אנו מודים אלה Weinert, מישל הלמס, Marlis Badusche לסיוע טכני מעולה, ג'סיקה Börstler עבור ניתוחים של יתושים כולכית , נורברט בקר, ביורן Pluskota לאספקת ביצים אדס , אולי Vapalahti עבור מתן המניה וירוס. ML נתמכה על ידי האגודה לייבניץ; הענק מספר המסור-2014-SGN-3.

1. מכינים יתושים הנשי
<ol><li>לאסוף יתושים כלוב גדול על-ידי שימוש של העצמות (כ- 400 יתושים לכל כלוב גדול).</li>
	<li>עזים ומתנגד היתושים עם פחמן דו-חמצני (CO2) עבור 7 s.</li>
	<li>למיין נקבות 20 לכל בקבוקון פלסטיק (Ø 50 מ"מ × 100 מ"מ). הערה: אם היתושים מתעורר, השתמש עוד 3 s של CO2-
</li>
	<li>להרעיב את היתושים בן לילה.</li>
</ol>2. ארוחת דם מלאכותי
הערה: כל הפעולות מבוצעות בתנאים BSL-3.
<ol><li>
להכין את הארוחה דם זיהומיות.
	<ol>
<li>לדלל את המניה וירוס לריכוז פלאק עונה 1 פרק 108 יחידות (PFU) ויוצרים / mL. הערה: ריכוז מניות היה נקבע על-ידי ביצוע פעולת שירות במינון 50 זיהום תרביות רקמה (TCID50), המחושב על-ידי ספירמן & Kärber אלגוריתם10,11.</li>
		<li>מיקס שפג תוקפו (שימור דם) דם אנושי מבנק הדם (אינו מתאים אנושיים יותר, אבל שימושי עבור יתושים) עם פרוקטוז (8% פתרון), בפילטר סרום שור (FBS) ואת הפתרון עובד של המניה וירוס (פג האנושי דם: פרוקטוז: FBS: הפתרון עובד = 5:3:1:1). הערה: בחרנו דם אדם, כי זה המארח יונק טבעי הידוע של ZIKV.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להקפיא µL 140 של שילוב ארוחת דם לצורך ניתוח נוסף באמצעות TCID50.</li>
	<li>
לבצע הזנה מלאכותית באמצעות שיטות האכלה שונים, בהתאם למין:
	<ol>
<li>
Aedes aegypti: להשתמש קרום האכלה המערכת במשך 30 דקות (1 מ"ל לכל מזין).</li>
		<li>
כולכית spp.: לספק את הדם זיהומיות באמצעות מקל צמר גפן בין לילה, לא לחמם את הדם (300 µL לכל מבחנה).</li>
		<li>
אדס מפוספס: שתי טיפות (50 µL כל) של המיקס ארוחת דם לתוך הבקבוקון פלסטיק וניתן היתושים להאכיל במשך שעתיים. לא לחמם את הדם. הערה: יתושים אאכיל הראשון באינטרקום. זמן הדגירה ממושך נחוץ מסיבות בטיחות. טיפות דם מנוקזות לאחר 2 h, שובכך את הסיכון לזיהום מצטמצם במהלך המיון של האכלת יתושים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>עזים ומתנגד היתושים עם CO2 עבור 7 s. הערה: אם היתושים מתעורר, השתמש עוד 3 s של CO2.</li>
	<li>מיון וספירה צבה מלא יתושים לתוך בקבוקון חדש.</li>
	<li>להוסיף כרית כותנה, רווי פרוקטוז (8% פתרון) בין המבחנה פקק.</li>
	<li>לשמור היתושים בטמפרטורה המיועד של 18 ° C או 27 ° C בלחות של 80% 14-21 ימים.</li>
	<li>להאכיל את הזבובים עם ריפוד כותנה רווי פרוקטוז. לחדש כל 72 h עם 1.5 מ של פרוקטוז (8% פתרון) לכל מבחנה (עד 20 היתושים, בהתאם ההזנה לדרג, ראה שלב 2.5).</li>
</ol>3. הכריחו ריור Assay ביום 14 או 21
הערה: כל הפעולות מבוצעות בתנאים BSL-3.
<ol><li>2 x 104 Vero תאי זרע / לכל טוב ב- 96 ובכן צלחת עם 200 µL של מדיום הגידול (Dulbecco´s שונה נשר בינוני (DMEM) בתוספת 3% FBS, פניצילין U/mL 100, 100 מ"ג/מ"ל סטרפטומיצין, 5 µg/mL המפוטריצין, 2 מ מגלוטמין חומצות אמינו שאינן הכרחיות 1% (NEAA), 1% נתרן פירובט).</li>
	<li>
הכן את התקן ריור:
	<ol>
<li>מניחים צלחת זכוכית בריבוע (20 × 20 ס מ) על הספסל ב זווית של 30 מעלות. הערה: זה נחוץ בשל תראי במעבדה בטיחות. אם הצלחת אופקי או אנכי, נוזל ידלוף.</li>
		<li>במקום פעמיים דבק צדדית על גבי לוח הזכוכית.</li>
		<li>תפקיד החימר דוגמנות עד שהוא מגיע בקוטר של 0.5 ס מ ולחבר אותו אופקית 1 ס מ מן הקלטת דבק דו צדדי.</li>
		<li>חתוך את 0.3 ס מ הראשון של הקצה של קצה מסנן 10 µL. הערה: מומלץ להכין את זה לפני תחילת הניסוי מחוץ למעבדה אבטחה.</li>
		<li>למלא את הטיפים מסנן 10 µL של פוספט buffered תמיסת מלח (PBS, pH 7.4).</li>
		<li>מניחים את הטיפים מסנן על החימר דוגמנות עם הקצה לקראת הקלטת דביק.</li>
		<li>אבטח את הטיפים מסנן עם לחץ עדין.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הכן את היתושים:
	<ol>
<li>עזים ומתנגד היתושים עם CO2.</li>
		<li>הסר את הרגליים ואת כנפיים כדי לשתק את היתושים.</li>
		<li>לתקן את היתוש חי גופות בקלטת דביק מעל טיפ מסנן.</li>
		<li>הנח את חוטם בעדינות לתוך קצה מסנן.</li>
		<li>הפעל וזמינותו ריור למשך 30 דקות.</li>
		<li>הסר את הטיפים מסנן ולמחוק את קליי ואת הסרט.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. עיבוד של רוק
הערה: השלבים 4.1 – 4.6.2 מבוצעות בתנאים BSL-3.
<ol><li>לגרש את התוכן לתוך הצינורות התגובה המכיל 10 µL ל- PBS.</li>
	<li>לערבב בעדינות, להעביר את התוכן לתוך הבארות של הלוח מוכן היטב 96 באמצעות באר אחת עבור דגימה.</li>
	<li>תקופת דגירה לצלחת של 7 ימים ב 37 ° C עם 5% CO2.</li>
	<li>השתמש התאום כדי לבדוק את התאים לנוכחות של אפקט ציטופתי (CPE).</li>
	<li>אם גם הוא חיובי עבור CPE, לקצור את תגובת שיקוע על-ידי pipetting 140 µL לתוך צינור התגובה לחילוץ RNA.</li>
	<li>
לטהר את הרנ א באמצעות ערכת חילוץ RNA.
	<ol>
<li>µL 140 מיקס של תגובת שיקוע עם µL 560 של AVL מאגר (פירוק ויראלי מאגר), תקופת דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>הוסף µL 560 של אתנול (96%) ו מערבולת המדגם. הערה: הדוגמאות הן לא פעיל לאחר שלב זה, יכול להיות משוחרר מחוץ למעבדה BSL-3.</li>
		<li>Pipet 630 µL של המדגם על עמודה בעלת צנטריפוגה עם 6,000 x g עבור 1 דקות.</li>
		<li>למחוק את פילטרט של, pipet µL 630 הנותרים על העמודה וחזור על צנטריפוגה.</li>
		<li>לשטוף את הרנ א, חייב הקרום של העמודה, על-ידי הוספת µL 500 לרחוץ את מאגר 1 עמודה, צנטריפוגה ב 6,000 x g עבור 1 דקות.</li>
		<li>למחוק את הצינור אוסף ולמקם את העמודה לתוך צינור אוסף חדש. להוסיף 500 µL כביסה מאגר 2 ו צנטריפוגה ב x 12,500 g למשך 3 דקות.</li>
		<li>למחוק את הצינור אוסף ולמקם את העמודה לתוך צינור התגובה 1.5 mL.</li>
		<li>הוסף µL 50 • תנאי מאגר ' תקופת דגירה של 1 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>צנטריפוגה ב x 6,000 g עבור 1 דקות ולאחר מכן למחוק את העמודה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לנתח את הדגימות עבור ZIKV RNA באמצעות RT-qPCR.</li>
</ol>5. עיבוד של גופים יתוש
הערה: השלבים 5.1 – 5.5 מבוצעות בתנאים BSL-3.
<ol><li>הסר את הגופות של היתוש ומניחים כל גוף לתוך צינור התגובה. הערה: זה אפשרי להשהות את הניסוי בשלב זה ולאחסן את הדגימות ב-80 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>להוסיף 500 µL של התקשורת המגון (DMEM ללא כל supplementals) לתוך הצינור התגובה.</li>
	<li>Homogenize על הגוף באמצעות מנוע במיקסר ולהשתמש פיסטיל חדש עבור כל דגימה.</li>
	<li>להוסיף 200 µL של homogenate 96-ובכן-צלחת לטיהור. הערה: זה אפשרי להשהות את הניסוי בשלב זה ולאחסן את הדגימות ב-80 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>בטל את הצלחת על ידי הדגירה למשך 60 דקות ב 60 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>לטהר את הרנ א על ידי טיהור חומצת גרעין אוטומטית. הערה: זה אפשרי להשהות את הניסוי בשלב זה ולאחסן את הדגימות ב-80 מעלות צלזיוס.</li>
</ol>6. ניתוח
<ol><li>לכמת את העותקים RNA נגיפי באמצעות RT-qPCR. הערה: העותקים RNA היו בממוצע על כל הגופים יתוש ZIKV-חיוביים וללא כולל את היתושים ZIKV-שלילי.</li>
	<li>חישוב IR, כהגדרתו מספר הגופות יתוש ZIKV-חיובית לכל מספר נקבות נמאס.</li>
	<li>לחשב את TR, הגדיר את המספר של יתושים עם הרוק ZIKV-חיובית לכל מספר חיובי ZIKV יתושים הגופות. לא ניתן לחשב קצב השידור עבור שילובי מינים-הטמפרטורה ללא גוף ZIKV-חיוביות.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Musso, D., Gubler, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+Virus.">Zika Virus.</a> Clinical Microbiology Reviews. (3), 487-524 (2016).</li><li>Epelboin, Y., Talaga, S., Epelboin, L., Dusfour, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus:+An+updated+review+of+competent+or+naturally+infected+mosquitoes.">Zika virus: An updated review of competent or naturally infected mosquitoes.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 11 (11), e0005933 (2017).</li><li>Aliota, M. T., Peinado, S. A., Osorio, J. E., Bartholomay, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culex+pipiens+and+Aedes+triseriatus+Mosquito+Susceptibility+to+Zika+Virus.">Culex pipiens and Aedes triseriatus Mosquito Susceptibility to Zika Virus.</a> Emerging Infectious Diseases. (10), 1857-1859 (2016).</li><li>Turell, M. J., Linthicum, K. J., Patrican, L. A., Davies, F. G., Kairo, A., Bailey, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+competence+of+selected+African+mosquito+(Diptera:+Culicidae)+species+for+Rift+Valley+fever+virus.">Vector competence of selected African mosquito (Diptera: Culicidae) species for Rift Valley fever virus.</a> Journal of Medical Entomology. 45 (1), 102-108 (2008).</li><li>Cornel, A. J., Jupp, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+three+methods+for+determining+transmission+rates+in+vector+competence+studies+with+Culex+univittatus+and+West+Nile+and+Sindbis+viruses.">Comparison of three methods for determining transmission rates in vector competence studies with Culex univittatus and West Nile and Sindbis viruses.</a> Journal of the American Mosquito Control Association. 5 (1), 70-72 (1989).</li><li>Hurlbut, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito+salivation+and+virus+transmission.">Mosquito salivation and virus transmission.</a> The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 15 (6), 989-993 (1966).</li><li>Anderson, S. L., Richards, S. L., Smartt, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+determining+arbovirus+transmission+in+mosquitoes.">A simple method for determining arbovirus transmission in mosquitoes.</a> Journal of the American Mosquito Control Association. 26 (1), 108-111 (2010).</li><li>Heitmann, A., Jansen, S., L&#252;hken, R., Leggewie, M., Badusche, M., Pluskota, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+transmission+of+Zika+virus+by+mosquitoes+from+central+Europe.">Experimental transmission of Zika virus by mosquitoes from central Europe.</a> Eurovsurveillance. 22 (2), (2017).</li><li>Hierholzer, J. C., Killington, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Virus Isolation and Quantitation - Virology methods manual. , (1996).</li><li>Horzinek, R. W., Marian, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kompendium+der+allgemeinen+Virologie.">Kompendium der allgemeinen Virologie.</a> Zentralblatt f&#252;r Veterin&#228;rmedizin R A. 32 (1-10), 480 (2010).</li><li>Richard, V., Paoaafaite, T., Cao-Lormeau, V. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+Competence+of+French+Polynesian+Aedes+aegypti+and+Aedes+polynesiensis+for+Zika+Virus.">Vector Competence of French Polynesian Aedes aegypti and Aedes polynesiensis for Zika Virus.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (9), (2016).</li><li>Fortuna, C., Remoli, M. E., Di Luca, M., Severini, F., Toma, L., Benedetti, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+studies+on+comparison+of+the+vector+competence+of+four+Italian+Culex+pipiens+populations+for+West+Nile+virus.">Experimental studies on comparison of the vector competence of four Italian Culex pipiens populations for West Nile virus.</a> Parasites &amp; Vectors. 8, 463 (2015).</li><li>Weger-Lucarelli, J., R&#252;ckert, C., Chotiwan, N., Nguyen, C., Garcia Luna, S. M., Turell, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+Competence+of+American+Mosquitoes+for+Three+Strains+of+Zika+Virus.">Vector Competence of American Mosquitoes for Three Strains of Zika Virus.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (10), (2016).</li><li>Dubrulle, M., Mousson, L., Moutailler, S., Vazeille, M., Failloux, A. -. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chikungunya+virus+and+Aedes+mosquitoes:+saliva+is+infectious+as+soon+as+two+days+after+oral+infection.">Chikungunya virus and Aedes mosquitoes: saliva is infectious as soon as two days after oral infection.</a> PLOS ONE. 4 (6), e5895 (2009).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

בעבר הוכח כי התוצאות המתקבלות עם ריור בכפייה עולים בקנה אחד עם קלאסית ניסויים מחדש האכלה6. עם זאת, מחדש האכלה ניסויים והן בשיטה שלנו הציג ריור בכפייה, זה בלתי אפשרי ישירות הוכחה פעילות ריור או לפקח על שחרורו של הרוק. כדי להוכיח פעילות ריור, דגימות נבדק עבור רכיבים אחרים להציג הרוק (למשל., חלבונים, פחמימות, וכו '.). יתר על כן, qPCRs נוספים תאפשר איתור נגיפי RNA עותקים. זאת, לעומת זאת, דורשת פיצול של דגימות רוק עבור ניתוחים שונים, אשר עשוי להגביל רגישות בשן וזמינותו תרבות תא במקרה של מספרי החלקיקים נמוך מאוד. בתורו, זה עלול להוביל underestimation של קצב שידור נחוש.
לתוצאות לשחזור, זה הכרחי להבטיח כי כל היתושים להישאר בחיים עד סוף הניסוי. זה נשלטת על ידי חזותית ניטור פעילות תנועת הגוף של היתושים. בנוסף, השימוש בעיקרון וזמינותו ריור עבור זן יתושים נתון יש להיבדק על ידי האכלה לשלוט וירוסים, אשר ידועים להיות מועבר על ידי מינים יתושים הספציפי הזה. ולהיפך, כל וירוס מוחדרים ניסוי צריך להיבחן. יתוש רגישים.
מבחני ריור בכפייה יש יתרונות רבים. מספר גבוה של יתושים יכול להיבדק בו זמנית על להצטננות הבסיס בתנאים מתוקננים מבוקרים מבלי לגרום להתנגשויות עם תקנות רווחת בעלי חיים9.
השיטה משמשת מספר מעבדות. עם זאת, כיוונוני המדויק עשויים להיות שונים, אשר יכול להוביל הבדלים בתוצאות בין מעבדות. מרכיב קריטי אחד הוא נימי כדי לאסוף את הרוק, אשר יכול להיות עשוי זכוכית14 או פלסטיק15. עמידה בהוראות הבטיחות גבוהה של insectary רמה 3 אבטחה, השתמשנו טיפים מסנן מפלסטיק במקום נימי זכוכית, ובכך להקטין את הסיכון לפציעות. יתר על כן, מסנן טיפים יש יתרון כי הנוזל נאסף ניתן בקלות להעביר באמצעות פיפטה.
ההתקנה של וזמינותו ריור בכפייה המובאת כאן מבוסס על שני החוקרים עובדים ביחד ושיתוף חובות. Demobilizing של היתוש מבוצעת על ידי אדם אחד, בעוד השני בו זמנית מכין את הכיוונון ריור בכפייה. זו מפחיתה את זמן הטיפול, ממזער את הסיכון באופן משמעותי מדגם מיתוג כמו שינוי בין שהשתחררתי-העבודה ריור-הצלחת אינה נחוצה. יתר על כן, היא מאפשרת הצבת היתושים על המכשיר ריור בכפייה מיד אחרי שהשתחררתי. יתוש הקצרים זה טיפול זמן חיוני מוצלחת ריור בכפייה. לבסוף, היתושים ניתן לנטר באופן ישיר על תנועתיות לאורך כל הניסוי כולו.
וזמינותו ריור המובאת כאן משמש כדי לקבל תובנות לגבי הפוטנציאל וקטור של מינים יתושים. עם זאת, כדי לענות על שאלות ספציפיות אחרות (למשל., המספרים של עקיצות יתושים הדרושות כדי להדביק בעלי חוליות), חיה ניסויים עדיין ייתכן שיהיה צורך.

