This work was supported by a grant from the US National Institutes of Health National Institute for Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases (AR-054342) to NJS. CJG was funded by a Doctoral training studentship funded by the University of Nottingham. JJB was funded by an MRC Doctoral training award (J500495). The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.

1. זנים, תרבות, ומיקרוסקופי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זנים לטפל ולשמור על של C. elegans כפי שתוארו לעיל 19. זנים זמינים ממרכז Caenorhabditis הגנטיקה (CGC). הערה: הזנים המשמשים בניסויים אלה היו CB5600 (ccIs4251 (Pmyo-3 :: Ngfp-lacZ; Pmyo-3 :: Mtgfp) אני;-8 (e1489 IV)) עם חלבוני היתוך GFP המקומיים למיטוכונדריה וגרעין; PJ727 (jls01 (מיו-3 :: GFP, רול-6 (su1006)); UNC-54 :: lacZ V) עם חלבוני היתוך GFP המקומיים למנגנון ההתכווצות וPD55 (ccIs55 (sup-7 (st5); unc- 54 :: lacZ V)) עם חלבוני היתוך β-galactosidase המקומיים לcytosol. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניסויי RNAi מלאים כפי שתואר לעיל עבור ניסויי RNAi דורית 13 ולקבל חיידקי RNAi מהרצף מאומתים ספריית ORF-RNAi שנבנתה על ידי מארק ואח ידאל אל. 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבנות זנים המכילים &lt;<html> em&gt; ccIs 4251, jls01 או ccIs 55 תוך שימוש בטכניקות סטנדרטית 20. השתמש transgenes אלה כדי ליצור מתח כדי להעריך מבנה המיטוכונדריה רשת, ארגון שרירן או מדינת פרוטוסטאזיס, בהתאמה. לחצות את הזנים למוטציה בי מסתכל על אחד מהתאים תת-התאיים אלה בכל בעל חיים הוא רצויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במעכב PtdIns-3-kinase, LY-294,002 (LY) כפי שתוארו לעיל 21. בקצרה, להוסיף LY-294,002 בריכוז סופי של 160 מיקרומטר על גבי צלחות NGM OP50 הזרע יבשות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ללכוד את כל התמונות באמצעות מסנן ה- GFP לניסויים מבוסס-GFP ומיקרוסקופ עם מסנן משולש עוקף המאפשר הדמיה של ערוצים אדומים, ירוק וכחול במקביל להערכה בפוטנציאל הממברנה vivo עם C 32 H 32 Cl 2 N 2 O, נפוץ משווק כMitoTracker האדום CMXRos. לבצע ניתוח תמונה והכנת דמות בתוכנת עיבוד תמונה. </li></ol>s = &quot;jove_title&quot;&gt; 2. סנכרון של בעלי חיים הזחל L1 שימוש הכבידה הנפקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפחות יום 1 צורך לפני, לעשות חיץ M9 - 22.04 מ&quot;מ KH 2 PO 4, 42.27 מ&quot;מ Na 2 4 HPO, 85.56 מ&quot;מ NaCl (ריכוזים סופיים), ולעקר ידי מעוקר. ברגע שהתקרר עד 45 מעלות צלזיוס, להוסיף סטרילי MgSO 4 עד 1 מ&quot;מ לאחר מעוקר כדי למנוע משקעים 22. לאפשר M9 להתקרר על 4 מעלות צלזיוס וaliquot לתוך צינורות 50 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום של הניסוי, להוסיף 3 מיליליטר חיץ M9 לצלחת 9 סנטימטר בודד עם מספרים גבוהים של זחלי L1. לשטוף את הצלחת שוב ושוב על ידי aspirating נוזל M9 וpipetting נגד פני השטח של אגר עם הצלחת שנערכה בזווית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את L1 של מהצלחת ולאחר מכן להעביר את M9 למבחנת 10 מיליליטר בעזרת פיפטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר למשך 2.5 דקות, כדי לאפשר למבוגרים ולבעלי חיים בשלב זחל מאוחר יותר הגדולים יותר ליפול לתחתית המבחנה ובעלי החיים L1 הקטנים יותר להישאר ליד top של חיץ M9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את 500 μl העליון של M9 במבחנה באמצעות פיפטה. אז פיפטה זחלי L1 M9 המכילים לצלחת NGM חדשה שנזרע עם 500 OP50 μl מתחת היקף לנתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדרך כלל, שואף להעביר ~ 200-300 זחלי L1 לכל צלחת. צג צלחות יומיים מבגרות ובמידת צורך, לאסוף בעלי חיים על צלחות NGM OP50 טריות כדי למנוע להישרף מקור מזון OP50. הערה: זה בדרך כלל 1-3 טיפות של M9 באמצעות פיפטה P1000, אם כי זה משתנה במידה רבה בהתאם למספר L1 של על הצלחת המקורית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם מחקרים פרוספקטיביים בבעלי חיים בודדים רצויים, ברגע שבעלי חיים מגיעים לבגרות, לאסוף בעלי חיים בודדים להפריד צלחות NGM זרע. העברת בעלי חיים בכל שעות 24-48 להיפרד מבעלי החיים זחל. </li></ol> 3. מבחני תנועה 19 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מינימום של 2 שעות לפני תחילת ניסויים, להסיר aliquot 50 מיליליטר של M9 ולאפשר לאזן לטמפ &#39;החדרerature. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר חיה מבוגר יחידה למאגר M9 50 μl על שקופיות מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספור את מספר העיקולים גוף השמאלי וימינה ב 10 שניות, שבו שמאלה אחד ועיקול אחד ימינה שווים למכה אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על הספירה של תנועות גוף כדי לתת כולל של לפחות 5 מדידות שממנו ניתן לקחת ממוצע. להכפיל מספרים אלה על ידי שש לתת שיעור התנועה לדקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה, להעביר את בעל החיים חזרה לצלחת פטרי. שיטה זו מאפשרת מדידה זמנית של תנועה לאורך כל תוחלת החיים בים elegan ג. </li></ol><img alt="איור 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52043/52043fig1highres.jpg" width="600" /> איור 1: מבחני תנועה. ברגע שתולעים נאספים למאגר, שמאלה אחד () וימינה עיקול אחד (B) מתווספים יחד כדי לתת תנועה אחת מלאה(שבץ). 4. הדמיה של מיטוכונדריאלי רשתות וSarcomeres בגוף קיר שרירים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערה: הפרוטוקול זהה חל על הדמיה של שתי המיטוכונדריה וsarcomeres. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסנכרן תולעים כפי שתואר לעיל (סעיף 1) ולגדול ל48-60 שעות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס, כאשר הם מגיעים לבגרות צעירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר 20 תולעים (נציג של הצלחת) מהצלחות אל 20 μl M9 על שקופיות מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל להחליק את המכסה ולהמשיך תמונה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי תחת מסנן GFP (460-500 ננומטר, עירור אור הכחול) ב40X הגדלה. </li></ol> 5. הערכת ממברנה פוטנציאלית על ידי שימוש צבירה Assay in vivo עם MitoTracker האדום CMXRos (C 32 H 32 Cl 2 N 2 O) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסנכרן CB5600 (סעיף 1), כל שכותרתו עם GFP במיטוכונדריה של שרירים, ולגדול לבגרות מוקדמת על OP50 מכיל NGM ל48-60 שעות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 μl DMSO לaliquot 50 מיקרוגרם של 32 C H 32 Cl 2 N 2 O כדי להפוך את פתרון מניות של 940.692 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 1 μl של פתרון מניות 940.692 מיקרומטר וresuspend לתוך 199 μl M9 ליצור פתרון עבודה של 4.70 מיקרומטר (4.70346 מיקרומטר). להכין את זה בצינורות 1.5 מיליליטר חומים כי C 32 H 32 Cl 2 N 2 O הוא רגיש לאור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 20 aliquots μl של מיקרומטר 4.70 פתרון עובד (20 תולעים בוגרות לכל 20 aliquot μl). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר 20 בעלי חיים מבוגרים ל -20 μl של C 4.70 מיקרומטר 32 H 32 Cl 2 N 2 O בצינורות 1.5 מיליליטר החומים. לדגור על 20 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגירה 1 שעה, להוסיף 1 מיליליטר M9 לצינורות 1.5 מיליליטר החום המכילים תולעים, צנטריפוגה XG ב 2000 עבור 10 שניות ולאחר מכן להסיר את supernatant. חזור על שלב זה לשטוף לפני resuspending גלולה התולעת והעברת 20 μ שנותרl (המכיל תולעים) לשקופית הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח תמונות של המיטוכונדריה עם 40X הגדלת שימוש במסנן מעביר משולש שמאפשר הדמיה של שני הערוצים האדומים, כחולים וירוקים בו זמנית. הדמיה באמצעות המסנן המשולש העוקף תערוכות שיתוף לוקליזציה של 32 C H 32 Cl 2 N 2 O עם GFP המקומי למיטוכונדריה מופיעה ככתום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שלקח תמונה של המיטוכונדריה הכתומה, צילום להלבין את בעלי החיים במשך 10 שניות באמצעות אור באורך הגל 540/25 ננומטר על הגדרות מקסימום עם כל המסננים הוסרו. זה להלבין אדום בתוך המיטוכונדריה ולחשוף את ה- GFP המיטוכונדריה לבד כדי לאשר colocalization במיטוכונדריה שרירים. </li></ol> 6. הערכה של פירוק חלבוני שריר ב C. elegans <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PD55s לסנכרן (או כל זן המכיל את גן lacZ) על צלחות NGM זרע עם OP50 (סעיף 1). לגדול לבגרות צעירה ל48-60 שעות ב20 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר 20 תולעים בוגרות ל -20 μl DDH 2 O על שקופיות מיקרוסקופ. להיות זהיר כדי לנסות ולבחור רק את התולעת ולא כל חיידקים עם הבחירה. תווית שקופית מיקרוסקופ בעיפרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח בתא הייבוש למשך 30 דקות לייבוש ולפצח את הציפורן של בעלי החיים. להבטיח חותם חזק על הייבוש באמצעות שומן סביב החותם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדקו את ההתייבשות היה יעיל תחת בהיקף לנתח (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להטביע את שקופיות מיקרוסקופ באצטון קר כקרח ל3.5 דקות לאחר מכן לעזוב את שקופית מיקרוסקופ על מגבת נייר בטמפרטורת חדר למשך 15 דקות, כדי לאפשר אצטון בשקופית להתאדות. בשלב זה להפשיר את חיץ X-gal וחמצון ולאפשר equilibrating לטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף X-gal 2 μl 100 μl חיץ חמצון ומערבולת בעדינות כדי להבטיח זאת היא הומוגנית. זהו תמהיל אב חיץ X-gal / החמצון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 μl של מיקס מאסטר חיץ X-gal / חמצון לכל oאזור riginal של 20 תולעים. בדוק תחת בהיקף לנתח על מנת להבטיח את תערובת האב מכסה לחלוטין את כל בעלי החיים לחלוטין. בעדינות להטות את שקופית מיקרוסקופ כדי להעביר את תערובת האמן על אזורים שבם בעלי חיים אינם מכוסים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את שקף מיקרוסקופ בתא לחות ל1-2.5 שעות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס. בעלי חיים תמונה כאשר צבע כחול כהה נמצא בקיר שרירי גופם של בעלי החיים שליטה. להעריך חיות שליטה לפי היקף לנתח כל 15 דקות כדי לקבוע מתי צריכים להיות צילמו בעלי חיים. </li></ol><img alt="איור 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52043/52043fig2highres.jpg" width="600" /> איור 2: הערכה של פירוק חלבוני שריר תוך שימוש במבחני β-galactosidase. בעלי חיים (א) המכילים transgene lacZ נקטפים מצלחות פטרי 20 μl DDH 2 O בשקופית מיקרוסקופ (ב &#39;). בעלי החיים מיובשים ולהיות בורה <sטרונג&gt; (C). אז בעלי חיים נשטפים באצטון (ד &#39;). ברגע שאצטון מתאדה תערובת אמן חיץ X-gal / חמצון נוספת (E). הפיתוח של צבע הכחול בבעלי החיים שליטה נבחנים במרווחים של 15 דקות (FL) מt = 0 דקות (F) ועד צבע כחול כהה מתקבל על פני האורך של בעלי החיים (L). תמונות של תולעים נלקחות בהגדלה 2.5x ב AE ו 8X בפלורידה. מתקרב C, D, F, G, ו- L הוא 4X ההגדלה המקורית.

