עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי קנזס INBRE, P20GM103418 ללי וזיאנובייבה ו- R35GM124828 לזינובייבה. אנו מודים למין האן על שיתוף הנוגדן נגד איי-איי-1 בנדיבות. חלק מהזנים המשמשים במהלך עבודה זו סופקו על ידי המרכז לגנטיקה Caenorhabditis (CGC), במימון משרד NIH של תוכניות תשתית מחקר (P40 OD010440).

1. איסוף דגימת תולעת
<ol><li>זרע שלב מעורב אומסונכרן 13 תולעים על לוחות מוצקים NGM בטמפרטורה הנדרשת ולאפשר לתולעים לגדול עד השלב הרצוי. לצמיחה ותחזוקה בסיסיות של C. elegans, אנא ראו Stiernagle et al. ופורטה-דה-לה-ריבה ואח '14,13.</li>
	<li>לאסוף תולעים בצינור צנטריפוגה חרוט 15 מ"ל על ידי שטיפת לוחות התולעת עם חיץ M9.</li>
	<li>גלולה את התולעים על ידי צנטריפוגה ב 400 x גרם בטמפרטורת החדר (RT) במשך 2 דקות ולהשליך את supernatant. הערה: גודל גלולת התולעת להכנת תמצית הוא בין 100 μL ו 500 μL. גלולה 300 μL של תולעים ארוז מומלץ לניסויים immunoprecipitation במורד הזרם ובדרך כלל מניב ~ 4.5 מ"ג של חלבון הכולל, בעוד גלולה μL 500 יניב ~ 7.5 מ"ג של חלבון הכולל.</li>
	<li>בצעו שטיפות נוספות של 3-5 עם חיץ M9 (ראו טבלה 1)או עד שהעל-טבעי כבר לא יהיה מעונן.</li>
	<li>בצע שטיפה אחרונה עם ddH2O.</li>
	<li>להעביר את גלולת תולעת רופף לצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל ולסובב למטה ב 400 x g ב RT במשך 2 דקות. להשליך את supernatant הנותרים כדי לקבל גלולה תולעת ארוז ולהמשיך לחלץ הכנה. הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן. כדורי תולעת עשויים להיות פלאש קפוא חנקן נוזלי מיד ומאוחסן ב -80 מעלות צלזיוס או חנקן נוזלי. שים לב כי כדורי תולעת ניתן להפשיר רק פעם אחת ולא ניתן refrozen.</li>
</ol>2. לחלץ הכנת גלולת התולעת
הערה: הכנת התמצית צריכה להתבצע על קרח או ב 4 מעלות צלזיוס.
<ol><li>אם קפוא, להפשיר גלולת תולעת על קרח. הערה: אם גודל גלולת התולעת הארוזה הרצוי של 300 μL לא הושג במהלך איסוף מדגם, כדורי קטן מרובים ניתן לשלב עד מספיק חומר קיים עבור מיצוי נוסף.</li>
	<li>הוסף נפח שווה של מאגר תמוגה 2x קר כקרח (60 mM HEPES, pH = 7.4, 100 מ"מ אשלגן כלורי, 0.1% טריטון X, 4 מ"מ מגנזיום כלורי, 10% גליצרול, 2 מ"מ DTT עם מעכב RNase, מעכבי פרוטאז, מעכבי פוספטאז; ראה טבלה 1) ומערבולת או פיפטה למעלה ולמטה לערבב. סובבו את הצינור למטה כדי לאסוף את התערובת בתחתית הצינור.</li>
	<li>להעביר את התערובת לתוך צינור 1.5 מ"ל RNase ללא המכיל חרוזי מתכת (ראה טבלה של חומרים) ולשיםאת המדגם homogenizer טחנת חרוזים (ראה טבלה של חומרים)ב 4 מעלות צלזיוס. ודא כי כובעי הצינור מהודקו ואת הדגימות מאוזנות בתוך homogenizer.</li>
	<li>הומוגניזציה המדגם במהירות הגבוהה ביותר (הגדרת 12) במשך 4 דקות.</li>
	<li>הסר את המדגם מן החרוזים ומניחים אותו לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה חדש 1.5 מ"ל. לחלופין, מגנט המסופק עם homogenizer יכול לשמש כדי להסיר את החרוזים מן המדגם.</li>
	<li>סובבו את התמצית ב-19,000 x גרם למשך 20 דקות ב-4 מעלות צלזיוס כדי להבהיר את תמצית החלבון.</li>
	<li>מעבירים את ה-supernatant לצינור טרי של 1.5 מ"ל על הקרח, תוך הימנעות מהשתלטות על המשקעים הלבנים, המעוננים, שנוצרים מעל המדגם. הסופרנט הוא עכשיו התמצית המובהרת. הערה: שמור 10 μL של תמצית הבהיר כדי לקבוע את ריכוז החלבון הכולל.</li>
	<li>השתמש בתמצית מיד לניסויים הבאים או פלאש להקפיא את התמצית חנקן נוזלי ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס. הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן. תמציות ניתן לאחסן בטמפרטורה אולטרה נמוכה (-80 מעלות צלזיוס מקפיא או חנקן נוזלי במשך ~ 6 חודשים). תמציות קפואות עלולות להיות מופשרות פעם אחת ולא ניתן לחדד.</li>
	<li>לקבוע את ריכוז החלבון הכולל של התמצית באמצעות ערכת מבחני ריכוז חלבון התואמת לחומרי ניקוי (ראה טבלת חומרים)בהתאם להוראות היצרן.</li>
</ol>3. כשל חיסוני
הערה: כל שלבי האימונופרציפיטציה להכנת תמצית צריכים להתבצע על קרח או ב 4 מעלות צלזיוס. מומלץ להשתמש 2 מ"ג של חלבון הכולל עבור כל immunoprecipitation. עם זאת, בוצעו בדיקות חיסוניות מוצלחות עם 0.8–1 מ"ג חלבון כולל. יש להשתמש תמיד בתמציות חלבון טריות או טריות. הפרוטוקול הבא מתואר לביצוע כשל חיסוני מ-2 מ"ג חלבון כולל, או ניסוי אימונו-פרציפיטציה יחיד. ניתן להגדיל או להקטין את כמות החרוזים והנוגדנים בהתאם לדגימות מרובות או אם נעשה שימוש בכמות אחרת של תמצית חלבון.
<ol><li>מניחים או מפשירים את תמצית החלבון על הקרח. המדגם יכול להיות מדולל ל 10 מ"ג / מ"ל או 5 מ"ג / מ"ל עם מאגר תמוגה קר כקרח 1x (ראה טבלה 1).</li>
	<li>להחזיר את החרוזים המגנטיים על ידי היפוך ולהעביר 150 μL של השעיית חרוזים 50% לתוך צינור 1.5 מ"ל. ממגנטים את החרוזים על הקרח כנגד מעמד מגנטי למשך דקה או עד שהפתרון ברור. השלך את הסופרנט.</li>
	<li>הסר את הצינור מהמעמד המגנטי ולשטוף את החרוזים במאגר תמוגה 1x באמצעות 2 כרכים (כלומר, 300 μL) של תרחיף חרוזים. חזור על לשטוף 2x עבור סך של שלוש שטיפות.</li>
	<li>להחזיר את החרוזים ב 150 μL של חיץ תמוגה קר כקרח.</li>
	<li>מעבירים 75 μL של תרחיף החרוזים ל-2 מ"ג תמצית חלבון ודגורה ב-4 מעלות צלזיוס למשך שעה עם תסיסה עדינה. שמור את השעיית החרוזים הנותרת על הקרח לשימוש מאוחר יותר. הערה: שלב זה מבוצע כדי להפחית חלבון לא ספציפי מחייב חרוזים במהלך שלב immunoprecipitation.</li>
	<li>מניחים את הצינור עם מדגם על המעמד המגנטי על הקרח במשך דקה או עד החרוזים ממוגנטים לחלוטין ואת המדגם ברור. להעביר את supernatant לצינור חדש 1.5 מ"ל; אל תפריעו חרוזים. זהו ליסטר החלבון precleared. שמור 10% מהמדגם לניתוח כתמים מערביים.</li>
	<li>מוסיפים 20 מיקרוגרם של זיקה נוגדן מטוהרים lysate precleared ואת הדגירה ב 4 °C (69 °F) עבור 1 h עם תסיסה עדינה. הערה: כמות הנוגדנים המשמשים immunoprecipitation הוא ספציפי נוגדן וחלבון צריך להיות נחוש באופן אמפירי כדי להבטיח immunoprecipitation יעיל של חלבון היעד.</li>
	<li>מוסיפים את 75 μL הנותרים של השעיית החרוזים השטויפים מראש (שלב 3.5) לתערובת הנוגדנים /lysate ואת הדגירה במשך 1 שעות ב 4 מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה.</li>
	<li>מניחים את הצינור בדוכן המגנטי על הקרח במשך דקה או עד החרוזים ממוגנטים לחלוטין ואת המדגם ברור. שמור את supernatant עבור ניתוח כתם מערבי (אופציונלי).</li>
	<li>לשטוף את החרוזים המכילים immunoprecipitate 3x ב 450 μL של חוצץ לשטוף (30 mM HEPES, pH = 7.4, 100 מ"מ אשלגן כלורי, 0.1% טריטון X, 2 מ"מ מגנזיום כלורי, 10% גליצרול, 1 מ"מ DTT; ראה טבלה 1) על קרח. הערה: שטיפות נוספות עשויות להתבצע אם עדיף על תנאי כביסה מחמירים יותר.</li>
	<li>Resuspend גלולת חרוז ב 20 μL של 2x SDS / BME חלבון ג'ל טעינה מאגר (ראה טבלה של חומרים)ו denature על ידי רותחים ב 95 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות לפני טעינה על ג'ל SDS-PAGE. לחלופין, דגימות denatured ניתן לאחסן ב -20 מעלות צלזיוס במשך מספר חודשים. הערה: חלק של immunoprecipitate חרוז ניתן לשמור לבידוד RNA במורד הזרם, אם תרצה.</li>
</ol>4. זיהוי כתמים מערביים של דגימות IP
<ol><li>טען את דגימות ה- IP על ג'ל SDS-PAGE (ראה טבלת חומרים). הימנע העברת החרוזים על ידי הצבת צינורות IP על המעמד המגנטי במשך 1 דקה לפני השאיפה של המדגם.</li>