בשנת 2015, Zika וירוס (ZIKV), הקשורים בעקיצות יתוש וירוס (mobovirus) השייך למשפחת Flaviviridae, יצא ב קולומביה וברזיל והתפשטה במהירות ברחבי אמריקה והאיים הקריביים, לגרום מגיפה עם מספרים הבולטים מקרים קליניים של microcephaly, תסמונת גיליאן-ברה1. היתושים של המין Aedes aegypti ו אדס נחשבים הווקטורים הראשיים והמשניים של ZIKV2, אבל גם הוכיחו מינים אחרים של הסוג אאדס יש וקטור ניסיוני מיומנות3 . בניגוד מינים אאדס , לרוב המינים כולכית נבדקו עד כה אינם מסוגלים להעביר את הוירוס4. בסך הכל, הנתונים עבור כולכית quinquefasciatus סיפק תוצאות חד משמעיות3. בזמן הנוכחי, מידע חסר על כשירות וקטור יתוש ZIKV בתנאים הטמפרטורה מתונה (< 20 ° C). עם זאת, מידע זה הוא משמעותי עבור הערכות סיכונים אפשריים כפולות באזורים בעלי אקלים ממוזג כגון מרכז אירופה.
וקטור המוסמכים עבור ZIKV הוא מסוגל לרכוש, לתחזק, להגביר, לבסוף לשדר את הוירוס. לכן, בדיקה של יתוש גופות או חלקי הגופות, כולל הרגליים, פיתול, ראש או בלוטות הרוק, ZIKV אינה מספיקה לקבוע וקטור מיומנות. זה הכרחי לבדיקת חלקיקי וירוס זיהומיות בתוך הרוק שפורסמו כדי להעריך את היכולות וקטור, שיעור הזיהום (אינפרא-אדום, מספר הגופות יתוש ZIKV-חיובית לכל מספר של יתושים הנפוחים) וגם קצב השידור (TR, מספר יתושים עם הרוק ZIKV-חיובית לכל מספר הגופות יתוש ZIKV-חיוביים), חייב להיות נחושה. מס הכנסה של יתושים ניתן לנתח בקלות על ידי יתושים פשוט homogenizing ואחריו תגובת שרשרת של פולימראז בזמן אמת-טרנסקריפטאז (RT-qPCR) מיקוד ZIKV. יתר על כן, הזיהום ניתן לאפיין עוד יותר על-ידי קביעת המספרים ויראלי עותק לכל יתושים. לעומת זאת, הניתוח של קצב שידור מסתמך על הגילוי של חלקיקי וירוס קיימא על ידי יתושים בודדים. זו יכולה להיות מושגת על ידי האכלה של יתושים נגועים על חיות מארח רגישים, ואחריו הניתוח של viremia מארח5. עם זאת, שיטה זו מתבססת על מודל מתאים אורגניזמים, מוגבלים על ידי תקנות רווחת בעלי החיים ולא יקר. כדי למנוע השימוש של חיות מעבדה לניתוח קצב שידור כדי להפחית עלויות, מלאכותי מחדש האכלה מערכות דם טיפות היו תיאר6. אולם, בדיקה בסולם בודדים בשילוב עם מספר גבוה של אנשים היא וממושכת. התיאור הראשון של וזמינותו ריור בסולם בודדים פורסם בשנת 19667 , במהלך השנים האחרונות, ריור בכפייה ניסויים הפכו שיטת הבחירה כדי להעריך בדונו וקטור של יתושים3,8 .
בהתבסס על המחקר את היכולות שלנו וקטור של מרכז אירופיות יתושים שפורסם לאחרונה9, נתאר ריור בכפייה כפי שדווח על ידי אנדרסון ואח. 8 עם מספר שינויים. שיטה זו מאפשרת תפוקה גבוהה סטנדרטית ניסויים בתנאים רמת אבטחה גבוהה (BSL-3), כולל זיהוי וירוס פעיל על ידי מבחני תרבות המבוססת התא. הניסויים המתוארים כאן כוללים יתושים 856. הם היו נגועים ZIKV על ידי ארוחת דם מלאכותי, לאחר מכן נותחו לנוכחות של חלקיקי וירוס מדבק ברוק. היתושים מוחדרים ניסויים כללה שתי האוכלוסיות מעבדה ותיקה של Ae. aegypti , כולכית מצויה מצויה biotype molestus (Cx. פ molestus), כמו גם שדה נתפס כולכית מצויה מצויה biotype מצויה (עמ' מצויה Cx.), כולכית torrentium (Cx-torrentium), שתי האוכלוסיות Ae. albopictus . למעט אחד של Ae. albopictus שתי האוכלוסיות, אשר נאסף באיטליה, כל היתושים היו שנאספו בגרמניה.

