ברצוננו להודות במימון המכון הלאומי לבריאות (R15 GM065444-03 ל LB) ואת תוכנית המחקר עירונית של המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) והמכון הלאומי של סוכרת עיכול מחלות כליה (KO). הפרס NSF (DBI-0923402) מימנה את רכישת מיקרוסקופ LSM700 confocal. אנחנו רוצים גם להודות סיוע כללי הערות מועילות על כתב היד של ד&quot;ר אנדי הזהב. אשראי הולך כולו C. elegans הקהילה שיתוף משאבים, פרוטוקולים, ורעיונות.

<html> 1. נמטודות תרבויות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג את ג המתאימה elegans זן של גנטיקה Caenorhabditis במלאי מרכז (CGC) או מעמית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול נמטודות על צלחות אגר NGM seeded עם דשא בקטריאלי OP50 (3). לניתוח של צמיחה זני ה-GFP של 25 ° C מומלץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום לפני הניסוי מיקרוסקופיה שלך, לקחת לפחות 40 L4 הזחלים על גבי צלחות seeded והמקום צלחות של 25 ° C במשך הלילה. תולעים אלה יהיו צעירים לצורך הניסוי. </li></ol> 2. זריקות אם רצוי להציג מבנים כגון lysosomes או המיטוכונדריה, מבוגרים ניתן להזריק עם צבע פלואורסצנטי לפני להדמיה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן יבשים רפידות agarose ההזרקה. (זה יכול להיעשות אחת ימים רבים מראש) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן agarose 2% מותכת במים. בעזרת פיפטה פסטר לשים 2 טיפות על coverglass 22X54 מ&quot;מ. מקום אחר coverglass צולבות חכם על גבי הירידה. על מנת להשיג את העובי הנכון, לחץ על coverglass העליון עד קוטר של כרית הוא סביב 1.5 ס&quot;מ. בואו לשבת במשך 5-10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר coverglass העליון. מייבשים את הפנקס agarose ידי הצבת אותו בתנור 80 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 או לאפשר לשבת על benchtop לילה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן Mitotracker או פתרון Lysotracker. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל סוכן ניאון הצפת ביצה. אנו משתמשים בדרך כלל דילול של 1:10 Mitotracker או Lysotracker. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המחט להזרקת עשוי זכוכית 1.2 OD נימי. משוך את המחט להזרקת חולץ באמצעות מחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש pipet Pastuer משך לגבות למלא את המחט עם צבע מדולל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום מחט בתא, אור ללא humidified עד לשימוש. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום הזרקה: הגדרת מיקרוסקופ מחט. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר מחט הזריקה על מנגנון ההזרקה. המנגנון שלנו היא micromanipulator כונן ישיר Narishige רכוב על הבמה של מיקרוסקופ Nikon TE200 הפוך מצויד יכולת ההדמיה DIC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את המחט צינור 1.2 מ&quot;מ מזהה שמחובר וסת הלחץ. או אוויר דחוס או חנקן יכול לשמש מקור לחץ חיצוני. הגדר את הרגולטור כדי 20-25 psi. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום 2 טיפות של שמן מינרלי כבד (שמן Parafin) על גבי משטח הזריקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את כרית הזרקה אל המיקרוסקופ ולהפחית את המחט לתוך השמן. בדוק כדי לוודא זורם נוזל בחופשיות מן המחט כאשר הלחץ מוחל. החל הלחץ הזרקת ולבחון אם הנוזל זורם החוצה של המחט. אם לא, תצטרך לשבור בעדינות את קצה המחט. המחט ניתן לשבור על ידי נהיגה בעדינות את קצה לתוך קצת קטנה של coverglass שבור מונח על כרית ההזרקה. אחרי המחט זורם, לעבור לשלב הבא. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרקה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כ 1 שעה לפני עוברים צפייה, העברת תולעים בוגרות צעירות לתוך טיפת שמן על משטח הזריקה. לבצע את ההעברה באמצעות מיקרוסקופ לנתח. השתמש חוט פלטינה תולעת לבחור עם קצה מחודד עבור העברת תולעים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סדר 3-10 תולעים, כך שהם משקרים ישירות על הנייר. עבור זריקה, זה הכי קל אם התולעים מסודרים במקביל אחד לשני קצת פחות אורך תולעת מזה. לאחר תולעים הן על משטח הזרקת חשוב לעבוד במהירות להשלמת תהליך ההזרקה לפני התולעים להיכחד מן התייבשות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את coverglass עם תולעים לבמה מיקרוסקופ של המיקרוסקופ ההזרקה. פוקוס על החלק המרכזי (rachis) של הצינור אשך דיסטלי. לאחר מכן השתמש micromanipulator להזיז את קצה המחט לתוך המטוס מוקד זהה. הזז את הבמה בצורה אופקית, כך התולעת הוא ניקב ידי המחט. לאחר קצה המחט נמצא בתוך rachis, להפעיל לחץ ולאפשר אשך כדי למלא בתערובת לצבוע. הזרק שתי הזרועות בלוטת המין של תולעים כל על כרית ההזרקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ההזרקה, השתמש pipet משך פסטר לספק כ 0.5 מ&quot;ל של הצפת ביצה של תולעים. זה יהיה למנוע מהם מת מהתייבשות ולאפשר להם להתאושש הליך ההזרקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר התולעים להתאושש במשך 1-2 שעות בטמפרטורת החדר בתא, אור ללא humidified. </li></ol></li></ol> 3. Agarose לרפד עבור צפייה בעוברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן agarose 2% מותך הצפת ביצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם pipet פסטר, לשים 3 טיפות agarose מותכת לשקופית מיקרוסקופ נקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום להחליק בין שתי שקופיות אחרות, כי יש שכבה אחת של תיוג קלטת מכסה אותם. אלה משמשים מפרידי שיבטיחו כרית agarose שלך ​​הוא עובי הנכון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים השקופית השניה מיקרוסקופ נקי בניצב מטה אל טיפות agarose. לחץ כלפי מטה עד השקופית העליונה מוטלת על קלטת משקופיות מדריך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רגע לפני שאתם מוכנים לעלות עוברים להסתכלות, להסיר את החלק העליון. </li></ol>ילדה = &quot;jove_title&quot;&gt; 4. עוברים הרכבה לצפייה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם תולעים לא היה מוזרק, בצע את שני השלבים הבאים. אחרת לדלג עליהם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר תולעים בוגרות צעירות מהצלחת כי הוכן יום קודם לכן. אתה אמור להיות מסוגל לראות את העוברים בתוך ומבוגרים צעירים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיק 5-20 תולעים לצלחת NGM unseeded. אפשר התולעים לזחול על הצלחת unseeded במשך כמה דקות, כך התולעים תאבד את רוב החיידקים הוא תקוע איתם. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג עוברים צעירים תולעים בוגרות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום טיפה 5-20 μl של הצפת ביצה באמצע coverglass 18 2 כוס מ&quot;מ (עובי של 1.5 coverglass עדיפה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר תולעים מהצלחת unseeded או כרית זריקה לתוך ירידה של הצפת ביצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גזור תולעים לפתוח עם מחט המזרק 26 מד. גזור לפתוח את תולעת ליד הפות. אתה צריך לראות את העוברים נשפכים מתוך התולעת. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר לשקופית מיקרוסקופ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את השקופית מיקרוסקופ שהוכנה עם כרית agarose ומוריד אותה אל coverglass עם עוברי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם זמן לשגות המורחבת נדרש, להשתמש בווזלין כדי לאטום את הקצוות של coverglass כדי למנוע dessication. </li></ol></li></ol> 5. מיקרוסקופיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מציאת העובר המתאים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום להחליק על הבמה מיקרוסקופ. סרוק עם עדשה 10X למצוא עוברי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למצוא עוברים בשלב מוקדם, לחפש, כי הם עוברים תהליך של השלמת המיוזה אימהית. עוברים meiotic ניתן להבחין מעוברים מאוחר יותר כי הם לא עברו קיצור. (אחרי העוברים סיימו המיוזה, ניתן לראות פער משמעותי בין קרום התא לבין קליפת ביצה בקצה הקדמי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שיש לך זיהה כראוי מבוים העובר, לעבור עדשה ההגדלה גבוה יותר עבור הקלטה של ​​העובר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוגמה זו, אנו עוברים לדמיין המבטאים את mCherry: H2B ו-GFP: החלבונים המתויגים UB. אנו משתמשים LSM700 Zeiss מיקרוסקופ סורק לייזר קונבנציונלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונות נאספים באמצעות עדשה 1.4NA 63X. 488 ו 555 לייזרים משמשים עם כוח לייזר מינימלי ולהשיג מקסימלית. מחסנית AZ נאסף כל 10-15 שניות. בהתאם להיקף photobleaching, 30-60 נקודות הזמן נאספים. תמונות Z מחסנית הם התמוטטו לתוך תמונה הקרנה המקסימלי וידאו זמן לשגות הסופי. </li></ol></li></ol> 6. נציג תוצאות: <img src="/files/ftp_upload/2852/2852fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. הפריה כדי מיטוזה ראשונה ב C. elegans. <img src="/files/ftp_upload/2852/2852fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. Microinjection ההליך. וידאו משלים 1 זמן לשגות הווידאו של ה-GFP:.. כחול היוביקוויטין פלוס Lysotracker בעובר meiotic <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2852/2852fig3.avi">לחץ כאן כדי להציג את הווידאו.</a>