	<li>בצע את הכתם המערבי15,16 ו נוגדן מכתים16 עם השינויים הבאים: לדלל את הנוגדן ALG-117 1:500 ב 5% חלב יבש ללא שומן (NFDM); לדלל את הנוגדן HRPK-12 1:1,000 ב 5% NFDM; ולדלל את הנוגדןAIN-1 18 1:10,000 ב 5% NFDM. נוגדנים משניים (ראו טבלת חומרים)שימשו בהתאם להוראות היצרן.</li>
	<li>לזהות את הרצועות עם chemiluminescence מבוסס HRP (ראה טבלה של חומרים).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+AP-MS-+and+BioID-compatible+MAC-tag+enables+comprehensive+mapping+of+protein+interactions+and+subcellular+localizations.">An AP-MS- and BioID-compatible MAC-tag enables comprehensive mapping of protein interactions and subcellular localizations.</a> Nature Communications. 9 (1), 1188-1216 (2018).</li><li>Li, L., Veksler-Lublinsky, I., Zinovyeva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HRPK-1,+a+conserved+KH-domain+protein,+modulates+microRNA+activity+during+Caenorhabditis+elegans+development.">HRPK-1, a conserved KH-domain protein, modulates microRNA activity during Caenorhabditis elegans development.</a> PLoS Genetics. 15 (10), 1008067 (2019).</li><li>Zinovyeva, A. Y., Veksler-Lublinsky, I., Vashisht, A. A., Wohlschlegel, J. A., Ambros, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+ALG-1+antimorphic+mutations+uncover+functions+for+Argonaute+in+microRNA+guide+strand+selection+and+passenger+strand+disposal.">Caenorhabditis elegans ALG-1 antimorphic mutations uncover functions for Argonaute in microRNA guide strand selection and passenger strand disposal.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 5271-5280 (2015).</li><li>Hammell, C. M., Lubin, I., Boag, P. R., Blackwell, T. K., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=nhl-2+Modulates+microRNA+activity+in+Caenorhabditis+elegans.">nhl-2 Modulates microRNA activity in Caenorhabditis elegans.</a> Cell. 136 (5), 926-938 (2009).</li><li>Zou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+decline+in+neuronal+regeneration+by+the+progressive+change+of+two+intrinsic+timers.">Developmental decline in neuronal regeneration by the progressive change of two intrinsic timers.</a> Science. 340 (6130), 372-376 (2013).</li><li>Zanin, E., Dumont, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+purification+of+protein+complexes+in+C.+elegans.">Affinity purification of protein complexes in C. elegans.</a> Methods in Cell Biology. 106, 289-322 (2011).</li><li>Bhaskaran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+Caenorhabditis+elegans+the+easy+way+using+the+Balch+homogenizer:+an+old+tool+for+a+new+application.">Breaking Caenorhabditis elegans the easy way using the Balch homogenizer: an old tool for a new application.</a> Analytical Biochemistry. 413 (2), 123-132 (2011).</li><li>Kohl, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plate-based+Large-scale+Cultivation+of+Caenorhabditis+elegans:+Sample+Preparation+for+the+Study+of+Metabolic+Alterations+in+Diabetes.">Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e58117 (2018).</li><li>Larance, M., Bailly, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable-isotope+labeling+with+amino+acids+in+nematodes.">Stable-isotope labeling with amino acids in nematodes.</a> Nature Methods. 8 (10), 849-851 (2011).</li><li>Ding, L., Han, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GW182+family+proteins+are+crucial+for+microRNA-mediated+gene+silencing.">GW182 family proteins are crucial for microRNA-mediated gene silencing.</a> Trends in Cell Biology. 17 (8), 411-416 (2007).</li><li>Ding, L., Spencer, A., Morita, K., Han, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Developmental+Timing+Regulator+AIN-1+Interacts+with+miRISCs+and+May+Target+the+Argonaute+Protein+ALG-1+to+Cytoplasmic+P+Bodies+in+C.+elegans.">The Developmental Timing Regulator AIN-1 Interacts with miRISCs and May Target the Argonaute Protein ALG-1 to Cytoplasmic P Bodies in C. elegans.</a> Molecular Cell. 19 (4), 437-447 (2005).</li><li>Jannot, G., Vasquez-Rifo, A., Simard, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Argonaute+Pull-Down+and+RISC+Analysis+Using+2&#8217;-O-Methylated+Oligonucleotides+Affinity+Matrices.">Argonaute Pull-Down and RISC Analysis Using 2&#8217;-O-Methylated Oligonucleotides Affinity Matrices.</a> Methods in Molecular Biology. 725, 233-249 (2011).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: the Online Review of C. elegans Biology. , 1-11 (2006).</li><li>Gallagher, S., Chakavarti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoblot+analysis.">Immunoblot analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (16), e759 (2008).</li><li>Eslami, A., Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blotting:+sample+preparation+to+detection.">Western blotting: sample preparation to detection.</a> Journal of Visualized Experiments. (44), e2359 (2010).</li><li>Zinovyeva, A. Y., Bouasker, S., Simard, M. J., Hammell, C. M., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+conserved+residues+of+the+C.+elegans+microRNA+Argonaute+ALG-1+identify+separable+functions+in+ALG-1+miRISC+loading+and+target+repression.">Mutations in conserved residues of the C. elegans microRNA Argonaute ALG-1 identify separable functions in ALG-1 miRISC loading and target repression.</a> PLoS Genetics. 10 (4), 1004286 (2014).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+Identification+of+C.+miRISC+Proteins,+miRNAs,+and+mRNA+Targets+by+Their+Interactions+with+GW182+Proteins+AIN-1+and+AIN-2.">Systematic Identification of C. miRISC Proteins, miRNAs, and mRNA Targets by Their Interactions with GW182 Proteins AIN-1 and AIN-2.</a> Molecular Cell. 28 (4), 598-613 (2007).</li><li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Transparent+Window+into+Biology:+A+Primer+on+Caenorhabditis+elegans.">A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).</li><li>Farboud, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Genome+Editing+with+Cas9+Ribonucleoprotein+in+Diverse+Cells+and+Organisms.">Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms.</a> Journal of Visualized Experiments. (135), e57350 (2018).</li><li>Dickinson, D. J., Goldstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Based+Methods+for+Caenorhabditis+elegans+Genome+Engineering.">CRISPR-Based Methods for Caenorhabditis elegans Genome Engineering.</a> Genetics. 202 (3), 885-901 (2016).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

