המחברים רוצה להודות מודלים מחלה נדירה ורשת מנגנון (RDMM) (במימון את קנדי מוסדות של הבריאות מחקר (CIHR) ואת הגנום קנדה). CK נתמכת על ידי פרס מלגת UROP (מאוניברסיטת אוטווה). DLJ נתמך על ידי מלגה לתואר שני של קנדה וניהר. חוג ידידי הפקולטה נתמכת על ידי פרס בתר קנדי מוסדות של הבריאות מחקר (CIHR). המחברים תודה על גנטיקה החברה של אמריקה למתן הרשאה לפרסם פרוטוקול זה וכדי להשתמש עיבוד של 5 איור משלים מ פנה, ואח.

נהלים מעורבים בעלי חיים אושרו והנושאים הם על פי הנחיות טיפול בבעלי חיים מסופקים על ידי המועצה הקנדית על בעלי חיים והטיפול מאוניברסיטת אוטווה ועדות טיפול בבעלי חיים.
1. הכנה
<ol><li>להכין את השטח לנתיחה על ידי מקליטה מכסה פטרי 9 ס מ עם קלטת autoclave על פני השטח הפנימי שלו. מקם את זה תחת מיקרוסקופ סטריאו.</li>
	<li>מקום 3-5 ימים לאחר ההפריה (dpf) דג זברה הזחלים ב פטרי צלחת, עזים ומתנגד במ מ ˜1.5 Tricaine x E3 1 העובר בתקשורת (5 מ מ NaCl, 0.17 מ מ אשלגן כלורי, 0.33 מ מ CaCl2, 0.33 מ מ MgSO4, pH 7.2).</li>
	<li>לחתוך את הקצה של טיפ פיפטה P1000 עם זוג מספריים או סכין גילוח עד קוטר של 2 מ מ כדי להכיל זחל dpf 3 עם לחץ מינימלי.</li>
</ol>2. פין מסיכה של הזחלים דג זברה
<ol><li>לאסוף של זחל anesthetized באמצעות micropipette את-P1000 ששונה ולמקם הזחל דג זברה על הקלטת אוטוקלב ממוקם על המכסה פטרי.</li>
	<li>הסרת עודפי פתרון Tricaine סביב הזחל משתמש של micropipette. האזור צריך להיות יבש כמו אפשרי בהצלחה סעיף ולאסוף את הנוסח אבל עדיין רטוב כדי להבטיח הישרדות.</li>
	<li>באמצעות אזמל מיקרו, סעיף הסנפיר סימטרית תחת סטריאו-מיקרוסקופ כמצוין ב- איור 1, כפי שמתואר ווילקינסון ואח16. במהלך החיתוך, החל לחץ כלפי מטה קבוע בתוך האתר הפער פיגמנט של סנפיר סימטרית, דיסטלי להגביל זרימת הדם (איור 1 א'). הפעילו לחץ עדין כדי למנוע נזק של מיתר הגב.</li>
	<li>לדמיין את הסנפיר משרטוטי תחת המיקרוסקופ ומקם את פיסת מעל הקצה הלהב microscalpel (איור 2 א). מניחים את microscalpel המכיל את הנוסח על פני פיסת נייר סינון קטנה. הערה: בשל נוכחותם של מלנוציטים בתוך רקמת transected, שלב זה מאפשר הדמיה של הסנפיר כמו כתם שחור קטן (איור 2B).</li>
	<li>באמצעות מספריים תגליתו (איור 2C), העברת נייר הסינון המכיל את הנוסח כדי צלחת PCR 96-ובכן, המכיל 25 μL של 50 מ מ NaOH פתרון לכל טוב (איור דו-ממדי).</li>
	<li>להכין צלחת 96-ובכן שטוח התחתונה, מספור לבאר על פי התווית של צלחת PCR. בזהירות בעזרת פיפטה P1000 ששונה את מלא 200 µL של טרי 1 x E3 העובר מדיה, לאסוף את הזחל דג זברה באמצעות לחץ עדין. לוותר על הזחל בתוך הלוחית תרביות רקמה 96-ובכן, באותו מספר טוב כמו הצלחת ה-PCR (2E איור).</li>
	<li>ודא כי נייר הסינון טוב שקוע בפתרון (איור 2F). לנקות את הלהב של microscapel, פינצטה בין כל חתך למניעת זיהום צולב על ידי טבילת האזוב בתוך תמיסת EtOH 70%. נגב את הלהב עם רקמת נייר נקי/מחיקה.</li>
	<li>חזור על שלבים 2.1-2.7 עד שאיבדת כל העוברים.</li>
	<li>לאחסן את הזחלים בצלחת 96-ובכן-28 ° C עד אחרים זוהו. הערה: המדיה העובר לא צריך להיות שונה, שכן הפרוטוקול ניתן להשלים בקלות פחות מ- 2 ימים. אם נדרש זמן רב יותר, מומלץ שינוי מדיה.</li>
</ol>3. הפקת דנ א גנומי
<ol><li>חותם את הצלחת ה-PCR 96-ובכן, צנטריפוגה הדגימות-1000 g x עבור 1 דקות לוודא את כל הניירות מסנן טובע בתוך הפתרון NaOH.</li>
	<li>עבור פירוק רקמת, מחממים את דוגמאות thermocycler ב 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ולאחריו קירור עד 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.</li>
	<li>להוסיף 6 μL של 500 מ מ טריס-HCl, pH 8.0 על כל דגימה. מערבולת.</li>
	<li>Centrifuge בקצרה את הצלחת ב g x 1,500, עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>השתמש μL 1.5 של תגובת שיקוע הדנ א לפי תגובת ה-PCR.</li>
	<li>הכן ה-PCR כדי גנוטיפ הזחלים, כפי שמוצג בטבלה 1-2. הערה: פרוטוקול זה נבדקה שני יישומים: מגה-פלקס תגובות PCR חושף את גנוטיפ באמצעות ג'ל agarose9, heteroduplex נמס assay (HMA) חושף את אחרים באמצעות לזיהוי ג'ל אלקטרופורזה (עמוד)17.</li>
</ol>4. אלטרנטיבית החילוץ גנומית באמצעות שרף Chelating
<ol><li>שלב שלם 2.5 על-ידי הוספת מסנן נייר עם הסנפיר החתוכים צלחת PCR 96-ובכן, המכיל 30 μL של 5% chelating שרף (styrene-divinylbenzene קופולימר המכיל יונים iminodiacetate מזווג). הערה: זה סוג של שרף משמש בדרך כלל עבור פירוק רקמת והכנה של PCR-מוכנות DNA באופן מהיר ויעיל18.</li>