<ol>
	<li>Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+stable+transgenic+C.+elegans+using+microinjection.">Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection.</a> J Vis Exp. (18), e833-e833 (2008).</li><li>Hochbaum, D., Ferguson, A. A., Fisher, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Transgenic+C.+elegans+by+Biolistic+Transformation.">Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation.</a> J Vis Exp. (42), e2090-e2090 (2010).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Genetics+of+Caenrohabditis+elegans.">The Genetics of Caenrohabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li><li>Oegema, K., Hyman, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+division+WormBook.">Cell division WormBook.</a> , (2006).</li><li>McNally, K. L., McNally, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertilization+initiates+the+transition+from+anaphase+I+to+metaphase+II+during+female+meiosis+in+C.+elegans.">Fertilization initiates the transition from anaphase I to metaphase II during female meiosis in C. elegans.</a> Dev Biol. 282, 218-230 (2005).</li><li>Sato, K., Sato, M., Audhya, A., Oegema, K., Schweinsberg, P., Grant, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+regulation+of+caveolin-1+trafficking+in+the+germ+line+and+embryo+of+Caenorhabditis+elegans.">Dynamic regulation of caveolin-1 trafficking in the germ line and embryo of Caenorhabditis elegans.</a> Mol Biol Cell. 17, 3085-3094 (2006).</li><li>Stitzel, M. L., Pellettieri, J., Seydoux, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C.+elegans+DYRK+Kinase+MBK-2+Marks+Oocyte+Proteins+for+Degradation+in+Response+to+Meiotic+Maturation.">The C. elegans DYRK Kinase MBK-2 Marks Oocyte Proteins for Degradation in Response to Meiotic Maturation.</a> Curr Biol. 16, 56-62 (2006).</li><li>Schetter, A., Askjaer, P., Piano, F., Mattaj, I., Kemphues, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleoporins+NPP-1,+NPP-3,+NPP-4,+NPP-11+and+NPP-13+are+required+for+proper+spindle+orientation+in+C.+elegans.">Nucleoporins NPP-1, NPP-3, NPP-4, NPP-11 and NPP-13 are required for proper spindle orientation in C. elegans.</a> Dev. Biol. 289, 360-371 (2006).</li><li>Samuel, A. D., Murthy, V. N., Hengartner, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+dynamics+during+fertilization+in+C.+elegans.">Calcium dynamics during fertilization in C. elegans.</a> BMC Dev Biol. 1, (2001).</li><li>Badrinath, A. S., White, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contrasting+patterns+of+mitochondrial+redistribution+in+the+early+lineages+of+Caenorhabditis+elegans+and+Acrobeloides+sp.+PS1146.">Contrasting patterns of mitochondrial redistribution in the early lineages of Caenorhabditis elegans and Acrobeloides sp. PS1146.</a> Dev. Biol. 258, 270-275 (2003).</li><li>Johnston, W. L., Krizus, A., Dennis, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+eggshell+is+required+for+meiotic+fidelity,+polar-body+extrusion+and+polarization+of+the+C.+elegans+embryo.">The eggshell is required for meiotic fidelity, polar-body extrusion and polarization of the C. elegans embryo.</a> BMC Biol. 4, 35-35 (2006).</li><li>Parry, J. M., Velarde, N. V., Lefkovith, A. J., Zegarek, M. H., Hang, J. S., Ohm, J., Klancer, R., Maruyama, R., Druzhinina, M. K., Grant, B. D., Piano, F., Singson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGG-4+and+EGG-5+Link+Events+of+the+Oocyte-to-Embryo+Transition+with+Meiotic+Progression+in+C.+elegans.">EGG-4 and EGG-5 Link Events of the Oocyte-to-Embryo Transition with Meiotic Progression in C. elegans.</a> Curr Biol. 19, 1752-1757 (2009).</li><li>Centonze, V. E., White, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+excitation+provides+optical+sections+from+deeper+within+scattering+specimens+than+confocal+imaging.">Multiphoton excitation provides optical sections from deeper within scattering specimens than confocal imaging.</a> Biophys J. 75, 2015-2024 (1998).</li><li>Zinselmeyer, B. H., Dempster, J., Wokosin, D. L., Cannon, J. J., Pless, R., Parker, I., Miller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+microscopy+and+multidimensional+analysis+of+cell+dynamics.">Two-photon microscopy and multidimensional analysis of cell dynamics.</a> Methods Enzymol. 461, 349-378 (2009).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