ג. אלגנס הוא מודל מצוין לחקר שאלות יסוד בביולוגיה תאית, מולקולרית והתפתחותית19. בנוסף לכוחה כמערכת מודלים גנטיים, C. elegans הוא נוח לגישות ביוכימיות, כולל, אך לא רק, חיסוניות חלבון ו- co-immunoprecipitation. משוכה פוטנציאלית אחת בעת ביצוע ניסויים immunoprecipitation הוא חוסר נוגדנים ספציפיים חלבונים של עניין. אם אין נוגדן זמין, נוגדנים פוליקלונליים או חד שבטיים מותאמים אישית יכולים להיווצר. עם זאת, החידושים האחרונים בטכנולוגיית עריכת הגנום אפשרו לחוקרים להציג במהירות מוטציות או לתייג גנים אנדוגניים C. elegans 20,21, להקל על מחקרים לפענח את האינטראקציות הגנטיות, התפקודיות והפיזיות בין הגנים והחלבונים המקודדים. באופן ספציפי, תיוג בתיווך CRISPR/Cas9 של גנים C. elegans בלוקוסים אנדוגני הפחית את התלות של ניסויים immunoprecipitation על זמינות נוגדנים, מה שהופך ניסויים חיסוניים משותפים הרבה יותר ריאלי. C. גנים אלגנים ניתן לתייג עם מגוון רחב של תגים החל תגים פלואורסצנטיים כגון GFP או mCherry לתגים קטנים כגון דגל HA. נוגדנים המזהים תגים אלה זמינים מסחרית, מה שמקל על מחקרים של אינטראקציות חלבון-חלבון באמצעות גישות immunoprecipitation.
את הפרוטוקול המוצג, המתואר באיור 1, ניתן לבצע עבור מספר קטן של דגימות או לשנות את קנה המידה, מה שמאפשר עד 24 הכנות לדוגמה בכל פעם. בעוד האפיונים הראשוניים של אינטראקציות חלבון-חלבון באמצעות immunoprecipitation נעשים בדרך כלל ברקעים מסוג בר בתנאי גידול נורמליים, מחקרי מעקב לעתים קרובות מחייבים בדיקת אינטראקציות חלבון חלבון במגוון של רקעים גנטיים או בתנאי צמיחה שונים. היכולת להכין בו זמנית תמציות מרובות חוסכת זמן, וחשוב מכך, מבטיחה עקביות הכנת תמצית בין הדגימות השונות. תמיד נדרשת שליטה שלילית, כאשר השליטה האידיאלית היא מוטציה בטלה בקידוד הגנים עבור החלבון בעל השליטה במערכת החיסון (ראו איור 3 ואיור 4 לדוגמאות).
פרוטוקול תמצית זה מאפשר הכנת תמצית חלבון מהירה מדגימות C. elegans והוא דומה הומוגניזציה מבוססת חרוזי זירקוניום8. הומוגניזציה חרוזים באופן כללי ניתן לשנות עד תכשירים מדגם בו זמנית מרובים באמצעות מגוון רחב של homogenizers טחנת חרוזים או ציוד דומה. כמה homogenizers טחנת חרוז חסכוני יותר עשוי להפחית את מספר הדגימות שניתן לעבד בו זמנית, עם זאת. לחלופין, פרוטוקול התמצית המוצג תואם להכנת תמצית מבוססת dounce, המייצגת חלופה חסכונית. בעוד homogenizers טחנת חרוזים שונים לא נבדקו, רובם עשויים להיות תואמים לפרוטוקול תמצית חלבון זה, כל עוד שיבוש מוחלט של דגימות C. elegans מושגת.
כפי שהוצג, פרוטוקול הכנת תמצית זה תואם לניסויים מרובים במורד הזרם, כולל אימונו-פרציפיטציה של חלבונים2 ומיקרו-רנ"א12 ומאפשר איסוף במורד הזרם של רכיבי חלבון ו-RNA כאחד. הוא גם מחלץ ביעילות חלבונים גרעיניים וציטופלסמיים(איור 2, איור 3 ואיור 4). באופן דומה, פרוטוקול immunoprecipitation שהוצג מאפשר בידוד RNA מ immunoprecipitates הקשורים לחלבון. בעוד פרוטוקול immunoprecipitation פותח במקור כדי לזהות אינטראקציות חלבון ALG-1, השיטה יכולה להיות מותאמת לבדיקת אינטראקציות בין כל חלבונים מעניינים. למעשה, תנאי האימונופרציפיטציה שבהם נעשה שימוש עבדו באותה מידה עבור מערכת חיסונית ALG-1(איור 3)ו-HRPK-1(איור 4). פרוטוקול זה הוא נקודת התחלה מצוינת עבור immunopurification של חלבונים מחייבי RNA. יש לציין, עם זאת, כי שינויים מסוימים בהרכב החיץ עשויים להידרש עבור חלבונים אחרים של עניין. השינויים עשויים להיות תלויים בתכונות הפיזיות והביוכימיות של החלבון המעניין ויש ליישם אותו על בסיס כל מקרה לגופו.
לאחר חלבון היעד (כאן, ALG-1 או HRPK-1) הוא immunoprecipitated, סופג מערבי יכול לשמש כדי לבדוק את שיתוף immunoprecipitate עבור אינטראקציות חלבון ספציפיות.
לחלופין, immunoprecipitate copurified יכול להיות נתון לניתוח ספקטרומטריה המונית כדי לזהות את כל החלבונים אינטראקציה putative. לאחר מכן ניתן לבחון אינטראקציות מאומתות של חיסונים משותפים במגוון רקעים גנטיים או תנאים לזיהוי ויסות פוטנציאלי של האינטראקציה הספציפית. לדוגמה, כדי לקבוע אם hrpk-1 ממלא תפקיד בהרכבה ALG-1/AIN-1 miRISC, ALG-1-AIN-1 הוערך הן ברקע מסוג פראי והן בהיעדר HRPK-1 (איור 3). hrpk-1 נמצאה לוותר על ALG-1/AIN-1 אינטראקציה2 (איור 3). בנוסף, ניתן להציע טכנולוגיית עריכת גנום CRISPR/Cas9 כדי ליצור מוטציות חד-נקודתיות או מחיקת דומיין בחלבונים המעניינים. בדיקה חוזרת של היכולת של המוטנטים שנוצרו להתמודד עם אינטראקציות החלבון שלהם יכולה לחשוף אילו תחומים או שאריות מתווכים את האינטראקציה הפיזית. מחקרים עתידיים כאלה יכולים להניב מידע שלא יסולא בפז על המנגנון של תפקוד חלבון ורגולציה. גישות אלה, בשילוב עם כוחה של הגנטיקה C. elegans, יכולות לספק תובנות חשובות על התהליכים המולקולריים הבסיסיים השולטים בהתפתחות בעלי החיים ובתפקוד התאי.