	<li>בצע את שלבים 2.6-2.8 כמצוין.</li>
	<li>לאטום את הצלחת ה-PCR 96-ובכן, בקצרה centrifuge את הדוגמאות כדי לוודא כי כל נייר סינון שקוע בתוך השרף chelating.</li>
	<li>עבור פירוק רקמת, מחממים את דוגמאות thermocycler ב 95 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות ולאחריו קירור עד 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. הערה: שלב זה מאפשר פירוק איגוד עוקבות של חרוזים שרף קוטבי לרכיבים הסלולר בעוד DNA ו- RNA להישאר בפתרון.</li>
	<li>Centrifuge בקצרה את הדגימות הצניפה את החרוזים שרף ולקבל את ה-DNA ההשעיה.</li>
	<li>בצע את שלבים 3.5-3.6 להשלמת הליך genotyping.</li>
</ol>5. יישום 1: מגה-פלקס PCR שלאחריה יבוא ניתוח Agarose ג'ל
<ol><li>בעקבות טבלה 1, להגדיר תגובה PCR מולטיפלקס כדי לאפשר את האפליה בין מוטציות homozygous, heterozygotes, WT הזחלים. השתמש הצנטרפוגה תרמי 96-ובכן כדי לבצע את תגובות PCR באמצעות רכיבה על אופניים בתנאים המתוארים בטבלה3. הערה: תגובות PCR ניתן גם לבצע ב כל אחרים קונבנציונאלי PCR תרמי הצנטרפוגה. דוגמה זו מתארת את אסטרטגיית ה-PCR המשמש פנה, et al. 9 כדי לזהות aldh7a1 WT ו- 5-bp הכניסה אללים mutant ב אותה התגובה מולטיפלקס.</li>
	<li>הכנת ג'ל agarose 1% נתרן בוראט מאגר, מוכתם 1 x GelRed. הערה: 20 x מלאי מאגר נתרן בוראט מורכב 40 מיליליטר 10 מ' NaOH, מ 1800 ל- ddH2O, pH להתאים ל- 8.5 עם 76 גרם חומצה בורית, ואז השלים לנפח סופי 2 ל' באמצעות ddH2O.</li>
	<li>הפעל את הג'ל במאגר נתרן בוראט 1 x למשך 15 דקות ב 250 V. כדי להקל על התהליך, במידת האפשר, השתמש ג'ל מערכת תואמת pipets רב-ערוצי כדי לאפשר יכולות תפוקה גבוהה יותר על-ידי הפחתת הזמן דוגמיות.</li>
	<li>תמונה הג'ל מתחת לאור אולטרה סגול (UV) כדי לאפשר אפליה אחרים שונים.</li>
</ol>6. יישום 2: Heteroduplex נמס Assay
<ol><li>להכין דף 12% ג'ל שימוש במשטח מרווח 1.5 מ מ ומסרקים 15-דוגמאות. להכין שני ג'לים דף משתמש mL 12.21 ddH2O, 2.52 מיליליטר 10 x טריס/בוראט/EDTA (TBE), 10 מ של אקרילאמיד 30%, 250 μL של 10% קירור (APS) ו 20 μL של tetramethylethylenediamine (TEMED). השתמש 1 מאגר x TBE (0.089 מ' טריס-HCl, חומצה בורית מ' 0.089 וחומצה ethylenediaminetetraacetic 0.002 M (EDTA)) זהה להפעלת המאגר.</li>
	<li>מחממים את המוצרים PCR ב 94 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.</li>
	<li>מגניב הצינורות על הקרח או את thermocycler 10 דקות ב 4 º C.</li>
	<li>לטעון μL 10 עבור דגימה PCR ו- 8 μL של סמן משקל מולקולרי.</li>
	<li>הפעל את הדף ב-150 V ב- x 1 TBE באמצעות מערכת אלקטרופורזה אנכי 1 h או עד דה מרקר משקל מולקולרי כמעט מגיע לקו הרגל של לוח הזכוכית.</li>
	<li>תמונה הג'ל תחת אור UV כדי לאפשר אפליה אחרים שונים.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), (2013).</li><li>Stewart, A. M., Kalueff, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+better+and+more+valid+animal+models+of+brain+disorders.">Developing better and more valid animal models of brain disorders.</a> Behav Brain Res. 276, 28-31 (2015).</li><li>Grone, B. P., Baraban, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+in+epilepsy+research:+legacies+and+new+directions.">Animal models in epilepsy research: legacies and new directions.</a> Nat Neurosci. 18 (3), 339-343 (2015).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+Zebrafish+Embryos+to+Analyze+Gene+Function.">Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function.</a> J Vis Exp. (25), e1115 (2009).</li><li>Doyon, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heritable+targeted+gene+disruption+in+zebrafish+using+designed+zinc-finger+nucleases.">Heritable targeted gene disruption in zebrafish using designed zinc-finger nucleases.</a> Nat Biotechnol. 26 (6), 702-708 (2008).</li><li>Bedell, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Genome+Editing+Using+High+Efficieny+TALENs.">In vivo Genome Editing Using High Efficieny TALENs.</a> Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).