transport and IFT in living C. elegans. Transported cargo can be visualized by tagging cargo proteins using fluorescent proteins such as green fluorescent protein (GFP). C. elegans is transparent and GFP-tagged cargo proteins can be expressed in specific cells under cell-specific promoters. Living worms can be fixed by microbeads on 10% agarose gel without killing or anesthetizing the worms. Under these conditions, cargo movement can be directly observed in the axons and cilia of living C. elegans without dissection. This method can be applied to the observation of any cargo molecule in any cells by modifying the target proteins and/or the cells they are expressed in. Most basic proteins such as molecular motors and adaptor proteins that are involved in axonal transport and IFT are conserved in C. elegans. Compared to other model organisms, mutants can be obtained and maintained more easily in C. elegans. Combining this method with various C. elegans mutants can clarify the molecular mechanisms of axonal transport and IFT.

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a good model to study axonal and intracellular transport. Here, I describe a protocol for in vivo recording and analysis of axonal and intraflagellar transport in C. elegans.

Caenorhabditis elegans nöron hücre içi taşıma analiz immobilizasyon

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

C. elegans Gonad Dissection and Freeze Crack for Immunofluorescence and DAPI Staining

The C. elegans germline makes an excellent model for studying meiosis, in part due to the ease of conducting cytological analyses on dissected animals. Whole mount preparations preserve the structure of meiotic nuclei, and importantly, each gonad arm contains all stages of meiosis, organized in a temporal-spatial progression that makes it easy to identify nuclei at different stages. Adult hermaphrodites have two gonad arms, each organized as a closed tube with proliferating germline stem cells at the distal closed end and cellularized oocytes at the proximal open end, which join in the center at the uterus. Dissection releases one or both gonad arms from the body cavity, allowing the entirety of meiosis to be visualized. Here, a common protocol for immunofluorescence against a protein of interest is presented, followed by DAPI staining to mark all chromosomes. Young adults are immobilized in levamisole and quickly dissected using two syringe needles. After germline extrusion, the sample is fixed before undergoing a freeze crack in liquid nitrogen, which helps permeabilize the cuticle and other tissues. The sample can then be dehydrated in ethanol, rehydrated, and incubated with primary and secondary antibodies. DAPI is added to the sample in the mounting medium, which allows reliable visualization of DNA and makes it easy to find animals to image under a fluorescent microscope. This technique is readily adopted by those familiar with handling C. elegans after a few hours spent practicing the dissection method itself. This protocol has been taught to high-schoolers and undergraduates working in a research lab and incorporated into a course-based undergraduate research experience at a liberal arts college.

C. elegans Gonad Dissection and Freeze Crack for Immunofluorescence and DAPI Staining

This is a commonly used method for C. elegans gonad dissection followed by freeze crack, which produces germline samples for immunofluorescence via antibody staining, or for simple DAPI staining to visualize DNA. This protocol has been successful for undergraduates in a research lab and in a course-based undergraduate research experience.

C. elegans · İmmünofloresan ve DAPI Boyama için Gonad Diseksiyonu ve Dondurucu Çatlak

The C. elegans germline makes an excellent model for studying meiosis, in part due to the ease of conducting cytological analyses on dissected animals. ...

Genetik

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

C. vivo Nöronal Kalsiyum Imaging&#39;de elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Nörobilim

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

During the aging process, many cells accumulate high levels of damage leading to cellular dysfunction, which underlies many geriatric and pathological conditions. Post-mitotic neurons represent a major cell type affected by aging. Although multiple mammalian models of neuronal aging exist, they are challenging and expensive to establish. The roundworm Caenorhabditis elegans is a powerful model to study neuronal aging, as these animals have short lifespan, an available robust genetic toolbox, and well-cataloged nervous system. The method presented herein allows for seamless isolation of specific cells based on the expression of a transgenic green fluorescent protein (GFP). Transgenic animal lines expressing GFP under distinct, cell type-specific promoters are digested to remove the outer cuticle and gently mechanically disrupted to produce slurry containing various cell types. The cells of interest are then separated from non-target cells through fluorescence-activated cell sorting, or by anti-GFP-coupled magnetic beads. The isolated cells can then be cultured for a limited time or immediately used for cell-specific ex vivo analyses such as transcriptional analysis by real time quantitative PCR. Thus, this protocol allows for rapid and robust analysis of cell-specific responses within different neuronal populations in C. elegans.