זיהוי האינטראקציות המקרומולקולריות של חלבון בעל עניין יכול להיות המפתח ללמוד עוד על תפקודו. ניסויים אימונו-חיסוניים וניסויי חיסון משותף יכולים לשמש לזיהוי כל האינטראקציה של חלבון באמצעות גישות פרוטאומיות בקנה מידה גדול1 או כדי לבדוק באופן ספציפי את יכולתו של חלבון להתמודד עם אינטראקציה המשוערת. ב C. elegans, שתי השיטות שימשו בהצלחה כדי ללמוד יותר על הפעילות של מגוון רחב של חלבונים, כולל אלה הפועלים באופן הדוק עם microRNAs לווסת ביטויגנים 2,3,4. ניסויי חיסון משותף יש את היתרון של בדיקת אינטראקציות חלבון חלבון בסביבה התאית המקורית שלהם, אבל הכנת תמצית יכול להיות מאתגר זמן רב. תמוגה יעילה של המדגם היא הכרחית, אבל יש להקפיד כדי למזער את ההפרעה של אינטראקציות חלבון חלבון. שיטות כגון douncing5, sonication6, הומוגניזציה בלך7, ו זירקוניה חרוזים הומוגניזציה8,9 שימשו בהצלחה להכין C. elegans תמציות חלבון הכולל. לשיטות אלה, למעט הומוגניזציה של חרוזי זירקוניה, יש מגבלות מבחינת מספר הדגימות שניתן לעבד בו זמנית. מוצגת היא שיטה חלופית שניתן לשנות בקלות כדי לאפשר תפוקה גבוהה, הכנת תמצית חלבון מהירה מדגימות C. elegans ואחריו שיתוף immunoprecipitation. באופן ספציפי, השיטה יכולה להכין עד 24 דגימות בכל פעם, מאוד להפחית את הזמן הנדרש להכנת תמצית. לעומת זאת, לדוגמה, douncing בדרך כלל מאפשר הכנה מדגם אחד בלבד בכל פעם. שיטת תמצית זו יכולה לשמש להכנת תמציות מכל שלב התפתחותי של C. elegans.
המתואר הוא הליך צעד אחר צעד לאיסוף דגימות בעלי חיים, הכנת תמצית, immunoprecipitation, והצגת נתוני נפיחות מערביים כדי לאשר נסיגה מוצלחת של חלבון וזיהוי של חלבון שיתוף immunoprecipitating של עניין. כדי להדגים את האפקטיביות של הפרוטוקול, שני ניסויים שיתוף אימונו-חיסוני בוצעו בין 1) microRNA Argonaute ALG-1 ו- AIN-1, הומולוגי GW182; ו-2) ALG-1 ו- HRPK-1, אינטראקציה ALG-1 שזוהתה לאחרונה2. ALG-1 ו- AIN-1 הם חלבוני ליבה המרכיבים את קומפלקס ההשתקה הנגרמת על ידי microRNA (miRISC) והאינטראקציה בין שני חלבונים אלה מבוססת היטב10,11. פרוטוקול הכנת התמצית היה יעיל בניסוי החיסון המשותף ALG-1-AIN-1. פרוטוקול זה גם אישר בהצלחה את האינטראקציה בין ALG-1 לבין האינטראקציה החדשה שזוהתה,HRPK-12.
לסיכום, כתב היד מתאר פרוטוקול הכנה תמצית C. elegans שניתן לשנות את קנה המידה שלו עד בו זמנית לעבד 24 דגימות יחד עם פרוטוקול חיסוני משותף שניתן להשתמש בו כדי לזהות אינטראקציות חדשות או לאשר השערות בין חלבונים. פרוטוקול הכנת התמצית תואם למספר ניסויים במורד הזרם, כולל אימונופרציפיטציה של חלבונים2 ומיקרו-רנ"א נסוג12. יתר על כן, פרוטוקול immunoprecipitation יכול להיות מותאם לבדיקת אינטראקציות בין כל שני או יותר אנדוגני, מתויג אנדוגני, או overexpressed C. חלבונים אלגנס במגוון של רקעים גנטיים.