The authors have nothing to disclose.

שריר הוא רקמה רב תכליתי, להערכה גם לתפקידה בתנועה, תמיכה וחילוף חומרים יציבות. הפיתוח והתחזוקה של שרירים בריאים דורשים התיאום של תהליכים תאיים רבים ורכיבים. או דרך נזק או מחלה, חוסר ויסות יכול להתרחש, וכתוצאה מכך מבנה שריר שינה ו / או בתפקוד. ירידת גיל הקשורים בתפקוד שרירים מציגה נטל משמעותי לתקציבי בריאות בעולם המערבי, שכן מסת שריר 1,2 ובמיוחד כוח וסבולת שרירים 3-5 מתואם שלילי עם תמותה. המדידה של היבטים הקשורים בתפקוד שרירים מתדרדר כגון מיטוכונדריה שינו או שיבוש sarcomere, יכולה לאפשר הבנה טובה יותר של המנגנונים שבבסיס פיתוח שרירים כללי ובריאות. elegans aenorhabditis C (סי אלגנס) הוא BES נמטודות מיקרוסקופילא ידוע כי זה היה אורגניזם רב-תאי הראשון שיש כל הגנום שלו רצף 6, הראשון לגנים המושתקים באמצעות 7 RNAi, ומטזואניים רק כדי elegans 9 נקבע. ג השושלת כל תא 8 וneuroanatomy הוצע לראשונה כ מודל ללימוד הבקרה הגנטית של התנהגות בשנת 1974 על ידי סידני ברנר 10 ואת החשיבות של זה ואת העבודה שלאחר מכן הוכר עם הראשון של שלושה פרסי הנובל שהוענק לחוקרי C. elegans. כ -35% מC. elegans גנים זיהו orthologues בבני אדם, עם סי אלגנס להיות האורגניזם מפתח המשמש להבנת הבקרה הגנטית של התפתחות שרירים 11. כמעט בכל גן בגנום סי אלגנס יכול להיות שברה באמצעות RNAi 7,12. כך, על ידי דריסה גנים בשרירים מפותחים במלואו, מרכיבים גנטיים תורמים למחדשgulation בריאות שרירים יכול להיחקר עם פשטות היחסית 13. היכולת המשולבת לשימוש, מוטציות, ותרכובות כימיות RNAi עושה C. elegans מערכת מובילה לחקר הרגולציה הגנטית 7,14,15 של מבנה שרירים ובתפקוד עם גיל 16 ובמודלים של מחלות 17. ההשפעה של מציאה גן, מוטציה, ו / או חשיפה לחומרים כימיים במבנה שריר ו / או תפקוד ניתן למדוד באמצעות היבטים רבים. כאן אנו מתארים בקצרה טכניקות פשוטות להערכת מבנה C. elegans שרירים ובתפקוד, שרבים מהם יכולים לשמש במחקרים פרוספקטיביים של בריאות שרירים. הפיתוח של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) 18 אפשר להדמיה של שני היישוב של חלבונים ספציפיים והמבנה הכללי של האברונים ב C. elegans. כאן אנחנו מסבירים כיצד ה- GFP הביע ספציפיfically בתוך המיטוכונדריה קיר שרירים גוף, ניתן להשתמש בגרעינים, או sarcomeres כדי לקבוע אם ניוון של מבנים תת-תאיים אלה הוא הווה. כמבנה הוא לא תמיד תחליף אמין לפונקציה, אנחנו גם מסבירים כיצד השימוש בצבע קטיוני in vivo מאפשר הערכת פוטנציאל קרום המיטוכונדריה פגום שבתוך שריר. כאשר הצבעים משמשים בשילוב עם ה- GFP, שמתירים ללימודי אדריכלות ולתפקד באופן זמני לאורך כל חיים. לבסוף, אנחנו גם מסבירים כיצד הומאוסטזיס חלבונים בתוך שריר ניתן להעריך וכיצד כל אלו, ניתן להשתמש כדי לתאם שינויים בבריאות שרירים בעלי החיים שלמים באמצעות שימוש במבחני תנועה. טכניקות אלו, בשילוב עם מציאה גן, מוטציות, ו / או תרכובות כימיות לספק ארסנל רב עוצמה ללימוד כיצד גנים או תרכובות מסוימים להשפיע על בריאות שרירים בגוף חי. המקבילות במבנה, חילוף חומרים ותפקוד ברוטו של שריר בין סי אלגנס ויונקים אומר סי אלגנס הוא אורגניזם מודל מצטיין להבנת הרגולציה של שריר באורגניזמים שונים, לרבות בני אדם.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="603">
	<tbody>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:195px;">Name of Material/Equipment</td>
			<td style="width:103px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:187px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:195px;">MitoTracker Red CMXRos (C32H32Cl2N2O)</td>
			<td style="width:103px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">M-7512</td>
			<td style="width:187px;">Red mitochondrial dye which accumulates based on a negative membrane potential</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:195px;">DMSO</td>
			<td style="width:103px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">67-63-5</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:195px;">KH2 PO4</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">7778-77-0</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:195px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:103px;">BDH</td>
			<td style="width:119px;">301584L</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">NaCl</td>
			<td style="width:103px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">7647-14-5</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:195px;">MgSO4</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M-7506</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:195px;">Microscopy Slides</td>
			<td style="width:103px;">Starfrost</td>
			<td style="width:119px;">K220</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">Microscopy Cover Slips</td>
			<td style="width:103px;">VW2 International</td>
			<td style="width:119px;">631-0124</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">1.5ml Eppendorph Tubes</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FB74031</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">Dessicator</td>
			<td style="width:103px;">Nalgene</td>
			<td style="width:119px;">D2672</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:195px;">Nikon Microscope</td>
			<td style="width:103px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">H600L</td>
			<td style="width:187px;">Nikon H600L microscope with proprietary software</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:195px;">Nikon Camera</td>
			<td style="width:103px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">DS-Fi1</td>
			<td style="width:187px;">Nikon Digital Sight DS-Fi1 digital camera&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="101">
			<td height="101" style="height:101px;width:195px;">Zeiss Microscope</td>
			<td style="width:103px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">Ax10</td>
			<td style="width:187px;">Zeiss AX10 microscope with an Axiocam MRC digital camera and Axiovision LE software and a triple-pass filter</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">Plates 9cm</td>
			<td style="width:103px;">Starstedt</td>
			<td style="width:119px;">82-1473</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="42" rowspan="2" style="height:42px;width:195px;">Plates 6cm</td>
			<td rowspan="2" style="width:103px;">Gosselin</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">BP53-01</td>
			<td rowspan="2" style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="84" rowspan="3" style="height:84px;width:195px;">Potassium Ferrocyanide</td>
			<td rowspan="3" style="width:103px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td rowspan="3" style="width:119px;">14459-95-1&#160;</td>
			<td rowspan="3" style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:195px;">MgCl2</td>
			<td style="width:103px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">7786-30-3</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="61" rowspan="3" style="height:61px;width:195px;">Na3PO4</td>
			<td rowspan="3" style="width:103px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td rowspan="3" style="width:119px;">7601-54-9</td>
			<td rowspan="3" style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="147" rowspan="3" style="height:147px;width:195px;">5-Bromo-4-chloro-3-indolyl &#946;-D-galactopyranoside</td>
			<td rowspan="3" style="width:103px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td rowspan="3" style="width:119px;">7240-90-6&#160;</td>
			<td rowspan="3" style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="84" rowspan="3" style="height:84px;width:195px;">N,N8-dimethylformamide</td>
			<td rowspan="3" style="width:103px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td rowspan="3" style="width:119px;">68-12-2&#160;</td>
			<td rowspan="3" style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods to assess subcellular compartments of muscle in c. elegans