</li><li>Sander, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+disruption+in+somatic+zebrafish+cells+using+engineered+TALENs.">Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs.</a> Nat Biotechnol. 29 (8), 697-698 (2012).</li><li>Hwang, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+genome+editing+in+zebrafish+using+a+CRISPR-Cas+system.">Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system.</a> Nat Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).</li><li>Pena, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyridoxine-Dependent+Epilepsy+in+Zebrafish+Caused+by+Aldh7a1+Deficiency.">Pyridoxine-Dependent Epilepsy in Zebrafish Caused by Aldh7a1 Deficiency.</a> Genetics. 207, 1501-1518 (2017).</li><li>Baraban, S. C., Dinday, M. T., Hortopan, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+screening+in+Scn1a+zebrafish+mutant+identifies+clemizole+as+a+potential+Dravet+syndrome+treatment.">Drug screening in Scn1a zebrafish mutant identifies clemizole as a potential Dravet syndrome treatment.</a> Nat Commun. 4, 2410 (2013).</li><li>Godoy, R., Noble, S., Yoon, K., Anisman, H., Ekker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemogenetic+ablation+of+dopaminergic+neurons+leads+to+transient+locomotor+impairments+in+zebrafish+larvae.">Chemogenetic ablation of dopaminergic neurons leads to transient locomotor impairments in zebrafish larvae.</a> J Neurochem. 135, 249-260 (2015).</li><li>Scheldeman, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurobiology+of+Disease+mTOR-related+neuropathology+in+mutant+tsc2+zebra+fish+Phenotypic,+transcriptomic+and+pharmacological+analysis.">Neurobiology of Disease mTOR-related neuropathology in mutant tsc2 zebra fish Phenotypic, transcriptomic and pharmacological analysis.</a> Neurobiol Dis. 108 (September), 225-237 (2017).</li><li>Zabinyakov, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+first+knock-out+aldh7a1+zebrafish+model+for+pyridoxine-dependent+epilepsy+using+CRISPR-Cas9+technology.">Characterization of the first knock-out aldh7a1 zebrafish model for pyridoxine-dependent epilepsy using CRISPR-Cas9 technology.</a> PLoS One. 12 (10), 1-14 (2017).</li><li>Grone, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epilepsy,+behavioral+abnormalities,+and+physiological+comorbidities+in+syntaxin-binding+protein+1+(STXBP1)+mutant+zebrafish.">Epilepsy, behavioral abnormalities, and physiological comorbidities in syntaxin-binding protein 1 (STXBP1) mutant zebrafish.</a> PLoS One. 11 (3), (2016).</li><li>Kawakami, K., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+identification+of+transgenic+zebrafish.">Rapid identification of transgenic zebrafish.</a> Trends Genet. 12 (1), 9-10 (1996).</li><li>Wilkinson, R. N., Elworthy, S., Ingham, P. W., van Eeden, F. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+high-throughput+PCR-based+genotyping+of+larval+zebrafish+tail+biopsies.">A method for high-throughput PCR-based genotyping of larval zebrafish tail biopsies.</a> Biotechniques. 55 (6), 314-316 (2013).</li><li>Zhu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+genotyping+method+for+genome-modified+animals+and+human+cells+generated+with+CRISPR/Cas9+system.">An efficient genotyping method for genome-modified animals and human cells generated with CRISPR/Cas9 system.</a> Sci Rep. 4, 6420 (2014).</li><li>Walsh, P. S., Metzger, D. A., Higuchi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chelex+100+as+a+medium+for+simple+extraction+of+DNA+for+PCR-based+typing+from+forensic+material.">Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material.</a> Biotechniques. 54 (3), 506-513 (2013).</li><li>Ewing, B., Green, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basecalling+of+automated+sequencer+traces+using+phred.+II.+Error+probabilities.">Basecalling of automated sequencer traces using phred. II. Error probabilities.</a> Genome Res. 8, 175-185 (1998).</li></ol>

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

ג'ין כלי עריכה יש כבר מועסקים בדיוק להציג מוטציות, transgenes של דג זברה האחרונות שנים5,6,7,8. בעת ביצוע המחלה דוגמנות בשנת דג זברה, פנוטיפים זחל או ילדותי המוקדמות הם נצפו לעתים קרובות9,12,<su...

דג זברה (רזבורה rerio) הוא יצור חוליות בשימוש נרחב כמודל לחקירה המחלה, כמו גם לגבי בדיקות פרה של השערות טיפולית-1,-2,-3. בעלי חיים אלה יש זמן דור קצר, קל לטפל, להציג שיעור הרבייה גבוה, בעלות נמוכה, ולא נתונות בקלות שינויים גנטיים על-ידי microinjection של ה-DNA עוברי4. דרך ההתפתחות הגוברת של הרומן הטרנסגניים וג'ין עריכה טכנולוגיות כגון אבץ-אצבע nucleases (ZFN)5,6,Nucleases אפקטור כמו טל (TALENs)7, וקצר את מקובצים באופן קבוע Interspaced Palindromic חוזר (CRISPR) / CRISPR-הקשורים 9 (Cas9) מערכת8, דג זברה צפוי באופן משמעותי לשפר את ההבנה של מספר תנאים פיפטות. טכנולוגיות אלה שימשו כדי ליצור כיסויים ממוקד בשני סומאטית ולשנות germline בתאים דג זברה, ביעילות מחורזות גנטית בעלי חיים8. הדוגמאות האחרונות בספרות כוללות פיתוח מוצלח של דגמים גנטיים של אפילפסיה, הפרעות מטבוליות דג זברה3,9,10,11,12 .
עם ההתקדמות בעריכת הגנום דג זברה, מהיר ואמין genotyping הפך צעד הגבלת קצב מוטל בספק. זיהוי מוטציות DNA ספציפיים סמוכים לאתר החזוי לעריכת הגנום היעד היא שלב חיוני של הפרוטוקול. באופן מסורתי, טכניקות genotyping מאת פין מסיכה בדרך כלל רק שבוצעו בנער או מבוגר דג זברה. עם זאת, הזמן בילה דג זברה העלאת לבגרות (> 2 חודשים) מעכב במידה ניכרת התקדמות במחקר. במקרים רבים, לבגרות אינה יכולה להיות מושגת בשל הסתרה באמצעות גנים חיוניים (למשל, בדוגמנות מחלה) או רווח-של-פונקציה מוטציות שמוביל פנוטיפי השפעות מזיקות. בנוסף, מספר מבחני דורשים איגום של הזחלים, כגון ה-RNA או מטבוליט החילוץ, ולערב ובכך זיהוי מראש של אחרים, אשר עשויה להיות מאתגרת כאשר רק פוסט הוק genotyping טכניקות זמינים. את הדוגמאות הנ ל מדגישים את החשיבות של טכניקות genotyping זחל אשר נמצאים באותו זמן מדויק ולאפשר החלמה מלאה, התפתחות תקינה של הזחלים. Genotyping דג זברה בשלב מוקדם לא מופיע כעת כדי להיות בשימוש נרחב; זה משתקף על ידי פרסומים אחרונים של מודלים מחלה שבה הזחל אחרים מזוהים באמצעות פוסט-מורטם genotyping ולא genotyping לפני ביצוע הניסוי12,13,14. בנייר זה, אסטרטגיה קליפ פין זחל מוצגת במטרה לייעל את ההליכים genotyping שנוצרו קודם לכן.
בעבר, אסטרטגיות העסקת מערכת העיכול proteinase K גנוטיפ חיים דג זברה הזחלים הובילו פולימראז משתנה-תגובת שרשרת (PCR)-יעילות-15. למרות יותר שפורסם לאחרונה טכניקה ביופסיה הזנב מיקרוסקופיים סיפק תוצאות מבטיחות יותר16, אנחנו וארגונים אחרים לא היו מסוגלים להפיק את נצילות גבוהה והתאוששות DNA שדווחו על-ידי המחברים. עיכוב העיקריים של פרוטוקול מתוארת על ידי ווילקינסון. et al. 16 יכול להיות ההעברה של הרקמה זנב אל הצינור ה-PCR. בשל גודלו מיקרוסקופיים, קשה להבטיח הנוסח היה כראוי שנאספו על ידי pipetting. כדי לטפל מחסום זה, פיתחנו פרוטוקול משופרת עבור מספרים גדולים genotyping של הזחלים חיים דג זברה עם כמעט 100% יעילות9. שימוש של microscalpel, קצה הזנב סנפיר הוסר, להציב על גבי פיסת נייר סינון. פיסת נייר סינון המכיל את הרקמה יכול להיות בקלות דמיינו והניח כהלכה לתוך צינור ה-PCR. הפקת דנ א גנומי מתבצע לאחר מכן, ואחריו PCR הגברה של האזור בעל עניין עד גנוטיפ הדגימה. היתרונות של שיטה זו כוללים PCR יעילות גבוהה, קצב נמוך חיובי כוזב, התמותה נמוכה. בנוסף, genotyping מספר גדול של עוברי אפשרי באמצעות פרוטוקול זה. הפרוטוקול המתואר במסמך זה מאפשר סנפיר-מסיכה של מאות הזחלים בתוך 2-3 h באמצעות גישה זו ועל זיהוי נכון של דגים genotyped והתחדשות הזנב בתוך יומיים.