לאחר המיזוג עם הזרע, הביצית המופרית עוברת סדרה של אירועים דינמיים. אירועים אלה הופכים את הביצית מתא סטטי יחסית לתוך העובר המתפתח במהירות. באורגניזמים רבים, rearrangements cytoplasmic הן קריטיות לקביעת הקוטביות עובריים לצורך הפעלה ביצה. ג העובר elegans מספק הזדמנות מצוינת להתבוננות האירועים הראשונים של הפעלת ביצה embryogenesis. העובר הוא שקוף ואירועים התפתחותי מוקדם להתרחש מהר יחסית לאחר ההפריה. ג החוקרים elegans יצרו זנים רבים מהונדס שימושי להביע fluorescently חלבונים שכותרתו מעורב בפיתוח מוקדם. שימוש אלו זנים יחד עם RNAi או מוטציות מספק מערכת רבת עוצמה לנתח את המסלולים המולקולריים העומדים בבסיס ההתפתחות של האורגניזם הרב (5, 6, 7, 8). מאמר זה מציג וידאו גישה מעשית באמצעות כלים אלה וטכניקות לתעד אירועים במהלך embryogenesis בראשית ג elegans. בוגרים ג הביצית elegans הוא נעצר prophase של המיוזה I ו מופרית spermatheca של אנדרוגינוס מבוגר. לאחר ההפריה, הביצית התמורה באמצעות שאר המיוזה I ו-II. בשלבים אלה ניתן לצפות באמצעות H2B היסטון שכותרתו fluorescently (5). במהלך השלמת המיוזה אימהית, ה-DNA הזרע נשאר מרוכז (ראה איור 1). לאחר השלמת המיוזה, ה-DNA אימהי ואבהי הופך decondensed ואת ליצור שתי pronuclei. Pronucleus אימהית נודד לכיוון pronucleus אבהי והם להצטרף יחד ליד מרכז של העובר. מיטוזה מתפתח במהירות אחרי הפגישה pronuclear. כל האירועים הללו מתרחשים פחות משעה. לפיכך, זמן לשגות מיקרוסקופיה של רצף זה של אירועים יכול להתבצע בקלות. ביצוע הטכניקה הזו מחייבת מתקן מסוים culturing נמטודות, כמו גם מיומנויות בסיסיות מיקרוסקופיה בנוסף גישה מיקרוסקופ confocal. הדוגמה המוצג כאן מנצל ג מהונדס זן שמבטא elegans שני חלבונים פלורסנט, GFP: היוביקוויטין ו mCherry: H2B. מיקרוסקופ confocal סריקת לייזר משמש כדי לצפות לוקליזציה דינמי של שני חלבונים. בנוסף, אנו מראים כי הזרקת Lysotracker שכותרתו fluorescently ניתן להשתמש כדי לעקוב אחר גורלם של lysosomes העובר לאחר ההפריה. הזרקה של גשש שכותרתה יכול גם להתבצע עבור להדמיה של ריכוזי הסידן במיטוכונדריה או מקומי (9). בתיאוריה, פרוטוקול הזרקת יכול לשמש כדי להציג כל סוג של מולקולה שכותרתו fluorescently בעובר. זה יכול לכלול מולקולות קטנות שכותרתו, חלבונים, שומנים, וכו &#39;במקרים מסוימים, ייתכן שלא יהיה צורך להזריק למעשה עוקבים אחר שכותרתו התולעים ברצון ספיגת כמה צבעים כגון mitotracker (10). עם זאת, ניסינו גם השריית הזרקת lysotracker ומצאו תוצאות טובות הרבה יותר עם הזרקה להדמיה בעוברים. שיקולים טכניים: האתגרים הטכניים בפני הליך זה לכלול את הטכניקה microinjection כמו גם הקושי הדמיה עוברי מוקדם מאוד. לגבי microinjections, עובי משטח הזרקת agarose הוא קריטי עבור זריקות מוצלחות. אם כרית עבה מדי, התולעים dessicate ומתים במהירות. אם כרית היא רזה מדי, התולעים לא ידבק כרית במהלך תהליך ההזרקה. עוברי מוקדם יכולים להיות רגישים לתנאי הסביבה, כגון טמפרטורה ותנאי חיץ. עוברים סוג Wild ליזום decondensation-DNA של הזרע והגירה pronuclear בתוך דקה או שתיים של השלמת המיוזה השנייה (4). בתוך 20 דקות, cytokinesis הראשון צריך להתחיל. אם עוברים נחשפים עוצמת הלייזר גבוהה מאוד או יתר על המידה או כתוש במהלך ההרכבה, תהליך זה עשוי להיות מופרת. עוברים כאלה יעצרו פיתוח. במקרה זה, הניסוי יש לחזור עם כוח לייזר ירידה או משטח עבה agarose. C. elegans עוברי לא מפרישים פגז ביצה שלהם עד זמן קצר לאחר ההפריה. בזמן הקצר שבין ההפריה ואת הפרשת קליפת ביצה, העוברים אינם קיימא מחוץ לאם (11). במעבדות יש להימנע אתגר זה על ידי עוברי הדמיה ברחם (5, 12). ברחם הדמיה מציעה יתרונות