שריר הוא רקמה דינמית המגיבה לשינויים בתזונה, פעילות גופנית, ומצב מחלה. אובדן מסת שרירים ובתפקוד עם מחלה וגיל הוא עול משמעותי על בריאות ציבור. בשלב זה אנו מבינים קצת על הרגולציה הגנטית של בריאות שרירים עם מחלה או גיל. סי אלגנס נמטודות הוא מודל שהוקם להבנת הרגולציה הגנומי של תהליכים ביולוגיים של עניין. קיר שרירי גוף של תולעת זו להציג מידה רבה של הומולוגיה עם השרירים של מינים מטזואניים גבוהים יותר. מאז סי אלגנס הוא אורגניזם שקוף, הלוקליזציה של ה- GFP למיטוכונדריה וsarcomeres מאפשרת הדמיה של מבנים אלה in vivo. באופן דומה, האכלת בעלי חיים צבעים קטיוני, אשר מצטברים על בסיס קיומו של פוטנציאל הממברנה של המיטוכונדריה, מאפשר ההערכה של תפקוד המיטוכונדריה in vivo. שיטות אלה, כמו גם הערכה של homeosta חלבון השריראחות, בשילוב עם הערכה של תפקוד שרירים בעלי החיים שלם, בצורה של מבחני תנועה, כדי לאפשר התאמה של פגמי משנה הסלולר עם פעולות פונקציונליות של ביצועי שרירים. כך, סי אלגנס מספק פלטפורמה רבת עוצמה שבה להעריך את ההשפעה של מוטציות, מציאה גן, ו / או תרכובות כימיות במבנה שרירים ובתפקוד. לבסוף, כGFP, צבעי קטיוני, ומבחני תנועה מוערכים הלא פולשני, ניתן לבצע מחקרים פרוספקטיביים של מבנה שרירים ובתפקוד בכל רחבי כמובן חיים וזה כיום לא ניתן לחקור בקלות in vivo בכל אורגניזם אחר.