<table><tbody><tr><td>15 mL tube</td><td>VWR</td><td>89039-664</td><td>STEP 1.2</td></tr><tr><td>2x Laemmli Sample Buffer</td><td>BioRed</td><td>1610737</td><td>STEP 3.11</td></tr><tr><td>4&amp;ndash;20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels</td><td>BioRed</td><td>4561096</td><td>STEP 4.1</td></tr><tr><td>anti-AIN-1 monoclonal antibody</td><td>custom generated</td><td>n/a</td><td>STEP 4.2, see ref. Zhang et al. 2007</td></tr><tr><td>anti-ALG-1 monoclonal antibody</td><td>custom generated by PRF&amp;amp;L</td><td>n/a</td><td>STEP 4.2</td></tr><tr><td>anti-HRPK-1 monoclonal antibody</td><td>custom generated by PRF&amp;amp;L</td><td>n/a</td><td>STEP 4.2</td></tr><tr><td>Bullet Blender Storm Homogenizer</td><td>MidSci</td><td>BBY24M</td><td>STEP 2.3</td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma</td><td>D9779-5G</td><td>Table 1</td></tr><tr><td>Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation</td><td>Thermo Fisher</td><td>10002D</td><td>STEP 3.2</td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnet</td><td>Thermo Fisher</td><td>12321D</td><td>STEP 3.2</td></tr><tr><td>EDTA-free protease inhibitors</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td>Table 1</td></tr><tr><td>GFP antibody (FL)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-8334</td><td>Figure 2</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Thermo Fisher</td><td>G33-500</td><td>Table 1</td></tr><tr><td>Goat Anti-Rabbit Secondary Antibody, HRP</td><td>BioRed</td><td>1662408</td><td>STEP 4.2</td></tr><tr><td>Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP</td><td>Thermo Fisher</td><td>31470</td><td>STEP 4.2</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034-500G</td><td>Table 1</td></tr><tr><td>LICOR WesternSure PREMIUM Chemiluminescent Substrate, 100 mL Kit</td><td>LI-COR</td><td>926-95000</td><td>STEP 4.3</td></tr><tr><td>Magnesium chloride hexahydrate ACS</td><td>VWR</td><td>VWRV0288-500G</td><td>Table 1</td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate Anhydrous</td><td>Thermo Fisher</td><td>M65-500</td><td>Table 1</td></tr><tr><td>Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL</td><td>VWR</td><td>20170-333</td><td>STEP 1.6</td></tr><tr><td>N2 wild type</td><td>CGC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Navy RINO RNA Lysis Kit 50 pack (1.5 mL)</td><td>MidSci</td><td>NAVYR1-RNA</td><td>STEP 2.3</td></tr><tr><td>Phosphatase inhibitor cocktail 2</td><td>Sigma</td><td>P5726-1ML</td><td>Table 1</td></tr><tr><td>Phosphatase inhibitor cocktail 3</td><td>Sigma</td><td>P0044-1ML</td><td>Table 1</td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>Thermo Fisher</td><td>P217-500</td><td>Table 1</td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic</td><td>Thermo Fisher</td><td>P285-3</td><td>Table 1</td></tr><tr><td>RC DC Protein Assay Kit I</td><td>BioRed</td><td>5000121</td><td>STEP 2.9</td></tr><tr><td>RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor</td><td>Thermo Fisher</td><td>10777019</td><td>Table 1</td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Thermo Fisher</td><td>S271-500</td><td>Table 1</td></tr><tr><td>Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous</td><td>Thermo Fisher</td><td>S374-500</td><td>Table 1</td></tr><tr><td>TritionX-100</td><td>Sigma</td><td>X100-500ML</td><td>Table 1</td></tr><tr><td>UY38 hrpk-1(zen17)</td><td>available upon request</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VT1367 col-19::gfp(maIS105)</td><td>available upon request</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VT3841 alg-1(tm492)</td><td>available upon request</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

protein extract preparation and co-immunoprecipitation from caenorhabditis elegans

שיטות חיסון משותף משמשות לעתים קרובות לחקר אינטראקציות חלבון-חלבון. אישור של אינטראקציות חלבון חלבון המשוערות או זיהוי של חדשים יכול לספק מידע רב ערך על הפונקציה של חלבון של עניין. חלק מהשיטות המסורתיות להכנת תמצית דורשות לעתים קרובות טכניקות עתירות עבודה וגוזלות זמן. כאן, פרוטוקול הכנת תמצית שונה באמצעות homogenizer טחנת חרוזים חרוזי מתכת מתואר כחלופה מהירה לשיטות הכנת חלבון מסורתיות. שיטת הכנת תמצית זו תואמת למחקרי חיסון משותף במורד הזרם. כדוגמה, השיטה שימשה בהצלחה שיתוף immunoprecipitate C. elegans microRNA Argonaute ALG-1 ושני אינטראקציות ידועות ALG-1: AIN-1, ו HRPK-1. פרוטוקול זה כולל תיאורים של איסוף דגימות בעלי חיים, הכנת תמצית, הבהרה תמצית, ו immunoprecipitation חלבון. הפרוטוקול המתואר יכול להיות מותאם לבדיקת אינטראקציות בין כל שני או יותר אנדוגני, מתויג אנדוגני, או overexpressed C. elegans חלבונים במגוון של רקעים גנטיים.