מסוימים, כגון היכולת ללכוד האירועים המתרחשים במהלך או מיד לאחר ההפריה. עם זאת, טכניקה זו דורשת שימוש של מערכת מיקרוסקופית המאפשרת הדמיה רקמות עמוק. מערכות כגון שני פוטונים או רב פוטון מתאימים במיוחד בשביל זה (13, 14). בעת שימוש רגיל לייזר סריקה או ספינינג מיקרוסקופ דיסק confocal, את התמונות הטובות ביותר מתקבלים מעוברים כי חהיש נחתך מתוך התולעת הבוגרת כפי שמתואר כאן. הדמיה שיקולי המערכת: סוג של מערכת הדמיה confocal בשימוש תלוי הצרכים של המשתמשים. באופן כללי, סריקת מערכות לייזר מומלץ אם אדם רוצה לרכוש תמונות ברזולוציה הגבוהה ביותר האפשרית. מצד שני, מערכות דיסק ספינינג מתאימים יותר עבור תהליכי הדמיה דינמית מאוד כמו רכישת התמונה היא מהירה יחסית photobleaching / phototoxicity מצטמצם. הפרמטרים הדמיה ספציפיות ישתנה בהתאם לעיצוב ניסיוני מערכת הדמיה confocal מועסק. בשנת הדמיה רב ממדית, צריך לשקול את מספר הערוצים, מטוסים מוקד, זמן נקודות נאספים. בשל ההשפעות של הגבלת photobleaching ו phototoxicity, מספר סופי של תמונות ניתן לרכוש בניסוי נתון. לכן, אם תבחר להגדיל את מספר ערוצי להיות נרכשת, סביר להניח שאתה צריך להקטין את מספר מטוסי מוקד ו / או בנקודות זמן ולהיפך. המספר הכולל של תמונות ניתן לרכוש תושפע מעוצמת fluorophore עתה הדמיה כמו גם הרגישות של מיקרוסקופ confocal בשימוש. Fluorophores אינטנסיבי יותר מכשירים רגישים יותר ידרוש זמן חשיפה קצר יותר ובכך לייצר photobleaching פחות phototoxicity. מספר גדול או מערכות הדמיה זמינים. אנו נותנים פרטים על מערכות שהיו בשימוש במעבדות שלנו. עבור עוברי תולעת הדמיה במיקרוסקופ על ידי ספינינג דיסק confocal, אנו משתמשים במיקרוסקופ TE2000U Nikon הפוך מצויד 60X/1.4 NA תוכנית המטרה Apo. המיקרוסקופ מחובר יחידת Yokogawa דיסק CSU10 ספינינג, Hamamatsu C9100 EM-13 מצלמת CCD, וכן Spectral Applied Research LMM5 מודול לייזר למזג ובה ארבע לייזרים של מצב מוצק עם תפוקה ב 405, 491, 561 ו - 655 ננומטר. באמצעות מערכת זו אנו יכולים ללכוד אחד או שני ערוצים, 6-12 מטוסי מוקד, ו - 25-50 timepoints (ב 30-60 במרווחים שנייה). זמן חשיפה טיפוסית 100-200 אלפיות השנייה. עבור עוברי הדמיה עם לייזר מיקרוסקופיית confocal, אנו משתמשים Zeiss LSM700 מצויד 2 ערוצים וארבעה לייזרים של מצב מוצק (405, 488, 555, ו 635 ננומטר). מערכת זו מחוברת מיקרוסקופ Zeiss אובזרוור Axio הפוכה עם מטרה, תוכנית Apo 63X/1.4NA המשמש הדמיה העובר. המערכת משתמשת בתוכנה ZEN Zeiss לרכישת תמונה אשר מספקת גם עיבוד תמונה ניתוח מוגבל. כאשר הדמיה עם שני fluorochromes, אנחנו בדרך כלל מתכנסים 1-5 מטוסים מוקד (~ 0.5 מיקרומטר בנפרד) ואוספת ערמה Z כל 15 שניות. אוספים הם נמשכו עד photobleaching משמעותי התרחש. כדי ליצור את הווידאו הסופי זמן לשגות, תמונות Z מחסנית מאוחדים באמצעות הכלי הקרנת המרבי בתוכנה ZEN. וידאו מיוצאים מהתוכנה כמו קבצי AVI.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> הרכב </th></tr><tr><td> ביצה הצפת </td><td></td><td></td><td> PH 7.2 Hepes 5mm, 110mM NaCl, KCl 4mm Acetate, Mg 5mm, CaCl 2 5mm </td></tr><tr><td> Mitotracker </td><td> Invitrogen </td><td> M-7512 </td><td></td></tr><tr><td> Lysotracker </td><td> Invitrogen </td><td> L-7525 </td><td></td></tr><tr><td> הזרקת נימי Pipet </td><td> הרווארד Apparatus, קנט, בריטניה </td><td> GC120F-10 </td><td></td></tr><tr><td> מחט פולר </td><td> Kopf </td><td> דגם 700C </td><td></td></tr><tr><td> Microinjector Apparatus </td><td> Tritech מחקר </td><td> MINJ-1 microinjection הרגולטור </td><td></td></tr></tbody></table>

time-lapse microscopy of early embryogenesis in caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans יש לעתים קרובות שימשו כמודל למערכת במחקרים של תהליכים התפתחותיים מוקדם. השקיפות של העוברים, את המשאבים הגנטי, ואת הקלות היחסית של טרנספורמציה הן תכונות שהופכות ג elegans מודל מצוין embryogenesis מוקדם. לייזר המבוסס על מיקרוסקופיה confocal תגי שכותרתו fluorescently לאפשר לחוקרים לעקוב אחר מבנים הסלולר ספציפי חלבונים העובר המתפתח. לדוגמה, אחד יכול לעקוב אברונים ספציפיים, כגון lysosomes או המיטוכונדריה, באמצעות צבעים שכותרתו fluorescently. צבעים אלה ניתן יהיה להעביר את העובר מוקדם באמצעות microinjection לתוך בלוטת המין המבוגרים. כמו כן, לוקליזציה של חלבונים ספציפיים ניתן בעקבות באמצעות תגי חלבון פלואורסצנטי. דוגמאות מוצגים כאן מפגין את השימוש של צבע lysosomal ניאון, כמו גם חלבונים היסטון ו היוביקוויטין מתויג fluorescently. היסטון שכותרתה משמש כדי להמחיש את ה-DNA ובכך לזהות את שלב של מחזור התא. GFP-tagged היוביקוויטין מגלה את הדינמיקה של שלפוחית ​​ubiquitinated בעובר בשלב מוקדם. תצפיות של lysosomes שכותרתו GFP: היוביקוויטין ניתן להשתמש כדי לקבוע אם יש colocalization בין שלפוחית ​​ואת lysosomes ubiquitinated. טכניקה עבור microinjection של הצבע lysosomal מוצג. טכניקות ליצירת זנים transgenenic מוצגים במקומות אחרים (1, 2). עבור הדמיה, עוברים נחתכים מתוך מבוגר נמטודות אנדרוגינוס ועלה על 2% רפידות agarose ואחריו מיקרוסקופיה זמן לשגות על לייזר רגיל סריקת מיקרוסקופ confocal או מיקרוסקופ confocal דיסק מסתובב. מתודולוגיה זו מאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה של העובר מוקדם.

Watch this Scientific Journal Video about Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

מאמר זה מתאר טכניקה להדמיה של האירועים הראשונים של העובר בתוך נמטודות<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt;.

זמן לשגות מיקרוסקופית של העובר בשלב מוקדם Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

time-lapse-microscopy-of-early-embryogenesis-in-caenorhabditis-elegans

Research

JoVE Journal

Biology

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

17.9K Views.  University of Alabama in Huntsville. מאמר זה מתאר טכניקה להדמיה של האירועים הראשונים של העובר בתוך נמטודות Caenorhabditis elegans.

Video: Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

Okay, so what I'd like to do today is to show you how to construct a flow chamber, a fusion chamber for imaging on an upright microscope. What then I then do is I create two spaces using film. So what I do is I take the para film, I cut it into small strips.Next I'm going to, this will basically form the channels for the, the walls, and I dry them with a tilted air. I put the cover slip on top of the para, And here's the finished. Then I heat it on a heat block to melt the param and basically create a seal.So what this is, is the, the cover glass here, and then on top of the cover glass is two layers of phim as you see right here. And then on top of this, again, there's a, it's a 22 by two two mil meter cover slip. This one right here, which I pressed against the param to fall the seal.Okay, so the liquid goes in in one direction here and I can suck it out with a filter paper here in this direction. And I'll show you how to do that in a bit. So what I like to do is I like to put it in a humidified chamber, which is very simple.Take two kind of elevated strips and have a filter of paper underneath. And to keep it noisy as I, I put the cover, cover slip on the flow chamber on. Now the way you introduce a solution to the chamber is that you just put the pipet tip at the entrance of the chamber and you just split.Now what I do is I incubate the chamber with the lid closed for 10 minutes. What I usually do to suck the liquid out from the other side is to use it, get a filter paper and cut it into thin strips like this. And I take one of these thin strips and I simultaneously apply the solution into the entrance while putting the filter paper at the exit to suck the exchange, the solution.So you'll see the liquid flowing through the solution. And then I wait for five minutes for the mid close. Now what I'm ready to do is to actually put that the actin it and the actin, I actually have to polymerize, I polymerize inside the flow chamber and it's just the same procedures before.So because like this, and then now that the action is polymerized, I wash out all the un excess un polymerized action using a large volume of just buffer. So here I have about a hundred microliters and it's a few reaction chamber volumes worth of buffer. Just, you know, when the filter paper becomes saturated, I have to change the direction.Okay?And so I'm ready to do imaging with this. So perfusion chamber with actin attached to it. Now I take the slide, mount it under the microscope, and since I'm imaging with an oil objective, I'm gonna put some immersion oil on the top surface of the cover, grass touch, such so assess solution or protein or anything on acting inside.So what I do is I can actually exchange the solution side while I'm doing the time lapse imaging. As such.

ניטור אקטין פירוק עם מיקרוסקופיה זמן לשגות

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

זמן לשגות הדמיה של מיטוזה לאחר transfection siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and hermaphrodites. In the earlier phase of gametogenesis, the germ cells of hermaphrodites differentiate into limited number of sperm - around 300 - and are stored in a small 'bag' called the spermatheca. Later on, hermaphrodites continually produce oocytes1. In contrast, males produce exclusively sperm throughout their adulthood. The males produce so much sperm that it accounts for &gt;50% of the total cells in a typical adult worm2. Therefore, isolating sperm from males is easier than from that of hermaphrodites.
Only a small proportion of males are naturally generated due to spontaneous non-disjunction of X chromosome3. Crossing hermaphrodites with males or more conveniently, the introduction of mutations to give rise to Him (High Incidence of Males) phenotype are some of strategies through which one can enrich the male population3.
Males can be easily distinguished from hermaphrodites by observing the tail morphology4. Hermaphrodite's tail is pointed, whereas male tail is rounded with mating structures.
Cutting the tail releases vast number of spermatids stored inside the male reproductive tract. Dissection is performed under a stereo microscope using 27 gauge needles. Since spermatids are not physically connected with any other cells, hydraulic pressure expels internal contents of male body, including spermatids2.
Males are directly dissected on a small drop of 'Sperm Medium'. Spermatids are sensitive to alteration in the pH. Hence, HEPES, a compound with good buffering capacity is used in sperm media. Glucose and other salts present in sperm media help maintain osmotic pressure to maintain the integrity of sperm.
Post-meiotic differentiation of spermatids into spermatozoa is termed spermiogenesis or sperm activation. Shakes5, and Nelson6 previously showed that round spermatids can be induced to differentiate into spermatozoa by adding various activating compounds including Pronase E. Here we demonstrate in vitro spermiogenesis of C. elegans spermatids using Pronase E.
Successful spermiogenesis is pre-requisite for fertility and hence the mutants defective in spermiogenesis are sterile. Hitherto several mutants have been shown to be defective specifically in spermiogenesis process7. Abnormality found during in vitro activation of novel Spe (Spermatogenesis defective) mutants would help us discover additional players participating in this event.

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

A protocol for isolating and activating spermatids from male C. elegans is described here. Cutting the posterior end of male releases spermatids. The spermatids can be activated by addition of protease.

בידוד במבחנה הפעלת Caenorhabditis elegans זרע

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During directional migration, cells move rapidly in response to an extracellular chemotactic signal, or in response to intrinsic cues 3 provided by the basic motility machinery. Random migration occurs when a cell possesses low intrinsic directionality, allowing the cells to explore their local environment.
Cell migration is a complex process, in the initial response cell undergoes polarization and extends protrusions in the direction of migration 2. Traditional methods to measure migration such as the Boyden chamber migration assay is an easy method to measure chemotaxis in vitro, which allows measuring migration as an end point result. However, this approach neither allows measurement of individual migration parameters, nor does it allow to visualization of morphological changes that cell undergoes during migration.
Here, we present a method that allows us to monitor migrating cells in real time using video - time lapse microscopy. Since cell migration and invasion are hallmarks of cancer, this method will be applicable in studying cancer cell migration and invasion in vitro. Random migration of platelets has been considered as one of the parameters of platelet function 4, hence this method could also be helpful in studying platelet functions. This assay has the advantage of being rapid, reliable, reproducible, and does not require optimization of cell numbers. In order to maintain physiologically suitable conditions for cells, the microscope is equipped with CO2 supply and temperature thermostat. Cell movement is monitored by taking pictures using a camera fitted to the microscope at regular intervals. Cell migration can be calculated by measuring average speed and average displacement, which is calculated by Slidebook software.

This method allows monitoring of cells in real time and quantitative measurements of different cell migration parameters such as speed, displacement, and velocity. Unlike the traditional methods, this real time approach is not based on endpoint quantitative migration measurements; instead it allows monitoring and calculating different parameters continuously.

ניתוח כמותי של הגירה אקראית של תאים באמצעות זמן לשגות מיקרוסקופית וידאו

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

בסיסי<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; שיטות: סנכרון תצפית

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages as well as by the availability of genetic mutants and transgenic strains expressing a myriad of fusion proteins1-4. In addition, dynamic processes such as cell division can be viewed using fluorescently labeled reporter proteins. The study of mitosis can be facilitated through the use of time-lapse experiments in various systems including intact organisms; thus the early C. elegans embryo is well suited for this study. Presented here is a technique by which in vivo imaging of sub-cellular structures in response to anoxic (99.999% N2; &lt;2 ppm O2) stress is possible using a simple gas flow through setup on a high-powered microscope. A microincubation chamber is used in conjunction with nitrogen gas flow through and a spinning disc confocal microscope to create a controlled environment in which animals can be imaged in vivo. Using GFP-tagged gamma tubulin and histone, the dynamics and arrest of cell division can be monitored before, during and after exposure to an oxygen-deprived environment. The results of this technique are high resolution, detailed videos and images of cellular structures within blastomeres of embryos exposed to oxygen deprivation.

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Described here is an in vivo technique to image sub-cellular structures in animals exposed to anoxia using a gas flow through microincubation chamber in conjunction with a spinning disc confocal microscope. This method is straightforward and flexible enough to suit a variety of experimental parameters and model systems.

השתמש של מיקרוסקופיה מעבר זמן לדמיין אנימצית מושעה anoxia מושרה ב<em&gt; ג elegans</em&gt; עוברים

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, which are lipid signals derived from polyunsaturated fatty acids (PUFAs)10-14. These signalling molecules are difficult to study because of their low abundance and reactive nature. The characteristic feature of prostaglandins is a cyclopentane ring structure located within the fatty acid backbone. In mammals, prostaglandins can be formed through cyclooxygenase enzyme-dependent and -independent pathways10,15. C. elegans synthesizes a wide array of prostaglandins independent of cyclooxygenases6,16,17. A large class of F-series prostaglandins has been identified, but the study of eicosanoids is at an early stage with ample room for new discoveries. Here we describe a procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids. Charged lipids are extracted from mass worm cultures using a liquid-liquid extraction technique and analyzed by liquid chromatography coupled to electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). The inclusion of deuterated analogs of prostaglandins, such as PGF2 &alpha;-d4 as an internal standard is recommended for quantitative analysis. Multiple reaction monitoring or MRM can be used to quantify and compare specific prostaglandin types between wild-type and mutant animals. Collision-induced decomposition or MS/MS can be used to obtain information on important structural features. Liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) survey scans of a selected mass range, such as m/z 315-360 can be used to evaluate global changes in prostaglandin levels. We provide examples of all three analyses. These methods will provide researchers with a toolset for discovering novel eicosanoids and delineating their metabolic pathways.