מבחני תנועה לכמת פגמי תנועה ירידת תנועה היא מנבא טוב לתמותה בג elegans 16, עם ירידה בשיעורים המצביעים על בעיות במערכת העצבית-שהרירית. שינויים בתנועה, כפי שהוערך על ידי מבחני תנועה, יכולים לנבוע מRNAi נגד גן ספציפי או טיפול תרופתי (איורים 3-5) או בבעלי חיים שעברו מוטציה 13, 23. ירידה בתנועה יכולה לנבוע מפיתוח שינה לדוגמא הבאה דפיקה התפתחותית מטה של גני הובלת אלקטרונים קידוד אני מורכב, III, IV או V 24. בנוסף, ניתן לבדוק התערבויות ספציפיות על סי אלגנס מבוגרים רק כדי לחקור את ההשפעה על פיזיולוגיה פוסט-התפתחותית. לדוגמא, בעלי חיים שטופלו בRNAi נגד UNC-112, המקודדים את C. elegans orthologue של Kindlin-1 אשר מותאם לintegrin מכילהמתחמי קובץ מצורף שריר (איורים 3 ו -4), או גז-1, אשר מקודד מרכיב שלי מורכב של שרשרת העברת אלקטרונים (איור 4), להציג מתווית הפחתה בתנועה לעומת שליטה מתפקיד בגרות-48-72 שעות. זה עשויה להצביע על בעיות עם פיזיולוגיה של שרירים. באופן דומה, הפסד של תנועת 24-72 שעות הוא ציין בתגובה לטיפול במבוגרים בדרך כלל פותח עם טיפול במעכב PI3K LY-294,002 (איור 5). אפשר גם לבדוק את ההשפעה של טיפול שני RNAi, מוטציה, או תרופה בשיקום תנועה בבעלי חיים בו מוצגות תנועה מופחתת בתגובה להתערבות ראשונית. לדוגמא, 112 מוטציות unc- להציג ירידה לכימות בתנועה בהשוואה לבעלי חיים מסוג בר שמוחלש בנוכחות מוטציה שנייה ב 1 לעמעם-13. לכן, מבחני תנועה יכולים לזהות שתי ההתערבויות שמשנות neuromuscuפיתוח LAR ו / או בתפקוד, כמו גם אלה המשפרים ו / או לשקם את התפקוד עצבי-שרירית. הערכה של שיבוש sarcomere לאחר שזיהה את פגם תנועה, הוא לעתים קרובות רצוי לקבוע אם הגורם לפגם התנועה יכול להיות מוסבר על ידי בעיות בעצבים, שרירים, או שניהם. Sarcomeres הם קומפלקסים רב-חלבון בתוך שריר המאפשרים התכווצות וכך להכריח את הדור ותנועה. על ידי בעלי חיים תוך ניצול להביע חלבוני היתוך GFP שרירן מקומיים למנגנון ההתכווצות, לחוטי שרירן וsarcomeres מידת השיבוש יכולה להיות שנצפתה יחסית הלא פולשני ולהבא בבעלי חיים בודדים באמצעות פיתוח ו / או בבגרות. חיות בר-סוג להציג sarcomeres ערוך המופיעים מספר שורות הירוקות מקבילות ישר בתוך כל גוף קיר שרירים (איור 3). הפרעה למערכים הרגילים אלה עשויות להיות קטנה יחסית עםsarcomeres ערוך מופיע להתאחד, במקום שנותר במקביל. פנוטיפ זה, גלוי עם UNC-112 RNAi בזמן t = 24 שעות או 48 שעות (איור 3), דומה להזרמת Z-קו של אתרים מצורפים אקטין בשריר של יונקים. באופן דומה, מנות קטנות של המערכים יכולות להתמוטט או שהם יכולים להיעלם כגון לחלוטין כטיפול בUNC-112 RNAi בזמן t = 48 שעות או t = 72 שעות (איור 3). הנוכחות של פגמי sarcomere בתוך השריר של בעלי חיים המציגים פגם תנועה (איור 3) די בכך כדי להסביר את פגם התנועה אך לא בהכרח לשלול בעיות אחרות עם שרירים, עצבים, ו / או רקמות אחרות בתגובה להתערבות . הערכה של מבנה מיטוכונדריאלי רשת בנוכחות פגם תנועה זה לפעמים רצוי לבחון שרירים לפגמים אחרים שעלולות לגרום או לתרום לדה התנועהfect. המיטוכונדריה מספקת את חלק הארי של אנרגיה בתאים וירידה בתנועה עשויה להיות התוצאה של מתן ATP מופחת, צמצום זמינה להתכווצות שריר האנרגיה. כך המבנה של המיטוכונדריה יכול להיבחן על ליקויים. חשוב לא לטשטש חיות עם אזיד הנתרן כפי שגורם לפיצול במיטוכונדריה מהיר; בעלי חיים בניסויים אלה היו משותקים על ידי הלחץ המופעל על ידי להחליק את המכסה. בתוך סי אלגנס wild-type קיר שרירים גוף, מיטוכונדריה נמצאות בתוך רשתות מאורגנות (איור 4) ומיטוכונדריה קיימות ופועלת כרשתית 25. שיבוש של הרשת של המיטוכונדריה מציג כפיצול של הרשת (גז-1 RNAi, איור 4) 26. פיצול עשוי להיות חמור מספיק שלא מראית עין של רשתות מאורגנות נשארה כגון טיפול עם UNC-112 RNAi (איור 4 ב ו-ג) 13. כwiשיבושי ה במבנה sarcomere, פגמים במבנה המיטוכונדריה שרירים בבעלי המציגים פגם תנועה עשויים להיות מספיק כדי להסביר את פגם התנועה אבל זה לא בהכרח לשלול בעיות אחרות עם שרירים, עצבים, ו / או רקמות אחרות. לדוגמא, UNC 112-מוטציות 13 וטיפול בUNC-112 RNAi (איורים 3 ו -4) תצוגת שני sarcomeres שיבש ושבשו מבנה המיטוכונדריה. הערכה של תפקוד המיטוכונדריה Vivo פוטנציאל הממברנה של המיטוכונדריה קובע את היכולת של המיטוכונדריה כדי ליצור כוח המניע של פרוטונים וליצור 27 ATP, ולכן היכולת להעריך את פוטנציאל הממברנה של המיטוכונדריה in vivo מציין את היכולת של בעלי החיים כי כדי לייצר ATP. כשיבושים מבניים המיטוכונדריה יכולים או לא יכולים לשנות יכולת התפקודית של המיטוכונדריה, זה עשוי להיות desirable כדי להעריך את התפקוד המיטוכונדריה בבעלי חיים בו מוצגות מבנה המיטוכונדריה שינה. C 32 H 32 Cl 2 N 2 O מצטבר במיטוכונדריה, בכל סוגי התאים, שבו פוטנציאל קרום הוא בהווה ובמכתים את המיטוכונדריה 28 (איור 4C). במיוחד כדי להעריך את התפקוד המיטוכונדריה בשריר, אפשר להשתמש 32 C H 32 Cl 2 N 2 O ומיטוכונדריה השרירים GFP שכותרתו כדי להדגים את ההשפעות של התערבות באופן ספציפי על המיטוכונדריה שריר (איור 4C). לדוגמא, אובדן