פרוטוקול זה (סכמטי באיור 1)שימש בהצלחה להשגת תמציות חלבון סה"כ של C. elegans (איור 2) עבור כשל חיסוני במורד הזרם של מספר חלבונים2 (איור 3 ואיור 4). פרוטוקול ההומוגניזר של טחנת החרוזים שהוצג היה דומה בסך הכל מיצוי החלבון לשיטות מבוססות דונסה(איור 2)ומופק ביעילות גרעינית (COL-19::GFP(NLS) (איור 2)וחלבונים ציטופלזמיים (איור 3 ואיור 4). דגימות מרובות בגדלים שונים חולצו בו זמנית (איור 2). חלבונים Argonaute אינטראקציה עם בני משפחת החלבון GW182, להרכיב את miRISCs כי לאגד RNAs שליח היעד ולהדחיק את הביטוי שלהם10. איור 3 מראה חיסון משותף מוצלח של רכיבי miRISC בסיסיים ALG-1 ו- AIN-1, בהתאם לדיווחיםקודמים 11,17. לאחרונה נעשו מאמצים לזהות אינטראקציות חלבון נוספות של ArgonauteALG-13 על מנת ללמוד עוד על האופן שבו ביוגנזה ופעילות microRNA עשויות להיות מוסדרות על ידי גורמי עזר. החלבון המחייב RNA HRPK-1 זוהה ב ALG-1 immunoprecipitates3. אינטראקציה זו אושרה לאחרונה בניסוי חיסוני HRPK-1 הדדי2. פרוטוקולי התמצית והחיסוניות שהוצגו הצליחו לשחזר את ALG-1 ב- HRPK-1-ספציפי ל- co-immunoprecipitates (איור 4). בנוסף, האינטראקציה ALG-1-AIN-1 נבדקה במגוון רקעים גנטיים ו- HRPK-1 הוכח כמיותר עבור הרכבת ALG-1/AIN-1 miRISC2 (איור 3). נתונים משלימים מסופקים כדי להראות את הממברנה המלאה שנבדקה (איור משלים 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61243/61243fig1.jpg"> איור 1: סכמטי זרימת עבודה עבור C. elegans לחלץ הכנה ו immunoprecipitation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61243/61243fig1large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61243/61243fig2.jpg"> איור 2: השוואת כתמים מערבית של GFP מקומי גרעיני, COL-19::GFP(NLS), רמות בדגימות מוכנות dounce והומוגני מ 250 μL ו 100 כדורי תולעת μL. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61243/61243fig2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61243/61243fig3.jpg"> איור 3: GW182 הומולוגית AIN-1 שיתוף אימונו-פרופרציטיאטים עם ALG-1. סופג מערבי לחלבוני ALG-1 ו-AIN-1 באימונופרציפיטטים ALG-1. מערכת החיסון המשותפת ALG-1/AIN-1 לא הושפעה מהיעדר hrpk-1. קלט = 10% של IP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61243/61243fig3large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61243/61243fig4.jpg"> איור 4: ALG-1 שיתוף אימונו-חיסוני עם HRPK-1. סופג מערבי עבור HRPK-1 ו ALG-1 ב HRPK-1 immunoprecipitates מוצג. קלט = 10% של IP. * מציין שרשרת כבדה נוגדנים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61243/61243fig4large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">מאגר M9 (1 L)</td>
		</tr>
<tr>
<td>KH2PO4
</td>
			<td>3 גר'</td>
		</tr>
<tr>
<td>Na2HPO4
</td>
			<td>6 גר'</td>
		</tr>
<tr>
<td>נקלה (נקל)</td>
			<td>5 גר'</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 מ"גסו4
</td>
			<td>1 מ"ל</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddH2O</td>
			<td>עד 1 L</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">מאגר תמוגה 2x (5 מ"ל)</td>
		</tr>
<tr>
<td>היפס (עמ' 7.4)</td>
			<td>200 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 M KCl</td>
			<td>250 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>10% טריטון אקס</td>
			<td>100 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M MgCl2
</td>
			<td>20 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>100% גליצרול</td>
			<td>1 מ"ל</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddH2O</td>
			<td>עד 5 מ"ל</td>
		</tr>
<tr>
<td>הוסף טרי:</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M DTT</td>
			<td>20 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>מעכב פרוטאז ללא EDTA</td>
			<td>טאבלט אחד</td>
		</tr>
<tr>
<td>קוקטייל מעכבי פוספטאז 2</td>
			<td>100 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>קוקטייל מעכבי פוספטאז 3</td>
			<td>100 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">מאגר תמוגה 1x</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">לדלל 2x מאגר תמוגה עם נפח שווה של ddH20.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">1x מאגר לשטוף 10 מ"ל)</td>
		</tr>
<tr>
<td>היפס (עמ' 7.4)</td>
			<td>300 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 M KCl</td>
			<td>500 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>10% טריטון אקס</td>
			<td>100 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M MgCl2
</td>
			<td>20 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>100% גליצרול</td>
			<td>1 מ"ל</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddH2O</td>
			<td>עד 10 מ"ל</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M DTT</td>
			<td>20 μL (להוסיף טרי)</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: מתכונים
איור משלים 1. קרום כתם מערבי מלא המשמש ליצירת איורים 2-4 מוצגים. (A) קרום בדיקה לאיור 2. שים לב כי הממברנה נחתכה כדי לאפשר בקשה לבדיקה בו זמנית עבור GFP ו Tubulin, צמצום גודל הכתם הכולל. (ב) קרום בדיקה לאיור 3. (ג) קרום בדיקה לאיור 3. *מציין שרשרת כבדה של נוגדנים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61243/Supplemental_Figure_1.pdf" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Protein Extract Preparation and Co-immunoprecipitation from Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Protein Extract Preparation and Co-immunoprecipitation from Caenorhabditis elegans

שיטה זו מתארת פרוטוקול להכנת תמצית חלבון בתפוקה גבוהה מדגימות אלגנים של Caenorhabditis ו- co-immunoprecipitation לאחר מכן.

הכנת תמצית חלבון ושיתוף חיסוני מאלגנים של קנורהאביטיס

Co-immunoprecipitation methods are frequently used to study protein-protein interactions. Confirmation of hypothesized protein-protein interactions or ...

protein-extract-preparation-co-immunoprecipitation-from

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Protein Extract Preparation and Co-immunoprecipitation from Caenorhabditis elegans

8.8K Views.  Kansas State University. שיטה זו מתארת פרוטוקול להכנת תמצית חלבון בתפוקה גבוהה מדגימות אלגנים של Caenorhabditis ו- co-immunoprecipitation לאחר מכן.

Video: Protein Extract Preparation and Co-immunoprecipitation from Caenorhabditis elegans

Identification of EGFR and RAS Inhibitors using Caenorhabditis elegans

The changes in the plasma membrane localization of the epidermal growth factor receptor (EGFR) and its downstream effector RAS have been implicated in several diseases including cancer. The free-living nematode C. elegans possesses an evolutionary and functionally conserved EGFR-RAS-ERK MAP signal cascade which is central for the development of the vulva. Gain of function mutations in RAS homolog LET-60 and EGFR homolog LET-23 induce the generation of visible nonfunctional ectopic pseudovulva along the ventral body wall of these worms. Previously, the multivulval (Muv) phenotype in these worms has been shown to be inhibited by small chemical molecules. Here we describe a protocol for using the worm in a liquid-based assay to identify inhibitors that abolish the activities of EGFR and RAS proteins. Using this assay, we show R-fendiline, an indirect inhibitor of K-RAS, suppresses the Muv phenotype expressed in the let-60(n1046) and let-23(sa62) mutant worms. The assay is simple, inexpensive, is not time consuming to setup, and can be used as an initial platform for the discovery of anticancer therapeutics.

Identification of EGFR and RAS Inhibitors using Caenorhabditis elegans

The genetically tractable nematode Caenorhabditis elegans can be used as a simple and inexpensive model for drug discovery. Described here is a protocol to identify anticancer therapeutics that inhibit the downstream signaling of RAS and EGFR proteins.