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

Here, we present a protocol for simple isolation of specific groups of live neuronal cells expressing green fluorescent protein from transgenic Caenorhabditis elegans lines. This method enables a variety of ex vivo studies focused on specific neurons and has the capacity to isolate cells for further short-term culturing.

Roundworm Caenorhabditis elegans belirli neuron nüfus yalıtım

During the aging process, many cells accumulate high levels of damage leading to cellular dysfunction, which underlies many geriatric and pathological ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

Erken Embriyo Oluşumu Zaman atlamalı Mikroskopi Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Biyoloji

RNA Fluorescence in situ Hybridization (FISH) to Visualize Microbial Colonization and Infection in Caenorhabditis elegans Intestines

The intestines of wild Caenorhabditis nematodes are inhabited by a variety of microorganisms, including gut microbiome bacteria and pathogens, such as microsporidia and viruses. Because of the similarities between Caenorhabditis elegans and mammalian intestinal cells, as well as the power of the C. elegans system, this host has emerged as a model system to study host intestine-microbe interactions in vivo. While it is possible to observe some aspects of these interactions with bright-field microscopy, it is difficult to accurately classify microbes and characterize the extent of colonization or infection without more precise tools. RNA fluorescence in situ hybridization (FISH) can be used as a tool to identify and visualize microbes in nematodes from the wild or to experimentally characterize and quantify infection in nematodes infected with microbes in the lab. FISH probes, labeling the highly abundant small subunit ribosomal RNA, produce a bright signal for bacteria and microsporidian cells. Probes designed to target conserved regions of ribosomal RNA common to many species can detect a broad range of microbes, whereas targeting divergent regions of the ribosomal RNA is useful for narrower detection. Similarly, probes can be designed to label viral RNA. A protocol for RNA FISH staining with either paraformaldehyde (PFA) or acetone fixation is presented. PFA fixation is ideal for nematodes associated with bacteria, microsporidia, and viruses, whereas acetone fixation is necessary for the visualization of microsporida spores. Animals were first washed and fixed in paraformaldehyde or acetone. After fixation, FISH probes were incubated with samples to allow for the hybridization of probes to the desired target. The animals were again washed and then examined on microscope slides or using automated approaches. Overall, this FISH protocol enables detection, identification, and quantification of the microbes that inhabit the C. elegans intestine, including microbes for which there are no genetic tools available.

RNA Fluorescence in situ Hybridization FISH to Visualize Microbial Colonization and Infection in Caenorhabditis elegans Intestines

Intestinal microbes, including extracellular bacteria and intracellular pathogens like the Orsay virus and microsporidia (fungi), are often associated with wild Caenorhabditis nematodes. This article presents a protocol for detecting and quantifying microbes that colonize and/or infect C. elegans nematodes, and for measuring pathogen load after controlled infections in the lab.

Caenorhabditis elegans Bağırsaklarında Mikrobiyal Kolonizasyon ve Enfeksiyonu Görselleştirmek için RNA Floresan in situ Hibridizasyon (FISH)