טיפול המיטוכונדריה קרום פוטנציאלי הבא עם UNC-112 RNAi מונע C 32 H 32 Cl 2 N 2 O מלהיכנס למטריקס. המיטוכונדריה לכן להראות מעט, אם בכלל כתמים אדומים של המיטוכונדריה בנוסף לתיוג GFP של המיטוכונדריה (איור 4C). גם צילום הלבנה ניתן להשתמש כדי לוודא שנצפהמיטוכונדריה הן דווקא אלה בשריר (איור 4C). זיהוי של קיבולת מופחתת כדי לייצר ATP די בכך כדי להסביר את פגם תנועה שנצפה אך לא לשלול בעיות אחרות בתוך שריר, עצב, ו / או רקמות אחרות. ללא קשר, כמו כושר ייצור ATP המופחת קשור למצבי מחלה בבני אדם 29 והזדקנות 30, זיהוי פגם כזה בתגובה להתערבות מספק במה להקרנה לתרכובות ו / או טיפולי RNAi המשפרים את כושר ייצור ATP ולאחר מכן רשאית אלה תחקור יותר לעומק לפוטנציאל טיפולי. הערכה של פירוק חלבונים בנוכחות פגם תנועה וsarcomeres והמיטוכונדריה נורמלים זה לפעמים רצוי לבחון שרירים לפגמים אחרים שעלולות לגרום או לתרום לפגם התנועה. היכולת לשמור על הומאוסטזיס חלבון היא חתימה של לאבריאות mal, ואילו ירידה בסינתזה של חלבונים ו / או עלייה בפירוק חלבונים היא תוצאה של הזדקנות 31 ומצבי מחלה מרובים 32,33. לכן זה עשוי להיות רצוי לבחון את השרירים של בעלי חיים עם מום תנועה להומאוסטזיס חלבון שונה. ניתן לעשות זאת באמצעות הערכה של רמות של חלבוני שריר cytosolic. השימוש בחלבונים המקודדים על transgenically מאפשר הערכה של פרוטוסטאזיס הספציפי שרירים. לדוגמא, שימוש בבעלי החיים המכילים β-galactosidase, התמזגה לחלק N-terminal של שרירן, שמסונתזים תחת שליטתו של אמרגן שרירן ומשפרים מאפשר הערכה של תכולת חלבון שריר cytosolic 19. הנוכחות של כתם הכחול במבוגרים wild-type מדגימה את הנוכחות של β-galactosidase הפעיל והעדר פירוק חלבוני cytosolic פתולוגיים. הפסד של מכתים בתגובה לטיפול מצביע על פירוק חלבונים פתולוגיים מתרחש (איור 5 </strong&gt;), כβ-galactosidase יציב במשך 72 - לאחר בגרות 96 שעות במבוגרים wild-type 13,14,19. לדוגמא, בעלי חיים שלא טופלו wild-type להציג כתם כחול 72 שעות אינטנסיביות אחרי הבגרות, ואילו LY-249,002 חיות שטופלו להציג חוסר הכתם (איור 5). כמו בפגמים במבנה sarcomere ותפקוד המיטוכונדריה, הנוכחות של פירוק חלבוני שריר פתולוגיים די לחשבון לפגם תנועה נצפית אך לא בהכרח לשלול בעיות אחרות עם שרירים, עצבים, ו / או רקמות אחרות. <img alt="איור 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52043/52043fig3highres.jpg" width="600" /> איור 3: (א) UNC-112 RNAi גורם פגם תנועה משמעותי בזמן t = 72 שעות הערכה (B) של מבנה להקה ערוך בתוך קיר גוף שרירים.. בwלא, להקות בשריר מופיעים קווים ישרים כמו בבגרות צעירה (t = 0 hr) ונותרו במידה רבה אחיד עד מעבר 72 שעות של בגרות (ראה זום WT). UNC-112 RNAi גורם sarcomeres לאבד ארכיטקטורה באזורים קטנים של השריר (t = 24 שעות), התמוטט וsarcomeres החסר (t = 48 שעות), צבירה (פנל העליון t = 72 שעות וזום) ואיבוד הליניאריות של sarcomeres (פנל תחתון t = 72 שעות וזום). ברים סולם מייצגים 25 מיקרומטר ומתקרב הם 2.5x. <img alt="איור 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52043/52043fig4highres.jpg" width="600" /> איור 4: () UNC-112 או גז 1 RNAi גורם פגם תנועת הערכה (B) של מבנה המיטוכונדריה בתוך קיר גוף שרירים.. המיטוכונדריה בשרירים מופיעה קווים ישרים ברשת כבבגרות צעירה (WT). טיפול בבעלי החיים עם UNC-112 RNAi התוצאה mitochondrפיצול ial כפי שנצפה בעבר בין 24 שעות ו -72 שעות של בגרות (מתקרב וחץ) 13. כמו כן, RNAi נגד גז -1 תוצאות בפיצול של רשתות המיטוכונדריה כפי שנצפו בעבר 26. אלה נמצאים כפערים קטנים ברשת של המיטוכונדריה בזמן t = שעה 24 והתקדמות לחוסר ארגון נרחב ב 72 שעות (ראה זום וחץ). הערכה (C) של פוטנציאל הממברנה של המיטוכונדריה in vivo. בבעלי חיים המכילים גם GFP מקומי למיטוכונדריה, C 32 H 32 Cl 2 N 2 O מצטבר במיטוכונדריה שריר קיר גוף ומופיעים כתומים תחת מסנן משולש הגבהה מבגרות צעירה (t = 0 שעה) עד שלאחר בגרות 72 שעות. טיפול עם UNC-112 RNAi גורם לאובדן הדרגתי של פוטנציאל הממברנה כפי שמוצג ב 72 שעות שבו המיטוכונדריה שנותרה להראות פחות הצטברות של C 32 H 32 Cl 2 N 2 O לעומת WT. Photobleaching 10 seג באמצעות מלביני 540/25 ננומטר אור האדום מMitoTracker ומגלה GFP המקומי למיטוכונדריה שריר (+ אקונומיקה תמונה). ברים סולם מייצגים 25 מיקרומטר ומתקרב הם 2.5x. <img alt="איור 5" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52043/52043fig5highres.jpg" width="600" /> איור 5: (א) טיפול בLY-294,002 בעלי חיים גורם פגם תנועת הערכה (B) של פירוק חלבונים באמצעות assay β-galactosidase.. הגיל המסונכרן WT זחלי L1 גדלים לבגרות צעירה ב 20 ° C (t = 0 שעה) לפני העברה לNGM זרע עם OP50 (שליטת WT) או NGM זרע עם LY-294,002 (טיפול מעכב PI3K) למשך 24 שעות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס . ב, כ 20-30 בעלי חיים מוכתמים עבור פעילות β-galactosidase (הכחול) בשעה t = 0 שעה ולאחר 24 שעות, 48 שעות ו -72 שעות.