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

In this paper, we describe an optimized procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids from C. elegans using LC-MS/MS.

הפקה וניתוח בפרוסטגלנדין<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, convergence and extension of facial prominences, and maturation of the craniofacial skeleton. To study the contribution of the cranial neural crest to specific regions of the zebrafish palate a sox10: kaede transgenic zebrafish line was generated. Sox10 provides lineage restriction of the kaede reporter protein to the neural crest, thereby making the cell labeling a more precise process than traditional dye or reporter mRNA injection. Kaede is a photo-convertible protein that turns from green to red after photo activation and makes it possible to follow cells precisely. The sox10: kaede transgenic line was used to perform lineage analysis to delineate CNC cell populations that give rise to maxillary versus mandibular elements and illustrate homology of facial prominences to amniotes. This protocol describes the steps to generate a live time-lapse video of a sox10: kaede zebrafish embryo. Development of the ethmoid plate will serve as a practical example. This protocol can be applied to making a time-lapse confocal recording of any kaede or similar photoconvertible reporter protein in transgenic zebrafish. Furthermore, it can be used to capture not only normal, but also abnormal development of craniofacial structures in the zebrafish mutants.

Visualization of experimental data has become a key element in presenting results to the scientific community. Generation of live time-lapse recording of growing embryos contributes to better presentation and understanding of complex developmental processes. This protocol is a step-by-step guide to cell labeling via photoconversion of kaede protein in zebrafish.

ויזואליזציה של Craniofacial פיתוח בsox10: קאאד מהונדס דג הזברה הקו באמצעות זמן לשגות מיקרוסקופיה confocal

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, ...

Specific Labeling of Mitochondrial Nucleoids for Time-lapse Structured Illumination Microscopy

Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and several essential mitochondrial polypeptides. Mitochondrial nucleoids divide and distribute within the dynamic mitochondrial network that undergoes fission/fusion and other morphological changes. High resolution live fluorescence microscopy is a straightforward technique to characterize a nucleoid&#39;s position and motion. For this technique, nucleoids are commonly labeled through fluorescent tags of their protein components, namely transcription factor a (TFAM). However, this strategy needs overexpression of a fluorescent protein-tagged construct, which may cause artifacts (reported for TFAM), and is not feasible in many cases. Organic DNA-binding dyes do not have these disadvantages. However, they always show staining of both nuclear and mitochondrial DNAs, thus lacking specificity to mitochondrial nucleoids. By taking into account the physico-chemical properties of such dyes, we selected a nucleic acid gel stain (SYBR Gold) and achieved preferential labeling of mitochondrial nucleoids in live cells. Properties of the dye, particularly its high brightness upon binding to DNA, permit subsequent quantification of mitochondrial nucleoid motion using time series of super-resolution structured illumination images.

The protocol describes specific labeling of mitochondrial nucleoids with a commercially available DNA gel stain, acquisition of time lapse series of live labeled cells by super-resolution structured illumination microscopy (SR-SIM), and automatic tracking of nucleoid motion.

תיוג ספציפי של נוקלאונואידים מיטוכונדריאידים לזמן-מיקרוסקופ תאורה מובנה לפקיעה

Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and ...

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

Lipid metabolism is a fundamental physiological process necessary for cellular and organism health. Dysregulation of lipid metabolism often elicits obesity and many associated diseases including cardiovascular disorders, type II diabetes, and cancer. To advance the current understanding of lipid metabolic regulation, quantitative methods to precisely measure in vivo lipid storage levels in time and space have become increasingly important and useful. Traditional approaches to analyze lipid storage are semi-quantitative for microscopic assessment or lacking spatio-temporal information for biochemical measurement. Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a label-free chemical imaging technology that enables rapid and quantitative detection of lipids in live cells with a subcellular resolution. As the contrast is exploited from intrinsic molecular vibrations, SRS microscopy also permits four-dimensional tracking of lipids in live animals. In the last decade, SRS microscopy has been widely used for small molecule imaging in biomedical research and overcome the major limitations of conventional fluorescent staining and lipid extraction methods. In the laboratory, we have combined SRS microscopy with the genetic and biochemical tools available to the powerful model organism, Caenorhabditis elegans, to investigate the distribution and heterogeneity of lipid droplets across different cells and tissues and ultimately to discover novel conserved signaling pathways that modulate lipid metabolism. Here, we present the working principles and the detailed setup of the SRS microscope and provide methods for its use in quantifying lipid storage at distinct developmental timepoints of wild-type and insulin signaling deficient mutant C. elegans.

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy allows selective, label-free imaging of specific chemical moieties and it has been effectively employed to image lipid molecules in vivo. Here, we provide a brief introduction to the principle of SRS microscopy and describe methods for its use in imaging lipid storage in Caenorhabditis elegans.

הדמיה ללא תווית של דינמיקת אחסון השומנים באלגנים של Caenorhabditis באמצעות מיקרוסקופיית פיזור ראמאן מגורה

Lipid metabolism is a fundamental physiological process necessary for cellular and organism health. Dysregulation of lipid metabolism often elicits ...

זמן לשגות מיקרוסקופית של העובר בשלב מוקדם Caenorhabditis elegans

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video