The intestines of wild Caenorhabditis nematodes are inhabited by a variety of microorganisms, including gut microbiome bacteria and pathogens, such as ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age are significant public health burdens. We currently understand little about the genetic regulation of muscle health with disease or age. The nematode C. elegans is an established model for understanding the genomic regulation of biological processes of interest. This worm&#8217;s body wall muscles display a large degree of homology with the muscles of higher metazoan species. Since C. elegans is a transparent organism, the localization of GFP to mitochondria and sarcomeres allows visualization of these structures in vivo. Similarly, feeding animals cationic dyes, which accumulate based on the existence of a mitochondrial membrane potential, allows the assessment of mitochondrial function in vivo. These methods, as well as assessment of muscle protein homeostasis, are combined with assessment of whole animal muscle function, in the form of movement assays, to allow correlation of sub-cellular defects with functional measures of muscle performance. Thus, C. elegans provides a powerful platform with which to assess the impact of mutations, gene knockdown, and/or chemical compounds upon muscle structure and function. Lastly, as GFP, cationic dyes, and movement assays are assessed non-invasively, prospective studies of muscle structure and function can be conducted across the whole life course and this at present cannot be easily investigated in vivo in any other organism.

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Skeletal muscle is essential for locomotion and is the bodies&#8217; main protein store. Muscle health measurements within C. elegans are described. Prospective changes to muscle structure and function are assessed using localized GFP and cationic dyes.

Yöntemler içinde Muscle hücrealtı Kompartmanları DeğerlendirecekÜSKÜP<em&gt; ° C. elegans</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a crucial component of intracellular signaling. The visualization of subcellular Ca2+ dynamics in vivo,&#160;where neurons can be studied in their native, intact circuitry, has proven technically challenging in complex nervous systems. The transparency and relatively simple nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans enable the cell-specific expression and in vivo visualization of fluorescent tags and indicators. Among these are fluorescent indicators that have been modified for use in the cytoplasm as well as various subcellular compartments, such as the mitochondria. This protocol enables non-ratiometric Ca2+ imaging in vivo with a subcellular resolution that permits the analysis of Ca2+ dynamics down to the level of individual dendritic spines and mitochondria. Here, two available genetically encoded indicators with different Ca2+ affinities are used to demonstrate the use of this protocol for measuring relative Ca2+ levels within the cytoplasm or mitochondrial matrix in a single pair of excitatory interneurons (AVA). Together with the genetic manipulations and longitudinal observations possible in C. elegans, this imaging protocol may be useful for answering questions regarding how Ca2+ handling regulates neuronal function and plasticity.

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

The current methods describe a non-ratiometric approach for high-resolution, sub-compartmental calcium imaging in vivo in Caenorhabditis elegans using readily available genetically encoded calcium indicators.

Nöronal Kalsiyum Kullanımının In Vivo Subsellüler Görüntülemesi

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a ...

Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans

Defining the cellular mechanisms underlying disease is essential for the development of novel therapeutics. A strategy frequently used to unravel these mechanisms is to introduce mutations in candidate genes and qualitatively describe changes in the morphology of tissues and cellular organelles. However, qualitative descriptions may not capture subtle phenotypic differences, might misrepresent phenotypic variations across individuals in a population, and are frequently assessed subjectively. Here, quantitative approaches are described to study the morphology of tissues and organelles in the nematode Caenorhabditis elegans using laser scanning confocal microscopy combined with commercially available bio-image processing software. A quantitative analysis of phenotypes affecting synapse integrity (size and integrated fluorescence levels), muscle development (muscle cell size and myosin filament length), and mitochondrial morphology (circularity and size) was performed to understand the effects of genetic mutations on these cellular structures. These quantitative approaches are not limited to the applications described here, as they could readily be used to quantitatively assess the morphology of other tissues and organelles in the nematode, as well as in other model organisms.

Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans

This study outlines quantitative measurements of synaptic size and localization, muscle morphology, and mitochondrial shape in C. elegans using freely available image processing tools. This approach allows future studies in&#160;C. elegans&#160;to quantitatively compare the extent of tissue and organelle structural changes as a result of genetic mutations.

Caenorhabditis elegans hücresel yapıları ve organelle morfoloji eğitim için nicel yaklaşımlar

Defining the cellular mechanisms underlying disease is essential for the development of novel therapeutics. A strategy frequently used to unravel these ...

Protein hücre altı yerelleştirme yeşil floresans Protein etiketleme ve 4', 6-Diamidino-2-phenylindole Caenorhabditis elegans içinde boyama tarafından tespit

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler