Die Autoren möchte die seltene Krankheitsmodelle und Mechanismus (RDMM) Netzwerk (gefördert durch den kanadischen Institute der Gesundheit Forschung (CIHR) und Genom-Kanada) zu danken. CK wird unterstützt durch ein Stipendium UROP (Universität von Ottawa). DLJ wird durch ein Vanier Canada Graduate Stipendium unterstützt. IAP wird von einem kanadischen Institute der Gesundheit Forschung (CIHR) postdoctoral Fellowship Award unterstützt. Die Autoren danken der Genetics Society of America für die Erteilung der Erlaubnis, dieses Protokoll zu veröffentlichen und zu verwenden, eine Anpassung des zusätzliche Abbildung 5 von Pena, Et Al.

Verfahren mit tierische Themen genehmigt worden und sind nach Tierbetreuung Richtlinien zur Verfügung gestellt von der Canadian Council Tier Pflege und der University of Ottawa Tierbetreuung Ausschüsse.
1. Vorbereitung
<ol><li>Bereiten Sie die Dissektion Oberfläche durch Abkleben 9 cm Petrischale Deckel mit Autoklav Band über seine innere Oberfläche. Positionieren Sie es unter dem Stereo-Mikroskop.</li>
	<li>Legen Sie 3 bis 5 Tage nach Befruchtung (Dpf) zebrafischlarven in ein Petri-Schale und in ˜1.5 mM Tricaine in 1 x E3 Embryo Medien (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4, pH 7,2) zu betäuben.</li>
	<li>Zum Jahresende ein P1000 PIPETTENSPITZE mit einem Paar der Schere oder einer Rasierklinge auf einen Durchmesser von 2 mm bis 3 Dpf Larve mit minimalem Stress Platz abgeschnitten.</li>
</ol>2. Fin Clipping von Zebrafischlarven
<ol><li>Einem narkotisierten Larve mit der modifizierten P1000 Mikropipette abholen und legen der Zebrafisch-Larve auf das positionierte Autoklav-Band auf dem Deckel der Petrischale.</li>
	<li>Entfernen Sie überschüssige Tricaine Lösung rund um die Larve mit einer Mikropipette. Das Gebiet sollte so trocken wie möglich, erfolgreich Abschnitt und holen die Flosse aber noch feucht ist, Überleben zu sichern.</li>
	<li>Verwenden ein Mikro Skalpell, Abschnitt der Schwanzflosse unter dem Stereo-Mikroskop, wie in Abbildung 1angezeigt, wie im Wilkinson Et al.16beschrieben. Während die Inzision gelten Sie stetigen Druck innerhalb der Pigment-Baulücke der Schwanzflosse, distale bis an die Grenze der Durchblutung (Abbildung 1A). Üben Sie sanften Druck zur Vermeidung von Schäden der Chorda.</li>
	<li>Visualisieren Sie die geschnittenen Flosse unter dem Mikroskop und positionieren Sie das Stück auf der Spitze der Microscalpel Klinge (Abbildung 2A). Legen Sie die Microscalpel mit der Flosse auf der Oberfläche von einem kleinen Stück Filterpapier. Hinweis: Aufgrund des Vorhandenseins von Melanozyten in der durchtrennten Gewebes ermöglicht diesen Schritt Visualisierung der Finne als kleiner schwarzer Fleck (Abb. 2 b).</li>
	<li>Mit Schere und Pinzette (Abbildung 2), übertragen Sie das Filterpapier mit der Flosse, eine 96-Well-PCR-Platte, enthält 25 μL 50 mM NaOH Lösung pro Bohrloch (Abb. 2D).</li>
	<li>Bereiten Sie eine flach-Boden-96-Well-Platte, Nummerierung des Brunnens nach dem Etikett der PCR Platte. Mit der veränderten P1000 Pipette gefüllt mit 200 µL frische 1 x E3 Embryo Medien, sorgfältig sammeln Sie die Zebrafisch-Larven mit leichtem Druck. Die Larve in der Gewebekultur 96-Well-Platte im gleich gut wie die PCR-Platte (Abb. 2E) Nummer zu verzichten.</li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass das Filterpapier gut in der Lösung (Abbildung 2F) untergetaucht ist. Reinigen Sie die Klinge des Microscapel und Pinzette zwischen jedem Schnitt um Kreuzkontaminationen zu vermeiden durch Eintauchen in 70 % EtOH Lösung. Wischen Sie die Klinge mit sauberem Papier Gewebe/wischen.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 2.1-2.7, bis alle Embryonen abgeschnitten worden.</li>
	<li>Speichern Sie die Larven in 96-Well-Platte bei 28 ° C, bis die Genotypen identifiziert wurden. Hinweis: Der Embryo Medien muss nicht geändert werden, da das Protokoll bequem in weniger als 2 Tagen abgeschlossen werden kann. Wenn mehr Zeit erforderlich ist, empfiehlt sich ein Medienwechsel.</li>
</ol>(3) genomische DNA-Extraktion
<ol><li>Versiegeln Sie die 96-Well-PCR-Platte und Zentrifuge, die die Proben bei 1.000 x g für 1 min um sicherzustellen, dass alle Filterpapiere innerhalb der NaOH-Lösung getaucht werden.</li>
	<li>Erwärmen Sie für Gewebe Lyse die Proben in einem Thermocycler bei 95 ° C für 5 min, gefolgt von Kühlung auf 4 ° C für 10 min.</li>
	<li>Fügen Sie 6 μL von 500 mM Tris-HCl, pH 8.0 zu jeder Probe. Vortex.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie kurz die Platte bei 1.500 x g für 5 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Verwenden Sie 1,5 μl des Überstands DNA pro PCR-Reaktion.</li>
	<li>Bereiten Sie einer PCR Genotyp der Larven, wie in Tabelle 1-2. Hinweis: Dieses Protokoll wurde für zwei Anwendungen getestet: multiplex-PCR-Reaktionen enthüllt den Genotyp mit Agarose Gele9und Heteroduplex schmelzen Assay (HMA) enthüllt die Genotypen mit Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (PAGE)17.</li>
</ol>4. alternative genomische Extraktion mittels eine Komplexbildner Harz
<ol><li>Komplette Schritt 2.5 indem Filterpapier mit beschnittenen Fin zu einer 96-Well-PCR-Platte mit 30 μl 5 % chelatisierenden Harz (Styrol-Divinylbenzene-Copolymeren mit gekoppelten Iminodiacetate-Ionen). Hinweis: Diese Art des Harzes wird häufig für Gewebe-Lyse und Vorbereitung von PCR-Ready DNA in eine schnelle und effiziente Weise18verwendet.</li>
	<li>Führen Sie die Schritte 2.6-2.8, wie angegeben.</li>
	<li>Verschließen Sie die 96-Well-PCR-Platte und kurz Zentrifugieren Sie die Proben um sicherzustellen, dass alle Filterpapier innerhalb der Komplexbildner Harz eingetaucht ist.</li>
	<li>Erwärmen Sie für Gewebe Lyse die Proben in einem Thermocycler bei 95 ° C für 15 min, gefolgt von Kühlung auf 4 ° C für 10 min. Hinweis: In diesem Schritt können Lyse und anschließende Bindung von polar harzkügelchen, zellulären Komponenten, während DNA und RNA in Lösung bleiben.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie kurz die Proben um die harzkügelchen pellet und die DNA in der Suspension zu erhalten.</li>
	<li>Führen Sie die Schritte 3,5-3,6, Genotypisierung Verfahren abzuschließen.</li>
</ol>5. Anwendung 1: Multiplex-PCR, gefolgt von Agarose-Gel-Analyse
<ol><li>Nach Tabelle 1, Einrichten einer Multiplex-PCR-Reaktion ermöglicht die Unterscheidung zwischen reinerbigen Mutanten, Heterozygote und WT-Larven. Verwenden einer 96-Well-Thermocycler, PCR-Reaktionen mit den Radsport in Tabelle 3beschriebenen Bedingungen durchzuführen. Hinweis: Die PCR-Reaktionen können auch in jeder anderen konventionellen PCR Thermocycler durchgeführt werden. Dieses Beispiel beschreibt die PCR-Strategie von Pena, Et Al. verwendet 9 , aldh7a1 WT und 5-bp Einfügung mutierten Allele in der gleichen Multiplex-Reaktion zu identifizieren.</li>
	<li>Bereiten Sie eine 1 % Agarosegel in Natrium-Borat-Puffer, befleckt mit 1 X GelRed. Hinweis: 20 x Natrium-Borat ausgleichslagers 40 mL 10 M NaOH, 1800 mL DdH2O, pH 8,5 mit 76 g Borsäure angepasst und anschließend zu 2 L Endvolumen mit DdH2O. besteht aus</li>
	<li>Führen Sie das Gel in 1 X Natrium-Borat-Puffer für 15 min bei 250 V. Um den Prozess zu erleichtern, verwenden Sie nach Möglichkeit ein Gel-System, das kompatibel mit Multichannel-mehrkanalpipette zu höheren Durchsatz ermöglichen durch die Reduzierung der Zeit zum Proben zu laden ist.</li>
	<li>Bild das Gel unter ultraviolettem (UV) Licht um Diskriminierung der verschiedenen Genotypen zu ermöglichen.</li>
</ol>6. Anwendung 2: Heteroduplex schmelzen Assay
<ol><li>Bereiten Sie Seite 12 % Gele mit 1,5 mm Spacer Platte und die 15-Proben Kämme. Bereiten Sie zwei Seite-Gele mit 12,21 mL DdH2O, 2,52 mL 10 x Tris/Borat/EDTA (TBE), 10 mL 30 % Acrylamid, 250 μl 10 % Ammonium Bleichen (APS) und 20 μL der Tetramethylethylenediamine (TEMED). Verwenden Sie 1 X TBE-Puffer (0,089 M Tris-HCl, 0,089 M Borsäure und 0,002 M Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA)) als Puffer ausgeführt.</li>
	<li>Erhitzen Sie die PCR-Produkte bei 94 ° C für 5 min.</li>
	<li>Cool die Rohre auf Eis oder in den Thermocycler für 10 min bei 4 ° C.</li>
	<li>Last 10 μL pro PCR Probe und 8 μl Molekulargewicht Marker.</li>
	<li>Führen Sie die Seite 150 V 1 x TBE mit einem vertikalen Elektrophorese-System für 1 h oder bis das Molekulargewicht Marker fast erreicht die Linie der Glasplatte.</li>
	<li>Bild das Gel unter UV-Licht zur Diskriminierung der verschiedenen Genotypen zu ermöglichen.</li>
</ol>