זיהוי מעכבי EGFR ו- RAS באמצעות אלגנים של Caenorhabditis

The changes in the plasma membrane localization of the epidermal growth factor receptor (EGFR) and its downstream effector RAS have been implicated in ...

Cancer Research

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, and protein-protein interactions. FPOP utilizes a KrF excimer laser at 248 nm for photolysis of hydrogen peroxide to generate hydroxyl radicals which in turn oxidatively modify solvent-accessible amino acid side chains. Recently, we expanded the use of FPOP of in vivo oxidative labeling in Caenorhabditis elegans (C. elegans), entitled IV-FPOP. The transparent nematodes have been used as model systems for many human diseases. Structural studies in C. elegans by IV-FPOP is feasible because of the animal&#8217;s ability to uptake hydrogen peroxide, their transparency to laser irradiation at 248 nm, and the irreversible nature of the modification. The assembly of a microfluidic flow system for IV-FPOP labeling, IV-FPOP parameters, protein extraction, and LC-MS/MS optimized parameters are described herein.

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In vivo fast photochemical oxidation of proteins (IV-FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting technique that allows for mapping of protein structure in their native environment. This protocol describes the assembly and set-up of the IV-FPOP microfluidic flow system.

ב Vivo הידרוקסיל חלבון רדיקלי מדפיס הדפסה לחקר אינטראקציות חלבונים באלבוראבאבדיטיס האלאים

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, ...

Biochemistry

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Caenorhabditis elegans has been an important model system for biological research since it was introduced in 1963. However, C. elegans has not been fully utilized in the biochemical study of biological reactions using its nuclear extracts such as in vitro transcription and DNA replication. A significant hurdle for using C. elegans in biochemical studies is disrupting the nematode&#39;s thick outer cuticle without sacrificing the activity of the nuclear extract. While several methods are used to break the cuticle, such as Dounce homogenization or sonication, they often lead to protein instability. There are no established protocols for isolating active nuclear proteins from larva or adult C. elegans for in vitro reactions. Here, the protocol describes in detail the homogenization of larval stage 4 C. elegans using a Balch homogenizer. The Balch homogenizer uses pressure to slowly force the animals through a narrow gap breaking the cuticle in the process. The uniform design and precise machining of the Balch homogenizer allow for consistent grinding of animals between experiments. Fractionating the homogenate obtained from the Balch homogenizer yields functionally active nuclear extract that can be used in an in vitro method for assaying transcription activity of C. elegans.

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Here, we describe a detailed protocol for isolating active nuclear extract from larval stage 4 C. elegans and visualizing transcription activity in an in vitro system.

בידוד של תמצית גרעינית פעילה של Caenorhabditis elegans ו reconstitution עבור תמלול במבחנה

Caenorhabditis elegans has been an important model system for biological research since it was introduced in 1963. However, C. elegans has not been fully ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, which are lipid signals derived from polyunsaturated fatty acids (PUFAs)10-14. These signalling molecules are difficult to study because of their low abundance and reactive nature. The characteristic feature of prostaglandins is a cyclopentane ring structure located within the fatty acid backbone. In mammals, prostaglandins can be formed through cyclooxygenase enzyme-dependent and -independent pathways10,15. C. elegans synthesizes a wide array of prostaglandins independent of cyclooxygenases6,16,17. A large class of F-series prostaglandins has been identified, but the study of eicosanoids is at an early stage with ample room for new discoveries. Here we describe a procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids. Charged lipids are extracted from mass worm cultures using a liquid-liquid extraction technique and analyzed by liquid chromatography coupled to electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). The inclusion of deuterated analogs of prostaglandins, such as PGF2 &alpha;-d4 as an internal standard is recommended for quantitative analysis. Multiple reaction monitoring or MRM can be used to quantify and compare specific prostaglandin types between wild-type and mutant animals. Collision-induced decomposition or MS/MS can be used to obtain information on important structural features. Liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) survey scans of a selected mass range, such as m/z 315-360 can be used to evaluate global changes in prostaglandin levels. We provide examples of all three analyses. These methods will provide researchers with a toolset for discovering novel eicosanoids and delineating their metabolic pathways.

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

In this paper, we describe an optimized procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids from C. elegans using LC-MS/MS.

הפקה וניתוח בפרוסטגלנדין<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Biology

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These age-associated disorders are characterized by the appearance of protein aggregates with fibrillary structure in the brains of these patients. Exactly why normally soluble proteins undergo an aggregation process remains poorly understood. The discovery that protein aggregation is not limited to disease processes and instead part of the normal aging process enables the study of the molecular and cellular mechanisms that regulate protein aggregation, without using ectopically expressed human disease-associated proteins. Here we describe methodologies to examine inherent protein aggregation in Caenorhabditis elegans through complementary approaches. First, we examine how to grow large numbers of age-synchronized C. elegans to obtain aged animals and we present the biochemical procedures to isolate highly-insoluble-large aggregates. In combination with a targeted genetic knockdown, it is possible to dissect the role of a gene of interest in promoting or preventing age-dependent protein aggregation by using either a comprehensive analysis with quantitative mass spectrometry or a candidate-based analysis with antibodies. These findings are then confirmed by in vivo analysis with transgenic animals expressing fluorescent-tagged aggregation-prone proteins. These methods should help clarify why certain proteins are prone to aggregate with age and ultimately how to keep these proteins fully functional.

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

The goal of the method presented here is to explore protein aggregation during normal aging in the model organism C. elegans. The protocol represents a powerful tool to study the highly insoluble large aggregates that form with age and to determine how changes in proteostasis impact protein aggregation.

שיטות מחקר לשינויים הגלום צבירת חלבון עם הגיל ב Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

A single biological sample holds a plethora of information, and it is now common practice to simultaneously investigate several macromolecules to capture a full picture of the multiple levels of molecular processing and changes between different conditions. This protocol presents the method of isolating DNA, RNA, and protein from the same sample of the nematode Caenorhabditis elegans to remove the variation introduced when these biomolecules are isolated from replicates of similarly treated but ultimately different samples. Nucleic acids and protein are extracted from the nematode using the acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction method, with subsequent precipitation, washing, and solubilization of each. We show the successful isolation of RNA, DNA, and protein from a single sample from three strains of nematode and HeLa cells, with better protein isolation results in adult animals. Additionally, guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform-extracted protein from nematodes improves the resolution of larger proteins, with enhanced detectable levels as observed by immunoblotting, compared to the traditional RIPA extraction of protein.
The method presented here is useful when investigating samples using a multiomic approach, specifically for the exploration of the proteome and transcriptome. Techniques that simultaneously assess multiomics are appealing because molecular signaling underlying complex biological phenomena is thought to occur at complementary levels; however, it has become increasingly common to see that changes in mRNA levels do not always reflect the same change in protein levels and that the time of collection is relevant in the context of circadian regulations. This method removes any intersample variation when assaying different contents within the same sample (intrasample.)