<table><tbody><tr><td>Inject+matic Sleeper</td><td>Inject+matic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bugdorm-1 Insect Rearing Cage</td><td>BugDorm Store</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Drosophila cultivation tubes</td><td>carl roth</td><td>PK11.2</td><td>plastic vial for mosquitoes</td></tr><tr><td>Plug for drosophila cultivation tubes</td><td>carl roth</td><td>PK15.1</td><td></td></tr><tr><td>Constant climate chamber</td><td>Binder</td><td>KBF-240</td><td></td></tr><tr><td>Blood</td><td></td><td></td><td>banked human blood, expired, not usable for medical application</td></tr><tr><td>Dumont-Pincette Electronic SS</td><td>Dumont</td><td>B40c</td><td></td></tr><tr><td>Vero cells</td><td>BNITM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flash light aspirator</td><td>Bioquip</td><td>2809</td><td></td></tr><tr><td>double-sided adhesive tape</td><td></td><td></td><td>no specific provider</td></tr><tr><td>Gammex Powder-free gloves with AMT</td><td>Ansell</td><td></td><td>for safety reasons necessary during work with pricks in the BSL3 laboratory</td></tr><tr><td>RealStar Zika Virus RT-PCR-Kit</td><td>altona diagnostics</td><td>591013</td><td></td></tr><tr><td>MagMax Pathogen RNA/DNA Kit</td><td>Thermo fisher scientific</td><td>4462359</td><td>RNA isolation of mosquito bodies</td></tr><tr><td>Qiamp viral RNA Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>52906</td><td>RNA-Isolation of supernatant</td></tr><tr><td>filter tips (20 &amp;micro;L)</td><td>Sarstedt</td><td>701,116,210</td><td>Cut the first 3 mm of the tip</td></tr><tr><td>hand motor mixer</td><td>carl roth</td><td>sold out</td><td></td></tr><tr><td>micro pestles for hand motor mixer</td><td>carl roth</td><td>CXH8.1</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td></td><td>P0403550</td><td></td></tr><tr><td>L Glutamine Penicilin/Streptomycin</td><td>PAN</td><td>P0819100</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>PAN</td><td>P06-0110</td><td></td></tr><tr><td>Fructose</td><td>carl roth</td><td>4981.5</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline</td><td>PAN</td><td>P04-36500</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>PAN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium Pyruvat</td><td>PAN</td><td>P0443100</td><td></td></tr><tr><td>MEM NAA</td><td>PAN</td><td>P0832100</td><td></td></tr><tr><td>Hemotek Feeder</td><td>Hemotek</td><td>PS6</td><td></td></tr><tr><td>Light Cycler</td><td>Roche</td><td>480 II</td><td></td></tr><tr><td>Light Cycler Software</td><td>Roche</td><td>480 SW 1.5.1</td><td></td></tr><tr><td>Modeling clay</td><td></td><td></td><td>no specific provider</td></tr><tr><td>King Fisher Flex Purification System</td><td>ThermoFisher scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Aedes albopictus&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>eggs were collected in Freiburg, Germany</td></tr><tr><td>Binocular</td><td>MOTIC</td><td>SMZ-168</td><td></td></tr><tr><td>Binocular light</td><td>MOTIC</td><td>MLC-150C</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-Incubator</td><td>Thermo scientific</td><td>MIDI 40</td><td></td></tr></tbody></table>

forced salivation as a method to analyze vector competence of mosquitoes

וקטור כשירות מוגדר את הפוטנציאל של זן יתושים לשדר בעקיצות יתוש וירוס (mobovirus) למחשב מארח חוליות. חלקיקי וירוס קיימא מועברים במהלך ארוחה דם דרך הרוק של יתוש נגוע מספיקה. ריור בכפייה מבחני לאפשר קביעת פוטנציאל וקטורי על בסיס יחיד היתושים, הימנעות השימוש של ניסויים בבעלי חיים. השיטה מתאימה לנתח מספר גדול של יתושים בניסוי אחד בתוך תקופה קצרה של זמן. ריור בכפייה מבחני שימשו כדי לנתח 856 יתושים בודדים לכוד בתוך גרמניה, כולל שני שונים כולכית מצויה מצויה biotypes, כולכית torrentium , כמו גם אדס, אשר נדבקו ניסיוניים בווירוס Zika (ZIKV), מודגרות 18 ° C או 27 ° C שניים או שלושה שבועות. התוצאות הצביעו על חוסר כשירות וקטור של taxa שונים כולכית עבור ZIKV. לעומת זאת, אדס היה רגישים ZIKV, אבל רק ב 27 ° C, עם קצב שידור דומה המושבה מעבדה Aedes aegypti נבדקו במקביל.

Aedes aegypti ידועה כמו וקטור המוסמכת ZIKV לפחות תחת תנאי אקלים טרופי12. לכן, אנחנו משתמשים Ae. aegypti כפקד חיובי להקים וזמינותו לנתח מס הכנסה, כמו גם TRs-בטמפרטורת דגירה של 27 ° C ולחות של 80%. IR ו TR הוגדרו תיאר כאמור מאת פורטונה ואח. 13. תיגר Ae. aegypti הראה IR של 50% ו 72% ו TR של 42% ו- 31%-14 ל-21 יום פוסט זיהום (dpi), בהתאמה (איור 1A ו 1B). לאחר מכן, יתושים האירופית נבדקו עבור זיהום ZIKV ושידור באמצעות תנאי אקלים טרופי, כמו גם ממוזג.
בטמפרטורת דגירה 27 ° C, מינים יתושים כל הראו זיהום ZIKV 14 dpi, כמו גם dpi 21, למעט יחידים Cx. עמ' מצויה ו- Cx-torrentium , אשר היו חיוביות ב- 14 dpi בלבד. כל המינים אאדס הראה מס הכנסה גבוה יותר (בין 50% ל- 72%) כמו גם ריכוז גבוה יותר של RNA נגיפי (106 עד 10 דגימות עותקים/יתוש9 RNA) בהשוואה taxa שונים כולכית , שחשף מס הכנסה הנעים בין 0 % ו-32% והמון ויראלי של 103 -104 RNA עותקים/יתוש דגימות. כל המינים אאדס מוצג ZIKV-חיוביות רוק (TR 13 – 42%), בעוד אף אחד דגימות רוק מן taxa כולכית הכילה ZIKV (איור 1A ו 1B). מעניין, קצב שידור ב- 21 dpi היו דומים ב Ae. aegypti ו Ae. albopictus מגרמניה (30%), אך היו נמוכות משמעותית ב- Ae. albopictus מאיטליה (13%).
דגירה של יתושים מאותגר בטמפרטורה מתונה של 18 ° C נחשף בדרך כלל וירוס התחתון טוען המין Aedes (104–106 RNA עותקים/יתושים) וכן את taxa כולכית שונים (102 –104 RNA עותקים/יתושים). עם זאת, בטמפרטורת דגירה 18 ° C, שידור של ZIKV נצפתה לא עבור כל המינים יתושים חקר.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57980/57980fig1.jpg"> איור 1: קצב שידור של יתושים נגועים השפעול ZIKV. תוצאות של מחקרים כשירות וקטור עם ZIKV במינים שונים נגד יתושים. 6 taxa יתושים שונים היו נגועים ZIKV, מודגרות עד 27 ° C או 18 ° C 14 (א) או 21 ימים (B). TR מוגדר כמספר של יתושים עם הרוק ZIKV-חיובית לכל מספר חיובי ZIKV יתושים הגופות. המספר הכולל של יתושים חקר היה 856, עם מינימום של 30 אנשים בגין taxa נקודה/טמפרטורה/יתושים כל הזמן. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57980/57980fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Forced Salivation As a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes at JoVE.com