<ol><li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), (2013).</li>
<li>Stewart, A. M., Kalueff, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+better+and+more+valid+animal+models+of+brain+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Behav+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Developing better and more valid animal models of brain disorders.</a> Behav Brain Res. 276, 28-31 (2015).</li>
<li>Grone, B. P., Baraban, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+in+epilepsy+research%3A+legacies+and+new+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Animal models in epilepsy research: legacies and new directions.</a> Nat Neurosci. 18 (3), 339-343 (2015).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+Zebrafish+Embryos+to+Analyze+Gene+Function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function.</a> J Vis Exp. (25), e1115(2009).</li>
<li>Doyon, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heritable+targeted+gene+disruption+in+zebrafish+using+designed+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Heritable targeted gene disruption in zebrafish using designed zinc-finger nucleases.</a> Nat Biotechnol. 26 (6), 702-708 (2008).</li>
<li>Bedell, V. M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3491146/">In vivo Genome Editing Using High Efficieny TALENs.</a> Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).</li>
<li>Sander, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+disruption+in+somatic+zebrafish+cells+using+engineered+TALENs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs.</a> Nat Biotechnol. 29 (8), 697-698 (2012).</li>
<li>Hwang, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+genome+editing+in+zebrafish+using+a+CRISPR-Cas+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system.</a> Nat Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).</li>
<li>Pena, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyridoxine-Dependent+Epilepsy+in+Zebrafish+Caused+by+Aldh7a1+Deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Pyridoxine-Dependent Epilepsy in Zebrafish Caused by Aldh7a1 Deficiency.</a> Genetics. 207, 1501-1518 (2017).</li>
<li>Baraban, S. C., Dinday, M. T., Hortopan, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+screening+in+Scn1a+zebrafish+mutant+identifies+clemizole+as+a+potential+Dravet+syndrome+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Drug screening in Scn1a zebrafish mutant identifies clemizole as a potential Dravet syndrome treatment.</a> Nat Commun. 4, 2410(2013).</li>
<li>Godoy, R., Noble, S., Yoon, K., Anisman, H., Ekker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemogenetic+ablation+of+dopaminergic+neurons+leads+to+transient+locomotor+impairments+in+zebrafish+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Chemogenetic ablation of dopaminergic neurons leads to transient locomotor impairments in zebrafish larvae.</a> J Neurochem. 135, 249-260 (2015).</li>
<li>Scheldeman, C., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28888969">Neurobiology of Disease mTOR-related neuropathology in mutant tsc2 zebra fish Phenotypic, transcriptomic and pharmacological analysis.</a> Neurobiol Dis. 108 (September), 225-237 (2017).</li>
<li>Zabinyakov, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+first+knock-out+aldh7a1+zebrafish+model+for+pyridoxine-dependent+epilepsy+using+CRISPR-Cas9+technology%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Characterization of the first knock-out aldh7a1 zebrafish model for pyridoxine-dependent epilepsy using CRISPR-Cas9 technology.</a> PLoS One. 12 (10), 1-14 (2017).</li>
<li>Grone, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epilepsy%2C+behavioral+abnormalities%2C+and+physiological+comorbidities+in+syntaxin-binding+protein+1+%28STXBP1%29+mutant+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Epilepsy, behavioral abnormalities, and physiological comorbidities in syntaxin-binding protein 1 (STXBP1) mutant zebrafish.</a> PLoS One. 11 (3), (2016).</li>
<li>Kawakami, K., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+identification+of+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Rapid identification of transgenic zebrafish.</a> Trends Genet. 12 (1), 9-10 (1996).</li>
<li>Wilkinson, R. N., Elworthy, S., Ingham, P. W., van Eeden, F. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+high-throughput+PCR-based+genotyping+of+larval+zebrafish+tail+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">A method for high-throughput PCR-based genotyping of larval zebrafish tail biopsies.</a> Biotechniques. 55 (6), 314-316 (2013).</li>
<li>Zhu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+genotyping+method+for+genome-modified+animals+and+human+cells+generated+with+CRISPR%2FCas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">An efficient genotyping method for genome-modified animals and human cells generated with CRISPR/Cas9 system.</a> Sci Rep. 4, 6420(2014).</li>
<li>Walsh, P. S., Metzger, D. A., Higuchi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chelex+100+as+a+medium+for+simple+extraction+of+DNA+for+PCR-based+typing+from+forensic+material%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material.</a> Biotechniques. 54 (3), 506-513 (2013).</li>
<li>Ewing, B., Green, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basecalling+of+automated+sequencer+traces+using+phred.+II.+Error+probabilities%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Basecalling of automated sequencer traces using phred. II. Error probabilities.</a> Genome Res. 8, 175-185 (1998).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Gen Bearbeitungstools beschäftigt waren einzuführen genau Mutationen und transgene im Zebrafisch in den letzten Jahren5,6,7,8. Wenn Sie Krankheit Modellierung im Zebrafisch durchführen, sind frühe Larven- oder juvenile Phänotypen oft9,12,13,14beobachtet. Die hier vorgestellten Protokoll beschreibt die Extraktion von PCR-Ready DNA aus kleinen Zebrafisch Larven Schweif Biopsien, Genotypisierung von Larven im Alter von 3 Dpf ermöglichen. Früherkennung von Genotypen ist entscheidend für verschiedene Anwendungen im Labor, vor allem, wenn post Hoc Genotyp nicht möglich9. Genotypen von einem frühen Alter wissen erleichtert auch überleben Studien und phänotypische Analyse der Mutanten. Dieses Protokoll eignet sich auch besonders für die Aufnahme von Larven der spezifische Genotypen zur Reife. Larval Genotypisierung ist noch nicht weit verbreitet im Zebrafisch-Labors auf der ganzen Welt und dieses Protokoll zielt darauf ab, die Verbreitung dieser Technik zu erleichtern. Während die durchtrennten flossen zu manipulieren, bietet die Verwendung dieser Methode Vertrauen, das Vorhandensein von DNA in der Probe; die Fin-Biopsie kann ohne weiteres als einen dunklen Fleck auf dem Filterpapier in den Abfertigungsprozess visualisiert werden. Dies stellt eine wichtige Verbesserung des Protokolls von Wilkinson Et Al. veröffentlicht 16.
Mehrere wichtige Schritte im Rahmen des Protokolls sind korrekt einzuhalten, um qualitativ hochwertige Ergebnisse zu erhalten. Zuallererst muss die Durchtrennung der Larven Flosse in der Pigment-Lücke, distale bis an die Grenze der Durchblutung, um Blutungen zu vermeiden auftreten. Dies sichert das Überleben der Larven während der Fin-Biopsie. Darüber hinaus muss ein schwarzer Punkt auf dem Filterpapier, markieren die Platzierung der Flosse beobachtet werden, vor dem Einlegen des Filterpapiers in die NaOH-Lösung. Dies sichert das Vorhandensein von Fin Gewebe (und somit DNA) in jeder Probe gut. Das Filterpapier muss auch innerhalb der NaOH-Lösung Zelle Lysis und erfolgreiche DNA-Extraktion garantieren eingetaucht werden. Dieses Protokoll wurde für jüngere Altersgruppen als 3 Dpf nicht getestet, da nur geschlüpfte Larven verwendet wurden. Genotyp jüngere Embryonen (ungeschlüpfte < 3 Dpf) Chorion Entfernung erforderlich wären. Für den Fall, dass nicht genügend PCR Verstärkung auftritt, sollte standard PCR Optimierungsstrategien angewendet (z. B. unterschiedliche Grundierung Konzentration, Glühen, Temperatur und/oder DNA-Konzentration). Obwohl genügend DNA extrahiert wird, um verschiedene Arten von PCR-Reaktionen (wie beispielsweise aldh7a1 und Plpbp Genotypisierung) erfolgreich durchzuführen, ist die Konzentration von DNA erhalten Fin Clipping folgt klein (~ 5 ng/µL pro Probe) und somit Erhöhung der Konzentration von DNA in der PCR-Reaktion für mehr Erfolg der Verstärkung gestatten.
Die Larven Fin DNA extrahiert mit diesem Protokoll einsetzbar für mehrere Amplifikationen, genaue Identifikation von Larven Zebrafisch Genotypen und in gewissem Sinne Hochdurchsatz-ermöglicht. Ein Heteroduplex schmelzen Assay in Seite Gele kann verwendet werden, um verschiedene Mutationen17zu identifizieren. Angesichts der Tatsache, dass ~ 30 μl DNA sich pro Probe ergibt, und ~ 1-1,5 μl DNA pro PCR-Reaktion verwendet wird, können rund 30 PCR-Reaktionen pro extrahierten Probe ausgeführt werden. Die PCR-Produkte eignen sich auch für Sanger-Sequenzierung-Anwendungen; hoher Qualität der Lesevorgänge wurden erhalten, ermöglicht genaue Bestätigung des WT und homozygot mutierten Sequenzen für aldh7a1. Genomische DNA-Extraktion aus Larven Zebrafisch hat viele Anwendungen in der Forschung. Das ursprüngliche Ziel bei der Entwicklung dieses Protokolls war effektiv Genotyp Larven, die Erwachsenenalter durch spezifische Mutationen in den aldh7a19nicht erreichen können. Darüber hinaus ermöglicht dieses Protokoll die Segregation von Genotypen und die Beobachtung der Epilepsie verbundenen Phänotypen speziell in aldh7a1- / - Fisch aus dem Larvenstadium Weiterreise9. Die Bündelung der Larven von jeder Genotyp für Ansätze z. B. RNA-Extraktion oder Metabolit Extraktion kann genau nach Genotypisierung mit dieser Larven Fin clipping Verfahren9ausgeführt werden. Zusammenfassend können ein erfahrener Ermittler nach kurzer Ausbildung dieses einfache und zeitsparende Protokoll erfordert nur minimale und kostengünstige Reagenzien, regelmäßig hunderte von Fin Clips pro Tag durchführen. Die Verwendung dieses Protokolls ermöglicht die Erforschung von Pena Et Al. beschrieben und wird hoffentlich einen ähnlichen Zweck dienen, für die Allgemeinheit Zebrafisch.

Der Zebrabärbling (Danio Rerio) ist ein fest gefügten Organismus verbreitet als Modell für die Untersuchung der Krankheit sowie für präklinische Tests von therapeutische Hypothesen1,2,3. Diese Tiere haben eine kurze Generationszeit, sind leicht zu verarbeiten, zeigen eine hohe Fortpflanzungsrate, low-cost und genetische Manipulationen durch Mikroinjektion von DNA in Embryonen4leicht zugänglich sind. Durch die zunehmende Entwicklung neuartiger transgener und gen Bearbeitung Technologien wie Zinkfinger-Nukleasen (ZFN)5, TAL-wie Effektor Nukleasen (TALENs)6,7, und die gruppierten regelmäßig dazwischen kurz Palindromische wiederholt (CRISPR) / CRISPR-assoziierten 9 (Cas9) System8, dem Zebrafisch wird balanciert, um das Verständnis der verschiedenen pathologischen Bedingungen wesentlich zu verbessern. Diese Technologien wurden verwendet, um gezielte Knockouts in beiden somatische erstellen und Keimbahnzellen im Zebrafisch, effizient erzeugt genetisch modifiziert Tiere8. Jüngste Beispiele in der Literatur sind die erfolgreiche Entwicklung von genetischen Modellen von Epilepsie und Stoffwechselstörungen im Zebrafisch3,9,10,11,12 .
Mit den Fortschritten im Zebrafish Genom-Bearbeitung ist schnelle und zuverlässige Genotypisierung eine unbestreitbare Bandbreitenbegrenzung Schritt geworden. Identifizierung von spezifischen DNA-Mutationen angrenzend an den vorhergesagten Erbgut Bearbeitung Zielstandort ist eine wichtige Etappe des Protokolls. Traditionell, sind Genotypisierung Techniken von Fin Clipping in der Regel nur bei Jugendlichen oder Erwachsenen Zebrafisch. Aber der Zeitaufwand erhöhen Zebrafisch bis zum Erwachsenenalter (> 2 Monate) Fortschritte in der Forschung erheblich verzögert. In vielen Fällen kann durch den Knockout der wesentlichen Gene (z. B. in der Krankheit Modellierung) oder Gain-of-Function-Mutationen führen zu schädlichen phänotypischen Auswirkungen Erwachsenenalter erreicht werden. Darüber hinaus mehrere Assays erfordern, Bündelung von Larven, z. B. in RNA oder Metaboliten Extraktion und beinhalten damit vorherige Identifizierung der Genotypen, die schwierig sein kann, wenn nur post-Hoc Genotyping Techniken verfügbar sind. Diese genannten Beispiele unterstreichen die Bedeutung der Larven Genotypisierung Techniken die zur gleichen Zeit präzise und vollständige Genesung und die normale Entwicklung der Larven zu ermöglichen. Frühen Stadium Zebrafisch Genotypisierung scheinen derzeit nicht am meisten benutzt sein; Dies spiegelt sich durch aktuelle Publikationen der Krankheitsmodelle in denen Larven Genotypen über Post-Mortem-Genotypisierung anstatt Genotypisierung vor der Ausführung des Experiments12,13,14identifiziert werden. In diesem Papier ist eine Larven Fin Clip Strategie vorgestellt, mit dem Ziel, vorher festgelegten Genotypisierung Verfahren zu verbessern.
In der Vergangenheit Leben Strategien beschäftigen Proteinase K-Verdauung, Genotyp Zebrafisch, die Larven zu Variablen Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Effizienz15geführt haben. Obwohl mehr vor kurzem mikroskopische Schweif Biopsie Technik zur Verfügung gestellt viel versprechende Ergebnisse16veröffentlicht, waren wir und andere Gruppen nicht in der Lage, die hohe Effizienz und DNA Wiederherstellung berichtet von den Autoren zu reproduzieren. Ein schwerer Rückschlag des Protokolls von Wilkinson Et Al. beschrieben 16 kann die Übertragung des Gewebes Heck mit dem PCR-Rohr. Aufgrund seiner mikroskopischen Größe ist es hart, um sicherzustellen, dass die Flosse wurde ordnungsgemäß gesammelt und durch pipettieren verzichtet. Um diese Barriere zu begegnen, haben wir eine verbesserte Protokoll für die Genotypisierung zahlreicher live zebrafischlarven mit fast 100 % Wirkungsgrad9entwickelt. Mit einer Microscalpel, die Fin Schwanzspitze entfernt und auf ein Stück Filterpapier gelegt. Das Stück Filterpapier mit dem Gewebe kann leicht visualisiert und in ein PCR-Röhrchen korrekt platziert. Genomische DNA-Extraktion erfolgt dann, gefolgt von PCR-Amplifikation der Region von Interesse zum Genotyp der Probe. Die Vorteile dieser Methode sind eine hohe Effizienz der PCR, einer niedrige false-positive-Rate und eine niedrige Sterblichkeitsrate. Darüber hinaus ist die Genotypisierung einer großen Anzahl von Embryonen möglich unter Verwendung dieses Protokolls. Die hier beschriebene Protokoll ermöglicht Fin-Clipping von Hunderten von Larven innerhalb von 2-3 Stunden mit diesem Ansatz und korrekte Identifizierung der genotypisiert Fisch und Schweif Regeneration innerhalb von zwei Tagen.

<table><tbody><tr><td>Petri dish</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>Microscalpel</td><td>World Precision Instruments</td><td>500249</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ1500</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine/Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>96-well Tissue-culture plate</td><td>Costar</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>96-well PCR plate</td><td>Fisher</td><td>14230232</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher</td><td>S25548A&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tris base&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>5% Chelex 100 sodium form</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7901</td><td></td></tr><tr><td>GelRed 1x</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td></td></tr><tr><td>Boric Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6768</td><td></td></tr><tr><td>Sub-Cell Model 192 system</td><td>Bio-Rad&amp;nbsp;</td><td>1704508</td><td></td></tr><tr><td>30 % Acrylamide/Bis Solution, 37.5: 1</td><td>Bio-Rad&amp;nbsp;</td><td>1610158</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq Green Master Mix, 2X</td><td>Promega</td><td>M7123</td><td></td></tr><tr><td>paper wipes (Kimwipes&amp;reg; disposable wipers)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z188956</td><td></td></tr><tr><td>1kb-plus molecylar weight marker&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM1343</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease free water&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W4502</td><td></td></tr><tr><td>Sub-Cell Model 192 system (high-throughput agarose gel system)</td><td>Bio-Rad&amp;nbsp;</td><td>1704508</td><td></td></tr><tr><td>vertical gel electrophoresis system Mini-PROTEAN Tetra Cell&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad&amp;nbsp;</td><td>1658004</td><td></td></tr></tbody></table>