Watch this Scientific Journal Video about Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans at JoVE.com

שיטות להערכת תאים תת-תאיים של שריר ב-C. elegans | ביולוגיה | וִידֵאוֹ

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

שריר שלד הוא חיוני לתנועה, והוא חנות החלבון העיקרית של הגופים. מדידות בריאות שרירים בתוך סי אלגנס מתוארות. שינויים פוטנציאליים למבנה שרירים ובתפקודם הוערכו באמצעות ה- GFP מקומי וצבעים קטיוני.

שיטות להערכת subcellular תאים של שריר ב<em&gt; C. elegans</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...

methods-to-assess-subcellular-compartments-of-muscle-in-c-elegans

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Human Biology

Musculoskeletal System

SCIENTISTS IN ACTION

16.5K Views.  University of Nottingham.  שריר שלד הוא חיוני לתנועה, והוא חנות החלבון העיקרית של הגופים. מדידות בריאות שרירים בתוך סי אלגנס מתוארות. שינויים פוטנציאליים למבנה שרירים ובתפקודם הוערכו באמצעות ה- GFP מקומי וצבעים קטיוני. 

Video: Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

הדור של Stable טראנסגנטי C. elegans שימוש Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid generation time and short life span, easy and inexpensive maintenance, fully sequenced genome, and array of RNAi resources and mutant animals. Additionally, analysis of the C. elegans genome revealed a great similarity between worms and higher vertebrates, which suggests that research in worms could be an important adjunct to studies performed in whole mice or cultured cells. A powerful and important part of worm research is the ability to use transgenic animals to study gene localization and function. Transgenic animals can be created either via microinjection of the worm germline or through the use of biolistic bombardment. Bombardment is a newer technique and is less familiar to a number of labs. Here we describe a simple protocol to generate transgenic worms by biolistic bombardment with gold particles using the Bio-Rad PDS-1000 system. Compared with DNA microinjection into hermaphrodite germline, this protocol has the advantage of not requiring special skills from the operator with regards to identifying worm anatomy or performing microinjection. Further multiple transgenic lines are usually obtained from a single bombardment. Also in contrast to microinjection, biolistic bombardment produces transgenic animals with both extrachromosomal arrays and integrated transgenes. The ability to obtain integrated transgenic lines can avoid the use of mutagenic protocols to integrate foreign DNA. In conclusion, biolistic bombardment can be an attractive method for the generation of transgenic animals, especially for investigators not interested in investing the time and effort needed to become skilled at microinjection.

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Transgenic worms are commonly used in C. elegans research. Described is a simple, yet effective, protocol to introduce transgenes into worms using biolistic bombardment with DNA-coated gold particles. The effort involved and results of bombardment compare favorably with microinjection for the generation of transgenic animals.

דור טראנסגנטי ג elegans על ידי שינוי Biolistic

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

RNAi הקרנת לזהות פנוטיפים Postembryonic ב ג elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

בסיסי<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; שיטות: סנכרון תצפית

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

Oxygen is essential for all metazoans to survive, with one known exception1. Decreased O2 availability (hypoxia) can arise during states of disease, normal development or changes in environmental conditions2-5. Understanding the cellular signaling pathways that are involved in the response to hypoxia could provide new insight into treatment strategies for diverse human pathologies, from stroke to cancer. This goal has been impeded, at least in part, by technical difficulties associated with controlled hypoxic exposure in genetically amenable model organisms.
The nematode Caenorhabditis elegans is ideally suited as a model organism for the study of hypoxic response, as it is easy to culture and genetically manipulate. Moreover, it is possible to study cellular responses to specific hypoxic O2 concentrations without confounding effects since C. elegans obtain O2 (and other gasses) by diffusion, as opposed to a facilitated respiratory system6. Factors known to be involved in the response to hypoxia are conserved in C. elegans. The actual response to hypoxia depends on the specific concentration of O2 that is available. In C. elegans, exposure to moderate hypoxia elicits a transcriptional response mediated largely by hif-1, the highly-conserved hypoxia-inducible transcription factor6-9. C .elegans embryos require hif-1 to survive in 5,000-20,000 ppm O27,10. Hypoxia is a general term for "less than normal O2". Normoxia (normal O2) can also be difficult to define. We generally consider room air, which is 210,000 ppm O2 to be normoxia. However, it has been shown that C. elegans has a behavioral preference for O2 concentrations from 5-12% (50,000-120,000 ppm O2)11. In larvae and adults, hif-1 acts to prevent hypoxia-induced diapause in 5,000 ppm O212. However, hif-1 does not play a role in the response to lower concentrations of O2 (anoxia, operational definition &lt;10 ppm O2)13. In anoxia, C. elegans enters into a reversible state of suspended animation in which all microscopically observable activity ceases10. The fact that different physiological responses occur in different conditions highlights the importance of having experimental control over the hypoxic concentration of O2.
Here, we present a method for the construction and implementation of environmental chambers that produce reliable and reproducible hypoxic conditions with defined concentrations of O2. The continual flow method ensures rapid equilibration of the chamber and increases the stability of the system. Additionally, the transparency and accessibility of the chambers allow for direct visualization of animals being exposed to hypoxia. We further demonstrate an effective method of harvesting C. elegans samples rapidly after exposure to hypoxia, which is necessary to observe many of the rapidly-reversed changes that occur in hypoxia10,14. This method provides a basic foundation that can be easily modified for individual laboratory needs, including different model systems and a variety of gasses.