Forced Salivation As a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes

הכריחו ריור כשיטה לנתח מיומנות וקטור של יתושים

עבור שליטה יעילה של יתוש נישאים וירוס שידור, הידע של פוטנציאל וקטורי של יתושים בהתאמה הוא עניין מיוחד. אנו מתארים ריור בכפייה כשיטה לנתח מיומנות וקטור של אדס , שלושה taxa כולכית שונים להעברת Zika וירוס.

Vector competence is defined as the potential of a mosquito species to transmit a mosquito-borne virus (mobovirus) to a vertebrate host. Viable virus ...

forced-salivation-as-method-to-analyze-vector-competence

Research

JoVE Journal

Biology

9.5K Views.  Bernhard Nocht Institute for Tropical Medicine. עבור שליטה יעילה של יתוש נישאים וירוס שידור, הידע של פוטנציאל וקטורי של יתושים בהתאמה הוא עניין מיוחד. אנו מתארים ריור בכפייה כשיטה לנתח מיומנות וקטור של אדס , שלושה taxa כולכית שונים להעברת Zika וירוס.

Video: Forced Salivation As a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes

Alphavirus Transducing System:  Tools for Visualizing Infection in Mosquito Vectors

Alphavirus transducing systems (ATSs) are important tools for expressing genes of interest (GOI) during infection. ATSs are derived from cDNA clones of mosquito-borne RNA viruses (genus Alphavirus; family Togaviridae). The Alphavirus genus contains about 30 different mosquito-borne virus species. Alphaviruses are enveloped viruses and contain single-stranded RNA genomes (~11.7 Kb). Alphaviruses transcribe a subgenomic mRNA that encodes the structural proteins of the virus required for encapsidation of the genome and maturation of the virus. Alphaviruses are usually highly lytic in vertebrate cells, but persistently infect susceptible mosquito cells with minimal cytopathology. These attributes make them excellent tools for gene expression in mosquito vectors. The most common ATSs in use are derived from Sindbis virus (SINV). The broad species tropism of SINV allows for infection of insect, avian, and mammalian cells8. However, ATSs have been derived from other alphaviruses as well9,10,20. Foreign gene expression is made possible by the insertion of an additional viral subgenomic RNA initiation site or promoter. ATSs in which an exogenous gene sequence is positioned 5' to the viral structural genes is used for stable protein expression in insects. ATSs, in which a gene sequence is positioned 3' to the structural genes, is used to trigger RNAi and silence expression of that gene in the insect.
ATSs have proven to be valuable tools for understanding vector-pathogen interactions, molecular details of viral replication and maintenance infectious cycles3,4,11,19,21. In particular, the expression of fluorescent and bioluminescent reporters has been instrumental tracking the viral infection in the vector and virus transmission5,14-16,18. Additionally, the vector immune response has been described using two strains of SINV engineered to express GFP2,9.
Here, we present a method for the production of SINV containing a fluorescent reporter (GFP) from the cDNA infectious clone. Infectious, full-length RNA is transcribed from the linearized cDNA clone. Infectious RNA is introduced into permissive target cells by electroporation. Transfected cells generate infectious virus particles expressing the GOI. Harvested virus is used to infect mosquitoes, as described here, or other host species (not shown herein). Vector competence is assessed by detecting fluorescence outside the midgut or by monitoring virus transmission7. Use of a fluorescent reporter as the GOI allows for convenient estimation of virus spread throughout a cell culture, for determination of rate of infection, dissemination in exposed mosquitoes, virus transmission from the mosquito and provides a rapid gauge of vector competence.

Methods for using alphavirus transducing systems to express fluorescent reporters in vitro and in adult mosquitoes are described. This technique may be adapted to express any protein of interest in lieu of or in addition to a reporter.

מערכת Alphavirus Transducing: כלי המאפשר הדמיה זיהום ווקטורים יתוש

Alphavirus transducing systems (ATSs) are important tools for expressing genes of interest (GOI) during infection.  ATSs are derived from cDNA clones of ...

Immunology and Infection

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes. Investigation of transcripts and gene regulators that are expressed in tissues in which the mosquito host and pathogen interact, and in organs involved in reproduction are of great interest for strategies to reduce mosquito-borne disease transmission and disrupt egg development. A number of tools have been employed to study and validate the temporal and tissue-specific regulation of gene expression. Here, we describe protocols that have been developed to obtain spatial information, which enhances our understanding of where specific genes are expressed and their products accumulate. The protocol described has been used to validate expression and determine accumulation patterns of transcripts in tissues related to mosquito-borne pathogen transmission, such as female salivary glands, as well as subcellular compartments of ovaries and embryos, which relate to mosquito reproduction and development. 
 The following procedures represent an optimized methodology that improves the efficiency of various steps in the protocol without loss of target-specific hybridization signals. Guidelines for RNA probe preparation, dissection of soft tissues and the general procedure for fixation and hybridization are described in Part A, while steps specific for the collection, fixation, pre-hybridization and hybridization of mosquito embryos are detailed in Part B.

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Temporal and spatial gene expression analyses have a crucial role in functional genomics. Whole-mount hybridization in situ is useful for determining the localization of transcripts within tissues and subcellular compartments. Here we outline a hybridization in situ protocol with modifications for specific target tissues in mosquitoes.

הכלאה<em&gt; באתרו</em&gt; של בלוטות הרוק, השחלות, ועוברים של וקטור יתושים

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes.  Investigation of transcripts and gene ...