high-throughput dna extraction and genotyping of 3dpf zebrafish larvae by fin clipping

Zebrafisch (Danio Rerio) besitzen Orthologe 84 % der Gene bekannt, um menschliche Krankheiten zugeordnet werden. Darüber hinaus diese Tiere haben eine kurze Generationszeit, sind leicht zu verarbeiten, zeigen eine hohe Fortpflanzungsrate, low-cost, und sind leicht zugänglich, genetische Manipulationen durch Mikroinjektion von DNA in Embryonen. Die jüngsten Fortschritte im Gen Bearbeitungstools ermöglichen präzise Einführung von Mutationen und transgene im Zebrafisch. Erkrankung oft im Zebrafisch Modellierung führt zu Larven Phänotypen und frühen Tod die schwierig sein kann, um zu interpretieren, wenn Genotypen unbekannt sind. Diese Früherkennung von Genotypen ist auch im Experimente erfordern Probe zu bündeln, wie z. B. Gen Ausdruck oder Mass Spectrometry Studien. Jedoch wird umfangreiche genotypischen Screening von den traditionellen Methoden begrenzt, die in den meisten Labors nur auf Erwachsene Zebrafisch oder im Post-mortem Larven durchgeführt werden. Wir haben dieses Problem durch Anpassung eine Methode zur Isolierung von PCR-Ready genomische DNA aus live zebrafischlarven, die so früh wie 72 h nach Befruchtung (hpf) erreicht werden kann. Diese Zeit- und kostengünstige Technik, verbesserte sich von einer zuvor veröffentlichten Genotypisierung-Protokoll ermöglicht die Identifikation von Genotypen aus mikroskopischen Fin Biopsien. Die Flossen regenerieren schnell wie die Larven entwickeln. Forscher können dann auswählen und die gewünschte Genotypen bis zum Erwachsenenalter durch die Nutzung dieser Hochdurchsatz-PCR-basierten Genotypisierung Verfahren zu erhöhen.