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

This paper details how to use continuous-flow hypoxia chambers to generate atmospheres with defined concentrations of O2 to understand biological responses to decreased O2. This system is easy to setup and maintain, and flexible enough to suit a wide range of O2 concentrations and model systems

יצירת סביבות גזיים מוגדרים כדי לחקור את ההשפעות של היפוקסיה על<em&gt; ג elegans</em

Oxygen is essential for all metazoans to survive, with one known exception1. Decreased O2 availability (hypoxia) can arise during states of disease, ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

Assay Chemotaxis סי אלגנס

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional measures of muscle health. In this video article, we demonstrate a method to measure force generation during contraction of zebrafish larval trunk muscle. Force measurements are accomplished by placing an anesthetized larva into a chamber filled with a salt solution. The anterior end of the larva is tied to a force transducer and the posterior end of the larva is tied to a length controller. An isometric twitch contraction is elicited by electric field stimulation and the force response is recorded for analysis. Force generation during contraction provides a measure of overall muscle health and specifically provides a measure of muscle function. Although we describe this technique for use with wild-type larvae, this method can be used with genetically modified larvae or with larvae treated with drugs or toxicants, to characterize muscle disease models and evaluate treatments, or to study muscle development, injury, or chemical toxicity.

Force measurements can be used to demonstrate changes in muscle function due to development, injury, disease, treatment or chemical toxicity. In this video, we demonstrate a method to measure force during a maximal contraction of zebrafish larval trunk muscle.

מדידת כוח במהלך התכווצות כדי להעריך את תפקוד שריר בזחלי דג הזברה

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C. elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be bypassed by chemical or mechanical methods. "Freeze-cracking" is one method used to physically pull the cuticle from nematodes by compressing nematodes between two adherent slides, freezing them, and pulling the slides apart. Freeze-cracking provides a simple and rapid way to gain access to the tissues without chemical treatment and can be used with a variety of fixatives. However, it leads to the loss of many of the specimens and the required compression mechanically distorts the sample. Practice is required to maximize recovery of samples with good morphology. Freeze-cracking can be optimized for specific fixation conditions, recovery of samples, or low non-specific staining, but not for all parameters at once. For antibodies that require very hard fixation conditions and tolerate the chemical treatments needed to chemically permeabilize the cuticle, treatment of intact nematodes in solution may be preferred. If the antibody requires a lighter fix or if the optimum fixation conditions are unknown, freeze-cracking provides a very useful way to rapidly assay the antibody and can yield specific subcellular and cellular localization information for the antigen of interest.

Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking"

"Freeze-cracking," a method for exposing the inner tissues of the nematode C. elegans to antibodies for protein localization, is demonstrated.

נוגדן מכתים ב<em&gt; ג Elegans</em&gt; שימוש &quot;Freeze-פיצוח&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed under anoxia for 20 hr&#160;(simulated ischemia), and subsequently moved to a normal atmosphere with food (simulated reperfusion). This experimental paradigm results in increased death and neuronal damage, and techniques are presented to assess organism viability, alterations to the morphology of touch neuron processes, as well as touch sensitivity, which represents the behavioral output of neuronal function. Finally, a method for constructing hypoxic incubators using common kitchen storage containers is described. The addition of a mass flow control unit allows for alterations to be made to the gas mixture in the custom incubators, and a circulating water bath allows for both temperature control and makes it easy to identify leaks. This method provides a low cost alternative to commercially available units.

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

A protocol is described that uses anoxia/starvation in C. elegans to model ischemia/reperfusion. Functional outcomes include increased mortality, visible abnormalities in GFP-labeled neuronal processes, and impaired behavioral responses that require neuronal function.

דגם אנוקסיה רעב לאיסכמיה / reperfusion ב<em&gt; ג elegans</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound responses and repair in this model have illuminated our understanding of the cytoskeletal and genomic responses to tissue damage. The two most commonly used methods to wound the C. elegans adult skin are pricks with microinjection needles, and local laser irradiation. Needle wounding locally disrupts the cuticle, epidermis, and associated extracellular matrix, and may also damage internal tissues. Laser irradiation results in more localized damage. Wounding triggers a succession of readily assayed responses including elevated epidermal Ca2+ (seconds-minutes), formation and closure of an actin-containing ring at the wound site (1-2 hr), elevated transcription of antimicrobial peptide genes (2-24 hr), and scar formation. Essentially all wild type adult animals survive wounding, whereas mutants defective in wound repair or other responses show decreased survival. Detailed protocols for needle and laser wounding, and assays for quantitation and visualization of wound responses and repair processes (Ca dynamics, actin dynamics, antimicrobial peptide induction, and survival) are presented.

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The adult C. elegans skin is a tractable model for studies of epithelial wound responses, including wound closure, scar formation, and innate immunity.

שיטות לעור פציעה ומבחנים לתגובות פצע ב<em&gt; C. elegans</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...