בלוטות הרוק של חרקים, נדרשים להעברת מחלות אנושיות רבות. אז הבנה טובה יותר, של ביולוגיה בלוטת השכר צריך לעזור לנו, להוסיף אסטרטגיות קיימות למניעת מחלות. טכניקה זו תאפשר לנו, לשאול במהירות אם מוטציות ברגולטורים המועמדים, משפיעות על המורפולוגיה, על בלוטות הרוק של זחל היתושים, ועלול להשפיע על העברת, של טפילים מלריה.
בפעמים הראשונות שאתה עובד עם זחלי היתושים, הם מאתגרים לתפוס כשהם נעים במהירות. ככל שאתה מתאמן יותר, כך אתה משתפר. תחילת העבודה עם ההליך, תהיה מריסול ליצ'טי, עוזרת מחקר לתואר ראשון במעבדה שלי.
כדי להתחיל את הניסוי, מניחים צלחת סיר על הבמה של מיקרוסקופ מנתח, ומעבירים 10 זחלי L4 יתושים על צלחת הסיר. לאחר מכן מניחים טיפה של תמיסת הניתוח, על צלחת הסיר נפרדת מן הזחלים. השתמש במלקחיים כדי למקם זחל L4 אחד, לתוך טיפת פתרון הניתוח של 25%אתנול.
על ידי החזקת מספר חמש מלקחיים בכל יד, לתפוס את הזחלים עם מלקחיים ממש מתחת לראש, עם היד הדומיננטית, ולאחוז את הראש של הזחל עם היד הלא דומיננטית, ואז בעדינות למשוך את הראש עם כוח קבוע מינימלי, כדי לנתק משאר הגוף, בעוד הבלוטות נשארות מחוברות לראש. לאחר השלכת חלק הגוף של פגר הזחל, לאסוף את הראש או בלוטות הרוק, לתוך מיליליטר אחד של PBS, בצינור צנטריפוגה מיקרו 1.5 מיליליטר, ולחכות בלוטות הרוק, לשקוע לתחתית המאגר. למחרת, לנקז את הפתרון כדי לקבע את הרקמות, עם מיליליטר אחד של קר 100%אצטון במשך 90 שניות.
לאחר הסרת אצטון, בעדינות לשטוף את הרקמות שלוש פעמים, עם מיליליטר אחד של PBS. עבור חיסון, להוסיף נוגדן ראשוני כגון ראב 11, בדילול המתאים, ב 200 microliters של הנפח הכולל של PBS. מערבבים בעדינות את תכולת הצינור עם קצה פיפטה.
לדגור את הנוגדנים העיקריים בן לילה בארבע מעלות, ואחריו לשטוף שלוש פעמים במיליליטר אחד של PBS. לאחר מכן להוסיף את הנוגדן המשני, אלכסה פלור 488 עז אנטי ארנב, בדילול המתאים, ב 200 microliters של נפח כולל. לאחר ערבוב התוכן עם קצה פיפטה, לדגור על הרקמות עם צבעים, כגון אדום הנילוס, ו Hoechst לתוך 200 microliters של PBS, בטמפרטורת החדר במשך 60 דקות, ואחריו כביסה שלוש פעמים עם PBS.
הכן שקופית מיקרוסקופ, על ידי הוספת 200 מיקרוליטרים של 100% גליצרול עם פיפטה, והעברת עד 20 ראשים מוכתמים, עם הבלוטות המצורפות והמבנים הפנימיים, לכל שקופית מיקרוסקופ באמצעות מברשת רכה. מורחים את דגימות הראש החוצה, כדי להפיץ אותן באופן שווה לאורך מגלשת הזכוכית. צפייה תחת מיקרוסקופ ניתוח, להפריד את ראש הזחל מן הבלוטות, באמצעות שני זוגות של מלקחיים, על ידי משיכה בזהירות את שתי הרקמות בכיוונים מנוגדים.
כאשר כל הדגימות נעשות, בעדינות למקם 1.5 מילימטר כיסוי עבה להחליק, על גבי השקופית, הימנעות היווצרות של בועות אוויר, ולאחר מכן לאטום את השקופית עם לק ציפורניים ברור. בלוטות הרוק קלות יחסית לניתוח, משלב ארבע הזחלים. ניתן להבחין בין זחלים זכרים ונקביים, בשלב זחל L4 המאוחר על ידי פס אדום, לאורך בית החזה בגב של הנקבות.
המורפולוגיה של האנטנה משוכללת יותר, בזכרים מאשר בזחלי L4 נשיים כפי שניתן לראות, כאשר החצים הלבנים מצביעים, האנטנות הנשיות בתמונה השמאלית והאנטנות הגבריות מימין. בלוטות הרוק המבודדות מזחלי שלב L4 מוקדמים, מוכתמים בהוכסט חושפות את האונות הפרוקסימליות והדיסטליות, המופרדות על ידי התכווצות צרה. הלומן המתגבש נבדק, בבלוטת הרוק הדיסטלית המוכתמת באימונו, של זחל L4 מאמצע עד מאוחר.
התחומים האפיליים של תאי ההפרשה, המקיפים את הלומן המתגבש היו כתמים אדומים עזים של הנילוס, המרמזים על מיקרובילי כמו מבנים. הכתמים של ראב 11 נצפו קרוב, אל פני השטח האפיריים. יש רק צעד אחד עם הזמן, וזה הדגירה של 90 השניות, של הרקמות באצטון קר.
פרוטוקול זה פותח רק לאחרונה, אבל אנחנו מצפים שזה יהיה מועיל, לכל מי שעובד על בלוטת הרוק יתוש. אנו מצפים להשתמש בו לעתים קרובות.