Die Effizienz des Protokolls zeigte sich durch Genotypisierung der Nachzucht von einem heterozygoten Kreuz (aldh7a1+ / ot100, hier dargestellt als aldh7a1+ /-) ()Abbildung 3A- C)9. Die aldh7a1ot100mutierten Allels hat eine 5-Basenpaaren (bp) Einfügung in die ersten kodierenden Exon der Zebrafisch- aldh7a1 -Gens, das führt zu Frameshift und Verlust der Funktion aufgrund einer frühen Stopp-Codon9. Vier Grundierungen dienten in einer Multiplex-Reaktion zu drei markanten Bands, WT, heterozygot (aldh7a1+ /-) und homozygoten Mutante (aldh7a1- / -) Genotypen zu unterscheiden (von Pena, Et Al. 9): Gen1_FW 5'-ATGATGCAGCGCGTGCTGAC-3 ","Gen2_RV": 5' - CCCTTTGAACCTCACAGGAGTT-3", "5 nt-ins-Specific_FW": 5'-TGTTTTCAACGGTTCAACGG-3 ", und"WT-Specific_RV": 5'-TCCCTGTCCTCCCCAAGAAC-3"). Die Verstärkung der beiden Allele mit Primer Gen1_FW und Gen1_RV führte zu einem 434 bp Amplikons. 293-bp Band entstand aus spezifische Verstärkung des mutierten Allels, und eine 195-bp-Band wurde speziell für das WT-Allel erhalten, wie in Abbildung 3Agezeigt. Nach PCR, 8 µL jeweils 20 µL Reaktionsvolumen wurde auf einem 1 % Agarose/Natrium-Borat-Gel, analysiert, wie in Abbildung 3 bgezeigt. Ausreichend Larven DNA wurde erholte sich von 98 % (n = 576) der Proben, was zu einer hohen Rate der PCR-Effizienz. DNA-Extraktion mit der NaOH-Technik erhält durchschnittlich 4,7 0,5 ng/µL DNA-Larven pro Probe nach dem Fin-Biopsie-Verfahren in ~ 30 µL Volumen. DNA-Extraktion mit Komplexbildnern Harz ergibt sich eine ähnliche Rendite durchschnittlich 3,8 0,5 ng/µL DNA pro Probe. Diese Menge an DNA gesammelt von Larven Fin Transections erzeugt PCR-Ready genomischen DNA von ausreichender Qualität, um die Identifizierung von Genotypen zu ermöglichen. Jede DNA-Probe kann in ˜30 PCR Amplifikationen verwendet werden. Amplifikationsprodukte erhalten mit Primer Gen1_FW und Gen2_RV auch Sequenzierung Anwendungen9, einsetzbar für die 5-bp-Einfügung in den reinerbigen Mutanten (aldh7a1- / -) (Abbildung 3 erfolgreich identifiziert ). Sanger Sequenzierung erfolgte über einen externen Dienstleister zu testen, ob die PCR-Produkte für diese Anwendung geeignet waren. DNA-Proben von Agarose-Gel bestätigt reinerbigen Mutanten und WTs (n = 3 Stück) wurden verwendet. Phred19 Highscores (> 30) stammen, hochwertige liest, mit Ausnahme der ersten und letzten 40 Basenpaare angibt.
Dieses Protokoll wurde in der Folge zu Genotyp verschiedene andere Zebrafisch-Mutationen von Heteroduplex schmelzen Analyse verwendet. Die Plpbpot101 und Plpbpot102 mutierten Allelen des Plpbp -Gens (Abb. 4A-D) jedes führen zu einer Frameshift und frühen Stopp-Codon. Um Plpbpzu identifizieren-null zebrafischlarven, zwei Primer wurden verwendet, um die ersten kodierenden Exon einschließlich der Mutation Website zu verstärken (Plpbp-F 5'-GCACTCTGGCTATGTGGAGA-3 "und Plpbp-R 5'-AGCTGTCACTCATCCCTCGT-3"). Die Verstärkung des Plpbp Fragments in WT Tiere führt ein 272-bp Amplifikate (Homoduplex). Der Amplifikate gewonnenen Plpbpot101 (4-bp Löschung Allel, Abbildung 4) besteht aus einem Fragment von 268-bp und der Plpbpot102 (5bp-Substitution, 2-bp Löschung Allel, Abbildung 4), 270-bp, wie in Abbildung 4A-Bzu sehen. Nach Denaturierung und Glühen würde der PCR-Fragmente von heterozygote Tiere Heteroduplex und Homoduplex DNA17enthalten. Homoduplex und Heteroduplex Bands können leicht getrennt werden und mit Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) visualisiert. Das Vorhandensein von einem offenen Winkel zwischen abgestimmt und nicht übereinstimmende DNA-Stränge verursacht durch unvollkommene Glühen durch das Auftreten von Mutationen verursachen Heteroduplex DNA, deutlich langsamer als Homoduplex DNA-17zu migrieren. Unterschiedliche Migrationsmuster entstehen durch unterschiedliche Mutationen. Die heterozygoten Genotypen (Plpbp+ / ot101, Plpbp+ / ot102) würde daher Heteroduplex DNA-Fragmente, als auch das Compound-heterozygot (Plpbpot101/ot102) (Abbildung anzeigen 4a-B). Präzise Genotypisierung ergibt sich durch diese Heteroduplex Assay schmelzen, wie ein einzigartiges Seite Muster sich für jeden Genotyp ergibt und unterschiedliche heterozygote Mutationen visualisiert werden (Abbildung 4A-B). Reinerbige Mutanten würde eine Homoduplex Muster in die Seite Gel anzeigen und daher WTs nicht zu unterscheiden. Um diesen Genotypen zu unterscheiden, sollte eine weitere Runde der Seite Gel Analysen in die PCR-Produkte von WT Allele müssen mit den Proben untersucht werden, vermischt werden, wie an anderer Stelle17beschrieben durchgeführt werden.
Etwa 90 % (88/98) von WT und heterozygot Embryonen wurden erfolgreich bis zum Erwachsenenalter erhöht (> 2 Monate). Wie aldh7a1 und Plpbp der Verlustfunktion Mutanten, die einen frühen Tod Phänotyp anzeigen, konnte unbehandelte Tieren nicht bis zum Erwachsenenalter erhöht werden. Allerdings waren die Genotypen von allen Überlebenden WT und heterozygot Erwachsenen identisch mit Larven Fin Clipping Ergebnissen, zeigt eine 100 % Trefferquote für die Identifizierung von Genotypen mit dem Larvenstadium Fin-Biopsie-Verfahren.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58024/58024fig1.jpg"> Abbildung 1: Larval Fin Clip. (A). nicht durchtrennt Larven Fin an drei Tagen nach Befruchtung (Dpf). Die Linie stellt die Website der Durchtrennung, befindet sich in der Pigment-Lücke. Die schwarze Pfeilspitze zeigt die Grenze der kaudalen Durchblutung. (B). Larve folgenden fin Clipping Verfahren bei 3 Dpf. (C). Larven Zebrafisch Fin nachwachsen auf 5 Dpf. FIN-Regeneration von einer blastemal Formation ist nur 2 Tage nach dem Fin Durchtrennung beobachtet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58024/58024fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58024/58024fig2.jpg"> Abbildung 2: Verfahren für Larven Fin Clipping. (A). die Larven befinden sich auf dem Band und überschüssige Embryonen Medium entfernt. Unter dem Mikroskop ist die Flosse in den Bereich des Spaltes Pigment durchtrennten wie in Figur 1Adargestellt. Mit einer Microscalpel, die Flosse gesammelt und auf ein Filterpapier gelegt Oberfläche einfach durch Berührung (B), und kann ohne weiteres als ein schwarzer Fleck sichtbar gemacht. Halten Sie das Stück Filterpapier mit der Flosse und schneiden Sie ein kleines Quadrat, rund um die gewünschte Region (C). Legen Sie das kleine Stück Filterpapier mit der Flosse in einen Brunnen von einer 96-well-Platte (D). Die entsprechenden Larve sollte in das entsprechende gut von einem flach-Boden-96-Well-Platte in 200 µL der Embryo Medien (E) platziert werden. Das Stück Filterpapier darf in der Lyse-Lösung (F) in Wasser getaucht werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58024/58024fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58024/58024fig3.jpg"> Abbildung 3. Genotypisierung von aldh7a1 heterozygot Flanke von Larven Fin Biopsien. (A). Erwartete Ergebnis Verstärkung des WT und aldh7a1ot100 Allele in einem 434 bp Amplikons führt. 293-bp Band entsteht durch Verstärkung des mutierten Allels (aldh7a1ot100, 5-bp Insertion), und eine 195-bp-Band ergibt sich für das WT-Allel. (B). Beispiel PCR Verstärkung von aldh7a1 Larven Fin Gewebe. Bahn 7 zeigt ein 1 kb Molekulargewicht Marker. Bahnen 1 bis 6 stehen für eine single-Fin-Biopsie. PCR-Ergebnisse ermitteln aldh7a1- / - (aldh7a1ot100/ot100) Genotypen (Spur 1), aldh7a1+ / heterozygote Genotypen (aldh7a1+ / ot100) (Bahnen 3, 4 und 5) und () WT aldh7a1+ / +) Genotypen (Bahnen 2 und 6). (C). Ausrichtung zwischen der sequenzierten WT und aldh7a1ot100 Allel zeigt die Position der Mutation 5-bp einsetzen. Diese Zahl wurde von den ergänzenden Abbildung 5 der Pena Et Al. angepasst. 9 mit Erlaubnis von der Genetics Society of America. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58024/58024fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58024/58024fig4.jpg"> Abbildung 4. Genotypisierung von Plpbp compound heterozygot (2 bp Löschung 4 bp Deletion) von Larven Fin Biopsien. (A). Erwartete Ergebnis wo Verstärkung des WT-Allels in einer 272-bp Amplikons geführt. Das 4-bp Löschung Allel (Plpbpot101) und die 5-bp-Substitution mit 2-bp Löschung Allel (Plpbpot102) produzieren bzw. Amplikons Längen von 268-bp und 270-bp. Ein Heteroduplex wird zwischen einem WT-Allel und die mutierten Allels in ein heterozygoter Genotyp (Plpbp+ /-) gebildet. Bildung von Heteroduplex durch unpassende Allele verursacht Retardierung der Band innerhalb des Gels im Vergleich zu den WT-Homoduplex. (B). PCR Verstärkung aus Larven Fin Ausschnitte der Nachkommen von einer Plpbp+ / ot101X plpbp+ / ot102 überqueren. 1 kb Molekulargewicht Marker ist in Spur 1 gezeigt. 2-10 Bahnen vertreten eine single-Fin-Biopsie. PCR-Ergebnisse identifizieren mutierte Genotypen (Plpbp-null compound heterozygot Plpbpot101/ot102, Spuren 2, 4 und 8), Heterozygote Genotypen (Bahnen 3, 6, 7, 9 und 10) und WT Genotypen (Bahn 5). (C). Ausrichtung zwischen der sequenzierten WT und Plpbpot101 Allel zeigt die Position des 4-bp Deletion-Mutation. (D). Ausrichtung zwischen der sequenzierten WT und Plpbpot102 Allel zeigt die Position des 2-bp-Löschung und 5-bp-Substitution (Fett). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58024/58024fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Komponenten</td>
			<td>20 μl Reaktion</td>
			<td>100 Reaktionen</td>
			<td>Endgültige Konz.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nuklease-freie H2O</td>
			<td>7,45 ΜL</td>
			<td>745 ΜL</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Go-Taq 2 x (Promega, M7122)</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>1000 ΜL</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primer Gen1_FW</td>
			<td>0,25 ΜL</td>
			<td>25 ΜL</td>
			<td>0,125 ΜM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primer 5 nt-ins-specific_FW</td>
			<td>0,3 ΜL</td>
			<td>30 ΜL</td>
			<td>0,15 ΜM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primer Gen2_RV</td>
			<td>0,25 ΜL</td>
			<td>25 ΜL</td>
			<td>0,125 ΜM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Grundierung WT-specific_RV</td>
			<td>0,25 ΜL</td>
			<td>25 ΜL</td>
			<td>0,125 ΜM</td>
		</tr>
<tr>
<td>DNA</td>
			<td>1,5 ΜL</td>
			<td>--</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1. Reaktionsbedingungen für Multiplex PCR für verwendet die aldh7a1 Allel in diesem Protokoll. Die Primer verwendet werden wie folgt: Gen1_FW-5' - ATGATGCAGCGCGTGCTGAC - 3', "Gen2_RV": 5' - CCCTTTGAACCTCACAGGAGTT-3 ","5 nt-ins-Specific_FW": 5'-TGTTTTCAACGGTTCAACGG-3", und "WT-Specific_RV": 5'-TCCCTGTCCTCCCCAAGAAC-3 ". Primer-Bestände wurden 10 µM.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Komponenten</td>
			<td>13 μl Reaktion</td>
			<td>100 Reaktionen</td>
			<td>Endgültige Konz.</td>
		</tr>
<tr>
<td>H2O</td>
			<td>3.25 ΜL</td>
			<td>325 ΜL</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Go-Taq 2 x (Promega, M7122)</td>
			<td>6.25 ΜL</td>
			<td>625 ΜL</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Grundierung FW</td>
			<td>1 ΜL</td>
			<td>100 ΜL</td>
			<td>0.77 ΜM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Grundierung RV</td>
			<td>1 ΜL</td>
			<td>100 ΜL</td>
			<td>0.77 ΜM</td>
		</tr>
<tr>
<td>DNA</td>
			<td>1,5 ΜL</td>
			<td>--</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 2: Reaktionsbedingungen für die PCR verwendet für Plpbp Allel in diesem Protokoll. Der forward Primer verwendet wurde PLPBP-F 5'-GCACTCTGGCTATGTGGAGA-3 "und die umgekehrte, PLPBP-R 5'-AGCTGTCACTCATCCCTCGT-3". Primer-Bestände wurden 10 µM.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Zyklus-Schritt</td>
			<td>Temp.</td>
			<td>Zeit</td>
			<td>Zyklen</td>
		</tr>
<tr>
<td>Anfängliche Denaturierung</td>
			<td>95 ° C</td>
			<td>3 min</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Denaturierung</td>
			<td>95 ° C</td>
			<td>30 Sek.</td>
			<td rowspan="3">36</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glühen *</td>
			<td>X ° C</td>
			<td>30 Sek.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Erweiterung</td>
			<td>72 ° C</td>
			<td>20 Sek./kb</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Letzte Erweiterung</td>
			<td>72 ° C</td>
			<td>5 min</td>
			<td rowspan="2">1</td>
		</tr>
<tr>
<td>4 ° C</td>
			<td>halten</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 3. In diesem Protokoll verwendeten PCR-Zustände.

