פרוטוקול זה יכול לקבוע אם המעיים ובלוטות התריס מעכבים את התפשטות הנגיפים ויכול לסייע בהערכת הסיכון של וירוסים המועברים על ידי יתושים המועברים על ידי Aedes aegypti. הפרוטוקול שלנו כלל שתי שיטות זיהום, הזנה דרך הפה וזריקה תוך חזה, אשר יכול להעריך ביעילות את היכולת הווקטורית של arbovirus. פרוטוקול זה עשוי להיות מיושם על זיהומים נוספים arbovirus במגוון רחב של וקטורים יתושים, כגון וירוס דנגי זיהום וירוס זיקה ב Aedes, והוא יכול להוכיח להיות הליך מעשי.
מי שתדגים את ההליך תהיה פיי וואנג, עוזרת מחקר מהמעבדה שלי. כדי לבצע הזנה מלאכותית באמצעות מערכת האכלת יתושים מלאכותית, חתכו את קרומי הקולגן לגודל המתאים, והצמידו אותם למאגרים בעזרת אורינגים. הוסיפו שלושה מיליליטר מתערובת הנגיף-דם למאגרים, ואטמו את המאגרים באמצעות פקקי פלסטיק למניעת דליפות.
הכניסו את כוסות הפלסטיק המכילות יתושים לתא הכפפות. הבריגו את המאגרים האטומים למזין FU1, והניחו מאגר אחד על אחת. הפעל את יחידת הכוח, והאכיל את היתושים במשך שעה אחת.
לאחר האכלה, להרדים את היתושים עם קרח במשך כמה שניות עד שהם מתעלפים. יוצקים את היתושים המורדמים לתוך צלחת פטרי המונחת על קרח, ומכסים את המכסה במהירות. קטפו נקבות יתושים חרוטות בעזרת מלקחיים, והעבירו אותן לכוסות פלסטיק חדשות ב-50 נקבות יתושים לכוס.
עוטפים את הכוס ברשת כילה חתוכה, ומכסים אותה במכסה עם חור באמצע. חותכים את הספוג לחתיכות קטנות, ומניחים אותם על הכוסות. יש להוסיף תמיסת גלוקוז 8% לספוג באמצעות טפטפת חד פעמית מפלסטיק.
הניחו את הכוסות המכילות נקבות יתושים באינקובטור בטמפרטורה של 27 מעלות צלזיוס בלחות של 80% למשך 10 ימים. החליפו ספוג חדש רווי גלוקוז כל 72 שעות. לחיסון תוך חזי, הכינו נקבות יתושים כמתואר בכתב היד של הטקסט.
כדי להכין את דילול הנגיף המדבק, הוציאו את מלאי הנגיף מהמקפיא של 80 מעלות צלזיוס, והפשירו אותו על קרח. מלאי וירוסים מדוללים בדילול וירוס של 100 ננוליטר המכיל 100 עד 500 יחידות יוצרות פלאק עם RPMI 1640 בינוני המכיל 10% FBS ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין. מניחים את דילול הנגיף על קרח.
לאחר מכן, הכינו את מחטי המיקרו-הזרקה באמצעות Puller 1000 עם הפרמטרים בתוכנית מושך המחטים שנקבעו כמדד חום ל-450, כוח ב-g ל-110, מרחק במילימטר לאחד, והשהיה בשניות לאפס. חותכים קצה של מחט משוכה בפינצטה תחת מיקרוסקופ מנתח בהגדלה של פי 16. ממלאים את המחט בשמן מינרלי באמצעות מזרק סטרילי חד פעמי.
חבר את המחט למזרק בהתאם להוראות המכונה. הכנס את המחט בזהירות לתוך צינור המכיל דילול וירוס זיהומיות. לאחר מכן, לחץ על כפתור מילוי כדי למלא כארבעה מיקרוליטרים של דילול וירוס לתוך המחט.
לאחר מילוי המחט, אין לגעת במחט או לפגוע בה. קטפו בפינצטה כ-50 נקבות יתושים מורדמות, והניחו אותן על צלחת קרח. מניחים את הצלחת מתחת למזרק, ומחדירים את המחט לחלל בית החזה של היתוש תחת מיקרוסקופ מנתח.
הגדר את נפח ההזרקה ל -100 ננוליטר ואת הקצב ל -50 ננוליטר לשנייה. לחץ על כפתור ההזרקה כדי לאפשר לתמיסת הנגיף לזרום לתוך היתוש. לאחר הזרקה מוצלחת, הבטן בולטת מעט.
הכניסו את היתוש הנגוע לכוס פלסטיק חדשה שהונחה על קרח. כאשר מספר היתושים הנגועים מספיק, עוטפים את הכוס ברשת כילה חתוכה ומכסים אותה במכסה. כדי לאסוף רוק מנקבות היתושים הנגועות, שפכו את היתושים המורדמים לתוך צלחת פטרי שהונחה על קרח, וסגרו את המכסה במהירות.
מניחים קצוות פיפטה של 10 מיקרוליטר מלאים בשמן טבילה זה לצד זה על בוץ הגומי. קטפו את נקבות היתושים בפינצטה, והניחו אותן על צלחת קרח. הסירו את רגליהם וכנפיהם בפינצטה.
הניחו את פיו של יתוש אחד על כל קצה פיפטה כדי לאסוף את הרוק כפי שהופרש לשמן על ידי היתושים בטמפרטורת החדר. לאחר 45 עד 60 דקות, מניחים את קצות פיפטה בצינורות 1.5 מיליליטר המכילים 200 מיקרוליטר של מדלל וירוס. צנטריפוגה את הצינורות ב 5, 000 גרם במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי לגרש רוק לתוך הצינורות.
אחסנו את הצינורות המכילים רוק בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס לצורך קביעה עוקבת של קצבי ההדבקה. לאחר איסוף הרוק, נתחו את נקבות היתושים הנגועות. בעזרת פינצטה, חותכים את ראשי היתושים, ומניחים כל ראש לתוך צינור בודד המכיל 200 מיקרוליטר של מדיום RPMI 1640.
תפוס את בית החזה עם טוויטר. לאחר מכן, תפסו את החלק הלפני אחרון של הבטן עם טוויטר נוסף, ומשכו את הבטן החוצה. נקו את המעי עבור כל רקמה ואיברים תועים.
שטפו את המעי עם PBS, והכניסו כל מעי לצינור נפרד המכיל 200 מיקרוליטר של מדיום RPMI 1640. אחסנו את הצינורות הללו בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס לצורך קביעה עוקבת של קצב הפצת הנגיף וקצב ההדבקה. בניתוח מייצג זה נקבעו RNA נגיפי במעיים, בראש וברוק של נקבות היתושים לאחר 10 ימים לאחר ההדבקה.
הטיטר הווירוסי של נגיף אגם אבינור במעיים, בראש וברוק של היתושים שחוסנו תוך בית החזה היה גבוה מזה של היתושים הנגועים דרך הפה. שיעור ההדבקה וההפצה של היתושים שחוסנו תוך בית החזה היה 100% ושל היתושים הנגועים דרך הפה נמצא על 70% ו-38.1% בהתאמה. שיעור ההדבקה של היתושים שחוסנו תוך בית החזה הגיע עד 90%, אך עבור היתושים הנגועים דרך הפה היה רק 4.8%. נקבות היתושים הנגועות נקטפו כדי לשמור על עקביות, שכן כמות ההזנה משפיעה על התוכן הנגיפי.