Use of a Recombinant Mosquito Densovirus As a Gene Delivery Vector for the Functional Analysis of Genes in Mosquito Larvae

In vivo microinjection is the most commonly used gene transfer technique for analyzing the gene functions in individual mosquitoes. However, this method requires a more technically demanding operation and involves complicated procedures, especially when used in larvae due to their small size, relatively thin and fragile cuticle, and high mortality, which limit its application. In contrast, viral vectors for gene delivery have been developed to surmount extracellular and intracellular barriers. These systems have the advantages of easy manipulation, high gene transduction efficiency, long-term maintenance of gene expression, and the ability to produce persistent effects in vivo. Mosquito densoviruses (MDVs) are mosquito-specific, small single-stranded DNA viruses that can effectively deliver foreign nucleic acids into mosquito cells; however, the replacement or insertion of foreign genes to create recombinant viruses typically causes a loss of packaging and/or replication abilities, which is a barrier to the development of these viruses as delivery vectors.
Herein, we report using an artificial intronic small-RNA expression strategy to develop a non-defective recombinant Aedes aegypti densovirus (AaeDV) in vivo delivery system. Detailed procedures for the construction, packaging and quantitative analysis of the rAaeDV vectors, and for larval infection are described.
This study demonstrates, for the first time, the feasibility of developing a non-defective recombinant MDV micro RNA (miRNA) expression system, and thus providing a powerful tool for the functional analysis of genes in mosquito and establishing a basis for the application of viral paratransgenesis for controlling mosquito-borne diseases. We demonstrated that Aedes albopictus 1st instar larvae could be easily and effectively infected by introducing the virus into the water body of the larvae breeding site and that the developed rAaeDVs could be used to overexpress or knock down the expression of a specific target gene in larvae, providing a tool for the functional analysis of mosquito genes.

We report using an artificial intronic small RNA expression strategy to develop a non-defective recombinant Aedes aegypti densovirus (AaeDV) in vivo delivery system. A detailed procedure for the construction, packaging, and quantitative analysis of the rAaeDV vectors as well as for larval infection is described.

שימוש Densovirus יתוש רקומביננטי כמו וקטור משלוח ג'ין לניתוח פונקציונלי של גנים רימות היתוש

In vivo microinjection is the most commonly used gene transfer technique for analyzing the gene functions in individual mosquitoes. However, this method ...

Developmental Biology

Phenotypic Analysis of Rodent Malaria Parasite Asexual and Sexual Blood Stages and Mosquito Stages

Recent advances in genetics and systems biology technologies have promoted our understanding of the biology of malaria parasites on the molecular level. However, effective malaria parasite targets for vaccine and chemotherapy development are still limited. This is largely due to the unavailability of relevant and practical in vivo infection models for human Plasmodium species, most notably for P.&#160;falciparum and P. vivax. Therefore, rodent malaria species have been extensively used as practical alternative in vivo models for malaria vaccine, drug targeting, immune response, and functional characterization studies of conserved Plasmodiumspp. genes. Indeed, rodent malaria models have proven to be invaluable, especially for exploring mosquito transmission and liver stage biology, and were indispensable for immunological studies. However, there are discrepancies in the methods used to evaluate the phenotypes of transgenic and wild-type asexual and sexual blood-stage parasites.&#160;Examples of these discrepancies are the choice of an intravenous vs. intraperitoneal infection of rodents with blood-stage parasites and the evaluation of male gamete exflagellation. Herein, we detail standardized experimental methods to evaluate the phenotypes of asexual and sexual blood stages in transgenic parasites expressing reporter-gene or wild-type rodent malaria parasite species. We also detail the methods to evaluate the phenotypes of malaria parasite mosquito stages (gametes, ookinetes, oocysts, and sporozoites) inside Anopheles mosquito vectors. These methods are detailed and simplified here for the lethal and non-lethal strains of P. berghei and P. yoelii but can also be applied with some adjustments to P. chabaudi and P. vinckei rodent malaria species.

Due to the striking similarities of the life cycle and biology of rodent malaria parasites to human malaria parasites, rodent malaria models have become indispensable for malaria research. Herein, we standardized some of the most important techniques used in the phenotypic analysis of wild-type and transgenic rodent malaria species.

ניתוח פנוטימית של מלריה מכרסם טפיל מינית ושלבי דם מיניים ושלבי יתוש

Recent advances in genetics and systems biology technologies have promoted our understanding of the biology of malaria parasites on the molecular level. ...

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine the rate of infection, disseminated infection, and potential transmission of the virus in the mosquito population in question. These procedures are widely utilized with various modifications in vector competence evaluations globally. They are important in determining the potential role that a given mosquito (i.e., species, population, individual) may play in the transmission of a given agent.

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The presented protocol can determine the vector competence of Aedes aegypti mosquito populations for a given virus, such as Zika, in a containment setting.

וקטור יכולת ניתוחים על יתושים Aedes aegypti באמצעות וירוס זיקה

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine ...

Experimental Viral Infection in Adult Mosquitoes by Oral Feeding and Microinjection

Mosquito-borne viruses (MBVs), which are infectious pathogens to vertebrates, are spread by many mosquito species, posing a severe threat to public health. Once ingested, the viruses must overcome the mosquito midgut barrier to reach the hemolymph, from where they might potentially spread to the salivary glands. When a mosquito bites, these viruses are spread to new vertebrate hosts. Similarly, the mosquito may pick up different viruses. In general, only a tiny portion of viruses may enter the salivary glands via the gut. The transmission efficiency of these viruses to the glands is be affected by the two physical barriers found in different mosquito species: midgut barriers and salivary glands barriers. This protocol presents a method for virus detection in salivary glands of Aedes aegypti&#39;s&#160;following oral feeding and intrathoracic injection infection. Furthermore, determining whether the guts and/or salivary glands hinder viral spread can aid in the risk assessments of MBVs transmitted by Aedes aegypti.

This methodology, which included oral feeding and intrathoracic injection infection, could effectively assess the influence of midgut and/or salivary gland barriers on arbovirus infection.