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping at JoVE.com

High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping

Hochdurchsatz-DNA-Extraktion und Genotypisierung von 3dpf Zebrafischlarven durch Fin Clipping

Zebrafisch wurden als zuverlässige genetische Modellorganismen in der biomedizinischen Forschung, vor allem mit dem Aufkommen von Gen-Bearbeitung Technologien verwendet. Wenn Larven Phänotypen zu erwarten sind, kann DNA-Extraktion und Genotyp Identifizierung schwierig sein. Hier beschreiben wir eine effiziente Genotypisierung Verfahren für zebrafischlarven durch Rute zuschneiden, so früh wie 72 h nach Befruchtung.

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short ...

high-throughput-dna-extraction-genotyping-3dpf-zebrafish-larvae-fin

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

14.0K Aufrufe.  Children's Hospital of Eastern Ontario Research Institute. Zebrafisch wurden als zuverlässige genetische Modellorganismen in der biomedizinischen Forschung, vor allem mit dem Aufkommen von Gen-Bearbeitung Technologien verwendet. Wenn Larven Phänotypen zu erwarten sind, kann DNA-Extraktion und Genotyp Identifizierung schwierig sein. Hier beschreiben wir eine effiziente Genotypisierung Verfahren für zebrafischlarven durch Rute zuschneiden, so früh wie 72 h nach Befruchtung.