<table><tbody><tr><td>Petri dish</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>Microscalpel</td><td>World Precision Instruments</td><td>500249</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ1500</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine/Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>96-well Tissue-culture plate</td><td>Costar</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>96-well PCR plate</td><td>Fisher</td><td>14230232</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher</td><td>S25548A&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tris base&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>5% Chelex 100 sodium form</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7901</td><td></td></tr><tr><td>GelRed 1x</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td></td></tr><tr><td>Boric Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6768</td><td></td></tr><tr><td>Sub-Cell Model 192 system</td><td>Bio-Rad&amp;nbsp;</td><td>1704508</td><td></td></tr><tr><td>30 % Acrylamide/Bis Solution, 37.5: 1</td><td>Bio-Rad&amp;nbsp;</td><td>1610158</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq Green Master Mix, 2X</td><td>Promega</td><td>M7123</td><td></td></tr><tr><td>paper wipes (Kimwipes&amp;reg; disposable wipers)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z188956</td><td></td></tr><tr><td>1kb-plus molecylar weight marker&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM1343</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease free water&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W4502</td><td></td></tr><tr><td>Sub-Cell Model 192 system (high-throughput agarose gel system)</td><td>Bio-Rad&amp;nbsp;</td><td>1704508</td><td></td></tr><tr><td>vertical gel electrophoresis system Mini-PROTEAN Tetra Cell&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad&amp;nbsp;</td><td>1658004</td><td></td></tr></tbody></table>

high-throughput dna extraction and genotyping of 3dpf zebrafish larvae by fin clipping

דג זברה (רזבורה rerio) בעלי orthologues 84% של הגנים הידועים להיות מזוהה עם מחלות אנושיות. בנוסף, בעלי חיים אלה יש זמן דור קצר, קל לטפל, להציג שיעור הרבייה גבוה, בעלות נמוכה, ואת נתונות בקלות שינויים גנטיים על-ידי microinjection של ה-DNA של העוברים. התפתחויות אחרונות ג'ין כלי עריכה מפעיל את הקדמה מדויק של מוטציות, transgenes של דג זברה. מחלת דוגמנות בשנת דג זברה לעיתים קרובות מוביל פנוטיפים זחל ומוות מוקדם, אשר עשויה להיות מאתגרת לפרש אם אחרים אינם ידועים. זה זיהוי מוקדם של אחרים הוא גם הצורך בניסויים הדורשים מדגם איגום, כגון גנים ביטוי או מסה ספקטרומטר מחקרים. עם זאת, ההקרנה נרחב genotypic מוגבל באמצעות שיטות מסורתיות, אשר במעבדות רוב מבוצעות רק על דג זברה למבוגרים או הזחלים לאחר המוות. אנחנו פתרנו בעיה זו על ידי התאמת שיטת הבידוד של DNA גנומי מוכן-PCR הזחלים חיים דג זברה ניתן להשיג מוקדם ככל 72 h שלאחר ההפריה (hpf). הזמן הזה, טכניקה חסכונית, השתפרו מפרוטוקול genotyping שפורסמו בעבר, מאפשר זיהוי אחרים מן מיקרוסקופיים פין. ביופסיות. הסנפירים במהירות להתחדש כאשר הזחלים מתפתחים. חוקרים יכולים ואז בחר ולגדל את אחרים הרצוי לבגרות על ידי ניצול זה תפוקה גבוהה הליך genotyping מבוססי ה-PCR.

היעילות של protocoll הודגם על ידי genotyping הצאצאים הצלב משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים (aldh7a1/ ot100, המוצג כאן כ aldh7a1+ /-) (איור 3A- C)9. אלל mutant aldh7a1ot100יש 5-(bp) הכניסה אקסון קידוד הראשון של הגן aldh7a1 דג זב?...

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping at JoVE.com

High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping

מיצוי DNA תפוקה גבוהה, Genotyping של הזחלים דג זברה 3dpf על-ידי המסיכה פין

דג זברה שימשו מודל גנטי אמין האורגניזמים במחקר ביו-רפואי, במיוחד עם כניסתו של טכנולוגיות לעריכת ג'ין. כאשר הזחל פנוטיפים צפויים, זיהוי ה-DNA החילוץ, גנוטיפ יכול להיות מאתגר. כאן, אנו מתארים הליך genotyping יעיל עבור הזחלים דג זברה, מאת הזנב מסיכה, מוקדם ככל 72-h שלאחר ההפריה.

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short ...

high-throughput-dna-extraction-genotyping-3dpf-zebrafish-larvae-fin

Research

JoVE Journal

Genetics

13.9K Views.  Children's Hospital of Eastern Ontario Research Institute. דג זברה שימשו מודל גנטי אמין האורגניזמים במחקר ביו-רפואי, במיוחד עם כניסתו של טכנולוגיות לעריכת ג'ין. כאשר הזחל פנוטיפים צפויים, זיהוי ה-DNA החילוץ, גנוטיפ יכול להיות מאתגר. כאן, אנו מתארים הליך genotyping יעיל עבור הזחלים דג זברה, מאת הזנב מסיכה, מוקדם ככל 72-h שלאחר ההפרי...

Video: High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development of a customizable platform to rapidly generate gene modifications in a wide variety of organisms, including zebrafish. CRISPR-based genome editing uses a single guide RNA (sgRNA) to target a CRISPR-associated (Cas) endonuclease to a genomic DNA (gDNA) target of interest, where the Cas endonuclease generates a double-strand break (DSB). Repair of DSBs by error-prone mechanisms lead to insertions and/or deletions (indels). This can cause frameshift mutations that often introduce a premature stop codon within the coding sequence, thus creating a protein-null allele. CRISPR-based genome engineering requires only a few molecular components and is easily introduced into zebrafish embryos by microinjection. This protocol describes the methods used to generate CRISPR reagents for zebrafish microinjection and to identify fish exhibiting germline transmission of CRISPR-modified genes. These methods include in vitro transcription of sgRNAs, microinjection of CRISPR reagents, identification of indels induced at the target site using a PCR-based method called a heteroduplex mobility assay (HMA), and characterization of the indels using both a low throughput and a powerful next-generation sequencing (NGS)-based approach that can analyze multiple PCR products collected from heterozygous fish. This protocol is streamlined to minimize both the number of fish required and the types of equipment needed to perform the analyses. Furthermore, this protocol is designed to be amenable for use by laboratory personal of all levels of experience including undergraduates, enabling this powerful tool to be economically employed by any research group interested in performing CRISPR-based genomic modification in zebrafish.

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Targeted genome editing in the model system Danio rerio (zebrafish) has been greatly facilitated by the emergence of CRISPR-based approaches. Herein, we describe a streamlined, robust protocol for generation and identification of CRISPR-derived nonsense alleles that incorporates the heteroduplex mobility assay and identification of mutations using next-generation sequencing.

ייצור יעיל והסתרות שנוצרו על-ידי זיהוי של CRISPR/Cas9 ג'ין, מערכת מודל רזבורה rerio

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA mutation rates. Changes in replication timing occur during development and in cancer, but the role replication timing plays in development and disease is not known. Zebrafish were recently established as an in vivo model system to study replication timing. Here is detailed the protocols for using the zebrafish to determine DNA replication timing. After sorting cells from embryos and adult zebrafish, high-resolution genome-wide DNA replication timing patterns can be constructed by determining changes in DNA copy number through analysis of next generation sequencing data. The zebrafish model system allows for evaluation of the replication timing changes that occur in vivo throughout development, and can also be used to assess changes in individual cell types, disease models, or mutant lines. These methods will enable studies investigating the mechanisms and determinants of replication timing establishment and maintenance during development, the role replication timing plays in mutations and tumorigenesis, and the effects of perturbing replication timing on development and disease.

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Zebrafish were recently used as an in vivo model system to study DNA replication timing during development. Here is detailed the protocols for using zebrafish embryos to profile replication timing. This protocol can be easily adapted to study replication timing in mutants, individual cell types, disease models, and other species.

פרופיל תזמון שכפול ה-DNA באמצעות דג זברה כמערכת מודל In Vivo

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been described at the morphological level, little is known about the molecular basis of cellular changes that occur as the organism develops. With recent advancements in microfluidics and multiplexing technologies, it is now possible to characterize gene expression in single cells. This allows for investigation of heterogeneity between individual cells of specific cell populations to identify and classify cell subtypes, characterize intermediate states that occur during cell differentiation, and explore differential cellular responses to stimuli. This study describes a protocol to isolate viable, single cells from zebrafish embryos for high throughput multiplexing assays. This method may be rapidly applied to any zebrafish embryonic cell type with fluorescent markers. An extension of this method may also be used in combination with high throughput sequencing technologies to fully characterize the transcriptome of single cells. As proof of principle, the relative abundance of cardiac differentiation markers was assessed in isolated, single cells derived from nkx2.5 positive cardiac progenitors. By evaluation of gene expression at the single cell level and at a single time point, the data support a model in which cardiac progenitors coexist with differentiating progeny. The method and work flow described here is broadly applicable to the zebrafish research community, requiring only a labeled transgenic fish line and access to microfluidics technologies.

This protocol describes a method for isolating single cells from zebrafish embryos, enriching for cells of interest, capturing zebrafish cells in microfluidic based single cell multiplex systems, and assessing gene expression from single cells.

בידוד ואפיון של תאים בודדים מעוברים דג הזברה

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Developmental Biology

Screening Sperm for the Rapid Isolation of Germline Edits in Zebrafish

The advent of targeted CRISPR-Cas nuclease technologies has revolutionized the ability to perform precise genome editing in both established and emerging model systems. CRISPR-Cas genome editing systems use a synthetic guide RNA (sgRNA) to target a CRISPR-associated (Cas) endonuclease to specific genomic DNA loci, where the Cas endonuclease generates a double-strand break. The repair of double-strand breaks by intrinsic error-prone mechanisms leads to insertions and/or deletions, disrupting the locus. Alternatively, the inclusion of double-stranded DNA donors or single-stranded DNA oligonucleotides in this process can elicit the inclusion of precise genome edits ranging from single nucleotide polymorphisms to small immunological tags or even large fluorescent protein constructs. However, a major bottleneck in this procedure can be finding and isolating the desired edit in the germline. This protocol outlines a robust method for screening and isolating germline mutations at specific loci in Danio rerio (zebrafish); however, these principles may be adaptable in any model where in vivo sperm collection is possible.

CRISPR-Cas technologies have revolutionized the field of genome editing. However, finding and isolating the desired germline edit remains a major bottleneck. Therefore, this protocol describes a robust method for quickly screening F0 CRISPR-injected zebrafish sperm for germline edits using standard PCR, restriction digest, and gel electrophoresis techniques.

בדיקת זרע לבידוד מהיר של עריכות נבט בדגי זברה

The advent of targeted CRISPR-Cas nuclease technologies has revolutionized the ability to perform precise genome editing in both established and emerging ...

<meta charset="utf8"></head><body>תיוג חלבון פלואורסצנטי בזחלי דג זברה באמצעות CRISPR/Cas9 Knock-In

Fluorescence Labeling to Visualize Low-Expressed Proteins in Zebrafish

CRISPR/Cas9-mediated knock-in (KI) technology allows for easier fluorescent-protein tagging in zebrafish (Danio rerio), a preferred model organism for in vivo imaging due to its transparency during the early developmental stage. Here, we provide a detailed protocol for performing high-efficiency fluorescence gene KI, rapid screening for KI founders, and low-abundance protein tracing in zebrafish larvae, which will lay a critical foundation for subsequent physio-pathological studies in zebrafish. The current protocol includes complete steps for the sgRNA design for the gene of interest, sgRNA in vitro transcription, Cas9 mRNA in vitro transcription, in vivo sgRNA screen for the one with the highest efficiency, donor plasmid design and construction, microinjection in zebrafish larvae, KI founder screen and zebrafish live imaging. Critical steps, troubleshooting tips, quality control methods, and advantages and applications of this protocol are included and discussed. This protocol assures quick and accurate results at a low cost and has been validated by multiple trials.

<meta charset="utf8"></head><body>תיוג פלואורסצנטי להמחשת חלבונים בעלי ביטוי נמוך בדג הזברה

Here, we present a protocol to label proteins with a fluorescence protein tag in zebrafish larvae, a newly developed and modified in vivo system especially useful for visualizing low-abundance proteins in zebrafish.

תיוג פלואורסצנטי להמחשת חלבונים בעלי ביטוי נמוך בדג הזברה

CRISPR/Cas9-mediated knock-in (KI) technology allows for easier fluorescent-protein tagging in zebrafish (Danio rerio), a preferred model organism for in ...

Genotyping and Quantification of In Situ Hybridization Staining in Zebrafish

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in developmental biology for decades. Traditionally, most gene expression studies relied on visual evaluation of the ISH signal, a method that is prone to bias, particularly in cases where sample identities are known a priori. We have previously reported on a method to circumvent this bias and provide a more accurate quantification of ISH signals. Here, we present a simple guide to apply this method to quantify the expression levels of genes of interest in ISH-stained embryos and correlate that with their corresponding genotypes. The method is particularly useful to quantify spatially restricted gene expression signals in samples of mixed genotypes and it provides an unbiased and accurate alternative to the traditional visual scoring methods.

Gene editing technologies have enabled researchers to generate zebrafish mutants to investigate gene function with relative ease. Here, we provide a guide to perform parallel embryo genotyping and quantification of in situ hybridization signals in zebrafish. This unbiased approach provides greater accuracy in phenotypical analyses based on in situ hybridization.

כתמים וכימות של היברידיזציה באתרו בתוך דג זברה

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in ...

Examining Muscle Regeneration in Zebrafish Models of Muscle Disease

Skeletal muscle has a remarkable ability to regenerate following injury, which is driven by obligate tissue resident muscle stem cells. Following injury, the muscle stem cell is activated and undergoes cell proliferation to generate a pool of myoblasts, which subsequently differentiate to form new muscle fibers. In many muscle wasting conditions, including muscular dystrophy and ageing, this process is impaired resulting in the inability of muscle to regenerate. The process of muscle regeneration in zebrafish is highly conserved with mammalian systems providing an excellent system to study muscle stem cell function and regeneration, in muscle wasting conditions such as muscular dystrophy. Here, we present a method to examine muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease. The first step involves the use of a genotyping platform that allows the determination of the genotype of the larvae prior to eliciting an injury. Having determined the genotype, the muscle is injured using a needle stab, following which polarizing light microscopy is used to determine the extent of muscle regeneration. We therefore provide a high throughput pipeline which allows the examination of muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease.

Skeletal muscle regeneration is driven by tissue resident muscle stem cells, which are impaired in many muscle diseases such as muscular dystrophy, and this results in the inability of muscle to regenerate. Here, we describe a protocol that allows the examination of muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease.

בחינת התחדשות שרירים במודלים של דגי זברה של מחלת שרירים

Skeletal muscle has a remarkable ability to regenerate following injury, which is driven by obligate tissue resident muscle stem cells. Following injury, ...

עיבוד תאי מעיים מזחלי דגי זברה לריצוף RNA חד-תאי

Gut Isolation from Zebrafish Larvae for Single-cell RNA Sequencing

The gastrointestinal (GI) tract performs a range of functions essential for life. Congenital defects affecting its development can lead to enteric neuromuscular disorders, highlighting the importance to understand the molecular mechanisms underlying GI development and dysfunction. In this study, we present a method for gut isolation from zebrafish larvae at 5 days post fertilization to obtain live,&#160;viable cells which can be used for single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) analysis. This protocol is based on the manual dissection of the zebrafish intestine, followed by enzymatic dissociation with papain. Subsequently, cells are submitted to fluorescence-activated cell sorting, and viable cells are collected for scRNA-seq. With this method, we were able to successfully identify different intestinal cell types, including epithelial, stromal, blood, muscle, and immune cells, as well as enteric neurons and glia. Therefore, we consider it to be a valuable resource for studying the composition of the GI tract in health and disease, using the zebrafish.

מחבר זרקור: בידוד וניתוח תאי מעיים של זחלי דגי זברה לחקר היבטים שעתוק של התפתחות מערכת העיכול 

Here, we describe a method for gut isolation from zebrafish larvae at 5 days post fertilization, for single-cell RNA sequencing analysis.

מיצוי DNA תפוקה גבוהה, Genotyping של הזחלים דג זברה 3dpf על-ידי המסיכה פין

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

ייצור יעיל והסתרות שנוצרו על-ידי זיהוי של CRISPR/Cas9 ג'ין, מערכת מודל רזבורה rerio

פרופיל תזמון שכפול ה-DNA באמצעות דג זברה כמערכת מודל In Vivo

בידוד ואפיון של תאים בודדים מעוברים דג הזברה

בדיקת זרע לבידוד מהיר של עריכות נבט בדגי זברה

תיוג פלואורסצנטי להמחשת חלבונים בעלי ביטוי נמוך בדג הזברה

תיוג פלואורסצנטי להמחשת חלבונים בעלי ביטוי נמוך בדג הזברה

תיוג פלואורסצנטי להמחשת חלבונים בעלי ביטוי נמוך בדג הזברה

כתמים וכימות של היברידיזציה באתרו בתוך דג זברה

בחינת התחדשות שרירים במודלים של דגי זברה של מחלת שרירים

בידוד מעיים מזחלי דגי זברה לריצוף RNA חד-תאי