זיהום ויראלי ניסיוני ביתושים בוגרים על ידי האכלה אוראלית ומיקרו-הזרקה

Mosquito-borne viruses (MBVs), which are infectious pathogens to vertebrates, are spread by many mosquito species, posing a severe threat to public ...

A Bacterial Oral Feeding Assay with Antibiotic-Treated Mosquitoes

The mosquito midgut harbors a highly dynamic microbiome that affects the host metabolism, reproduction, fitness, and vector competence. Studies have been conducted to investigate the effect of gut microbes as a whole; however, different microbes could exert distinct effects toward the host. This article provides the methodology to study the effect of each specific mosquito gut microbe and the potential mechanism.
This protocol contains two parts. The first part introduces how to dissect the mosquito midgut, isolate cultivable bacteria colonies, and identify bacteria species. The second part provides the procedure to generate antibiotic-treated mosquitoes and reintroduce one specific bacteria species.

This article presents a protocol to investigate the effect of individual mosquito gut bacteria, including isolation and identification of mosquito midgut cultivable microbes, antibiotic depletion of mosquito gut bacteria, and reintroduce one specific bacteria species.

תסכולת הזנה דרך הפה חיידקית עם יתושים שטופלו באנטיביוטיקה

The mosquito midgut harbors a highly dynamic microbiome that affects the host metabolism, reproduction, fitness, and vector competence. Studies have been ...

Two-layered Membrane Sandwich Method for Laodelphax striatellus Saliva Collection

Rice stripe virus (RSV), which causes significant economic loss of agriculture in East Asia, entirely depends on insect vectors for its effective transmission among host rice. Laodelphax striatellus (small brown planthopper, SBPH) is the primary insect vector that horizontally transmits RSV while sucking sap from the phloem. Saliva plays a significant role in insects' feeding behavior. A convenient method that will be useful for research on insects' saliva with piercing-sucking feeding behavior is described here. In this method, insects were allowed to feed on an artificial diet sandwiched between two stretched paraffin film layers. The diet containing the saliva was collected each day, filtered, and concentrated for further analysis. Finally, the quality of collected saliva was examined by protein staining and immunoblotting. This method was exemplified by detecting the presence of RSV and a mucin-like protein in the saliva of SBPH. These artificial feeding and saliva collection method will lay a foundation for further research on factors in insect saliva related to feeding behavior and virus transmission.

Two-layered Membrane Sandwich Method for Laodelphax striatellus Saliva Collection

The present protocol describes a method to collect sufficient saliva from piercing-sucking insects using an artificial medium. This is a convenient method for collecting insect saliva and studying salivary function on insect feeding behavior and vector-borne virus transmission.

שיטת כריך ממברנה דו שכבתית עבור אוסף הרוק של לאודלפקס

Rice stripe virus (RSV), which causes significant economic loss of agriculture in East Asia, entirely depends on insect vectors for its effective ...

Dissection and Immunostaining of Larval Salivary Glands from Anopheles gambiae Mosquitoes

Mosquito salivary glands (SGs) are a requisite gateway organ for the transmission of insect-borne pathogens. Disease-causing agents, including viruses and the Plasmodium parasites that cause malaria, accumulate in the secretory cavities of SG cells. Here, they are poised for transmission to their vertebrate hosts during a subsequent blood meal. As adult glands form as an elaboration of larval SG duct bud remnants that persist beyond early pupal SG histolysis, the larval SG is an ideal target for interventions that limit disease transmission. Understanding larval SG development can help develop a better understanding of its morphology and functional adaptations and aid in the assessment of new interventions that target this organ. This video protocol demonstrates an efficient technique for isolating, fixing, and staining larval SGs from Anopheles gambiae mosquitoes. Glands dissected from larvae in a 25% ethanol solution are fixed in a methanol-glacial acetic acid mixture, followed by a cold acetone wash. After a few rinses in phosphate-buffered saline (PBS), SGs can be stained with a broad array of marker dyes and/or antisera against SG-expressed proteins. This method for larval SG isolation could also be used to collect tissue for in situ hybridization analysis, other transcriptomic applications, and proteomic studies.

Dissection and Immunostaining of Larval Salivary Glands from Anopheles gambiae Mosquitoes

The adult mosquito salivary gland (SG) is required for the transmission of all mosquito-borne pathogens to their human hosts, including viruses and parasites. This video demonstrates efficient isolation of the SGs from the larval (L4) stage Anopheles gambiae mosquitoes and preparation of the L4 SGs for further analysis.

ניתוח וחיסון של בלוטות הרוק של Larval מ אנופלס גמביה יתושים

Mosquito salivary glands (SGs) are a requisite gateway organ for the transmission of insect-borne pathogens. Disease-causing agents, including viruses and ...

Detecting Virus and Salivary Proteins of a Leafhopper Vector in the Plant Host

Insect vectors horizontally transmit many plant viruses of agricultural importance. More than one-half of plant viruses are transmitted by hemipteran insects that have piercing-sucking mouthparts. During viral transmission, the insect saliva bridges the virus-vector-host because the saliva vectors viruses, and the insect proteins, trigger or suppress the immune response of plants from insects into plant hosts. The identification and functional analyses of salivary proteins are becoming a new area of focus in the research field of arbovirus-host interactions. This protocol provides a system to detect proteins in the saliva of leafhoppers using the plant host. The leafhopper vector Nephotettix cincticeps infected with rice dwarf virus (RDV) serves as an example. The vitellogenin and major outer capsid protein P8 of RDV vectored by the saliva of N. cincticeps can be detected simultaneously in the rice plant that N. cincticeps feeds on. This method is applicable for testing the salivary proteins that are transiently retained in the plant host after insect feeding. It is believed that this system of detection will benefit the study of hemipteran-virus-plant or hemipteran-plant interactions.

This protocol demonstrates how to use the plant host to detect salivary proteins of leafhopper and plant viral proteins released by leafhopper vectors.

איתור חלבוני וירוס ורוק של וקטור עלה בצמח המארח

Insect vectors horizontally transmit many plant viruses of agricultural importance. More than one-half of plant viruses are transmitted by hemipteran ...