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

Here, we present a protocol for the isolation of RNA, DNA, and protein from the same sample, in an effort to reduce variation, improve reproducibility, and facilitate interpretations.

משולב נוקלאוטיד שיחולץ חלבון ב Caenorhabditis elegans

A single biological sample holds a plethora of information, and it is now common practice to simultaneously investigate several macromolecules to capture ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular vesicles (EVs) function outside the cell to regulate global physiological processes by transferring proteins, nucleic acids, metabolites, and lipids between tissues. EVs reflect the physiological state of their cells of origin. EVs are implicated to have fundamental roles in virtually every aspect of human health. Thus, EV protein and genetic cargos are being increasingly analyzed for biomarkers of health and disease. However, the EV field still lacks a tractable invertebrate model system that permits the study of EV cargo composition. C. elegans is well suited for EV research because it actively secretes EVs outside of its body into its external environment, permitting facile isolation. This article provides all the necessary information for generating, purifying, and quantifying these environmentally secreted C. elegans EVs including how to work quantitatively with very large populations of age-synchronized worms, purifying EVs, and a flow cytometry protocol that directly measures the number of intact EVs in the purified sample. Thus, the large library of genetic reagents available for C. elegans research can be tapped into for investigating the impacts of genetic pathways and physiological processes on EV cargo composition.

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

This article presents methods for generating, purifying, and quantifying Caenorhabditis elegans extracellular vesicles.

טיהור וניתוח מסחטות של האלקאים ושלפוחיות

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Quantification of Insoluble Protein Aggregation in Caenorhabditis elegans during Aging with a Novel Data-Independent Acquisition Workflow

We and others have shown that the aging process results in a proteome-wide accumulation of insoluble proteins. Knocking down genes encoding the insoluble proteins over 40% of the time results in an extension of the lifespan in C. elegans, suggesting that many of these proteins are key determinants of the aging process. Isolation and quantitative identification of these insoluble proteins are crucial to understand key biological processes that occur during aging. Here, we present a modified and improved protocol that details how to extract and isolate the SDS-insoluble proteins (insolublome) from C. elegans more efficiently to streamline mass spectrometric workflows via a novel label-free quantitative proteomics analysis. This improved protocol utilizes a highly efficient sonicator for worm lysis that greatly increases efficiency for protein extraction and allows us to use significantly less starting material (approximately 3,000 worms) than in previous protocols (typically using at least 40,000 worms). Subsequent quantitative proteomic analysis of the insolublome was performed using data-dependent acquisition (DDA) for protein discovery and identification and data-independent acquisition (DIA) for comprehensive and more accurate protein quantification. Bioinformatic analysis of quantified proteins provides potential candidates that can be easily followed up with other molecular methods in C. elegans. With this workflow, we routinely identify more than 1000 proteins and quantify more than 500 proteins. This new protocol enables efficient compound screening with C. elegans. Here, we validated and applied this improved protocol to wild-type C. elegans N2-Bristol strain and confirmed that aged day-10 N2 worms showed greater accumulation of the insolublome than day-2 young worms.

<meta charset="utf8"></head><body>כימות צבירת חלבונים בלתי מסיסים ב-Caenorhabditis elegans במהלך ההזדקנות עם זרימת עבודה חדשה של רכישה בלתי תלויה בנתונים

This novel workflow efficiently extracts and isolates SDS-insoluble proteins (insolublome) from Caenorhabditis elegans with minimal starting material for quantitative differential proteomic analysis. The protocol uses a comprehensive data-independent acquisition mass spectrometry analysis to quantify the insolublome and bioinformatic analysis to gain biological insights into aging mechanisms and pathologies.

כימות צבירת חלבונים בלתי מסיסים ב-Caenorhabditis elegans במהלך ההזדקנות עם זרימת עבודה חדשה של רכישה בלתי תלויה בנתונים

We and others have shown that the aging process results in a proteome-wide accumulation of insoluble proteins. Knocking down genes encoding the insoluble ...

Small-Scale Extraction of Caenorhabditis elegans Genomic DNA

Genomic DNA extraction from single or a few Caenorhabditis elegans has many downstream applications, including PCR for genotyping lines, cloning, and sequencing. The traditional proteinase K-based methods for genomic DNA extraction from C. elegans take several hours. Commercial extraction kits that effectively break open the C. elegans cuticle and extract genomic DNA are limited. An easy, faster (~15 min), and cost-efficient method of extracting C. elegans genomic DNA that works well for classroom and research applications is reported here. This DNA extraction method is optimized to use single or a few late-larval (L4) or adult nematodes as starting material for obtaining a reliable template to perform PCR. The results indicate that the DNA quality is suitable for amplifying gene targets of different sizes by PCR, permitting genotyping of single or a few animals even at dilutions to one-fiftieth of the genomic DNA from a single adult per reaction. The reported protocols can be reliably used to quickly produce DNA template from a single or a small sample of C. elegans for PCR-based applications.

Small-Scale Extraction of Caenorhabditis elegans Genomic DNA

Presented here is a description of the straightforward and relatively rapid isolation of Caenorhabditis elegans genomic DNA from one or a few animals using a commercially available tissue kit. The resulting gDNA preparation is a suitable template for PCR.

מיצוי בקנה מידה קטן של Caenorhabditis elegans דנ"א גנומי

Genomic DNA extraction from single or a few Caenorhabditis elegans has many downstream applications, including PCR for genotyping lines, cloning, and ...

הכנת תמצית חלבון ושיתוף חיסוני מאלגנים של קנורהאביטיס

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

זיהוי מעכבי EGFR ו- RAS באמצעות אלגנים של Caenorhabditis

ב Vivo הידרוקסיל חלבון רדיקלי מדפיס הדפסה לחקר אינטראקציות חלבונים באלבוראבאבדיטיס האלאים

בידוד של תמצית גרעינית פעילה של Caenorhabditis elegans ו reconstitution עבור תמלול במבחנה

הפקה וניתוח בפרוסטגלנדין

שיטות מחקר לשינויים הגלום צבירת חלבון עם הגיל ב Caenorhabditis elegans

משולב נוקלאוטיד שיחולץ חלבון ב Caenorhabditis elegans

טיהור וניתוח מסחטות של האלקאים ושלפוחיות

כימות צבירת חלבונים בלתי מסיסים ב-Caenorhabditis elegans במהלך ההזדקנות עם זרימת עבודה חדשה של רכישה בלתי תלויה בנתונים

כימות צבירת חלבונים בלתי מסיסים ב-Caenorhabditis elegans במהלך ההזדקנות עם זרימת עבודה חדשה של רכישה בלתי תלויה בנתונים

מיצוי בקנה מידה קטן של Caenorhabditis elegans דנ"א גנומי