Serie: High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an excellent model for rapid assessment of whole transcriptome from whole animal or individual cell populations due to the ease of isolation of RNA from large numbers of animals. Here a protocol for global gene expression analysis in zebrafish embryos using RNA sequencing (RNASeq) is presented. We describe preparation of RNA from whole embryos or from cell populations obtained using cell sorting in transgenic animals. We also describe an approach for analysis of RNASeq data to identify enriched pathways and Gene Ontology (GO) terms in global gene expression data sets. Finally, we provide a protocol for validation of gene expression changes using quantitative reverse transcriptase PCR (qRT-PCR). These protocols can be used for comparative analysis of control and experimental sets of zebrafish to identify novel gene expression changes, and provide molecular insight into phenotypes of interest.

This protocol presents an approach for whole transcriptome analysis from zebrafish embryos, larvae, or sorted cells. We include isolation of RNA, pathway analysis of RNASeq data, and qRT-PCR-based validation of gene expression changes.

Probenvorbereitung und Analyse der RNASeq-basierte Genexpressionsdaten von Zebrafisch

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

Forschung

Genetik

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA mutation rates. Changes in replication timing occur during development and in cancer, but the role replication timing plays in development and disease is not known. Zebrafish were recently established as an in vivo model system to study replication timing. Here is detailed the protocols for using the zebrafish to determine DNA replication timing. After sorting cells from embryos and adult zebrafish, high-resolution genome-wide DNA replication timing patterns can be constructed by determining changes in DNA copy number through analysis of next generation sequencing data. The zebrafish model system allows for evaluation of the replication timing changes that occur in vivo throughout development, and can also be used to assess changes in individual cell types, disease models, or mutant lines. These methods will enable studies investigating the mechanisms and determinants of replication timing establishment and maintenance during development, the role replication timing plays in mutations and tumorigenesis, and the effects of perturbing replication timing on development and disease.

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Zebrafish were recently used as an in vivo model system to study DNA replication timing during development. Here is detailed the protocols for using zebrafish embryos to profile replication timing. This protocol can be easily adapted to study replication timing in mutants, individual cell types, disease models, and other species.

DNA-Replikation Timing mit Zebrafisch als ein In Vivo Modell-System-Profiling

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been described at the morphological level, little is known about the molecular basis of cellular changes that occur as the organism develops. With recent advancements in microfluidics and multiplexing technologies, it is now possible to characterize gene expression in single cells. This allows for investigation of heterogeneity between individual cells of specific cell populations to identify and classify cell subtypes, characterize intermediate states that occur during cell differentiation, and explore differential cellular responses to stimuli. This study describes a protocol to isolate viable, single cells from zebrafish embryos for high throughput multiplexing assays. This method may be rapidly applied to any zebrafish embryonic cell type with fluorescent markers. An extension of this method may also be used in combination with high throughput sequencing technologies to fully characterize the transcriptome of single cells. As proof of principle, the relative abundance of cardiac differentiation markers was assessed in isolated, single cells derived from nkx2.5 positive cardiac progenitors. By evaluation of gene expression at the single cell level and at a single time point, the data support a model in which cardiac progenitors coexist with differentiating progeny. The method and work flow described here is broadly applicable to the zebrafish research community, requiring only a labeled transgenic fish line and access to microfluidics technologies.

This protocol describes a method for isolating single cells from zebrafish embryos, enriching for cells of interest, capturing zebrafish cells in microfluidic based single cell multiplex systems, and assessing gene expression from single cells.

Isolierung und Charakterisierung von Einzelzellen aus Zebrafischembryonen

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Entwicklungsbiologie

Screening Sperm for the Rapid Isolation of Germline Edits in Zebrafish

The advent of targeted CRISPR-Cas nuclease technologies has revolutionized the ability to perform precise genome editing in both established and emerging model systems. CRISPR-Cas genome editing systems use a synthetic guide RNA (sgRNA) to target a CRISPR-associated (Cas) endonuclease to specific genomic DNA loci, where the Cas endonuclease generates a double-strand break. The repair of double-strand breaks by intrinsic error-prone mechanisms leads to insertions and/or deletions, disrupting the locus. Alternatively, the inclusion of double-stranded DNA donors or single-stranded DNA oligonucleotides in this process can elicit the inclusion of precise genome edits ranging from single nucleotide polymorphisms to small immunological tags or even large fluorescent protein constructs. However, a major bottleneck in this procedure can be finding and isolating the desired edit in the germline. This protocol outlines a robust method for screening and isolating germline mutations at specific loci in Danio rerio (zebrafish); however, these principles may be adaptable in any model where in vivo sperm collection is possible.

CRISPR-Cas technologies have revolutionized the field of genome editing. However, finding and isolating the desired germline edit remains a major bottleneck. Therefore, this protocol describes a robust method for quickly screening F0 CRISPR-injected zebrafish sperm for germline edits using standard PCR, restriction digest, and gel electrophoresis techniques.

Screening von Spermien zur schnellen Isolierung von Keimbahnveränderungen im Zebrafisch

The advent of targeted CRISPR-Cas nuclease technologies has revolutionized the ability to perform precise genome editing in both established and emerging ...

<meta charset="utf8"></head><body>Fluoreszierende Proteinmarkierung in Zebrafischlarven mittels CRISPR/Cas9-Knock-in

Fluorescence Labeling to Visualize Low-Expressed Proteins in Zebrafish

CRISPR/Cas9-mediated knock-in (KI) technology allows for easier fluorescent-protein tagging in zebrafish (Danio rerio), a preferred model organism for in vivo imaging due to its transparency during the early developmental stage. Here, we provide a detailed protocol for performing high-efficiency fluorescence gene KI, rapid screening for KI founders, and low-abundance protein tracing in zebrafish larvae, which will lay a critical foundation for subsequent physio-pathological studies in zebrafish. The current protocol includes complete steps for the sgRNA design for the gene of interest, sgRNA in vitro transcription, Cas9 mRNA in vitro transcription, in vivo sgRNA screen for the one with the highest efficiency, donor plasmid design and construction, microinjection in zebrafish larvae, KI founder screen and zebrafish live imaging. Critical steps, troubleshooting tips, quality control methods, and advantages and applications of this protocol are included and discussed. This protocol assures quick and accurate results at a low cost and has been validated by multiple trials.

<meta charset="utf8"></head><body>Fluoreszenzmarkierung zur Visualisierung niedrig exprimierter Proteine im Zebrafisch

Here, we present a protocol to label proteins with a fluorescence protein tag in zebrafish larvae, a newly developed and modified in vivo system especially useful for visualizing low-abundance proteins in zebrafish.

Fluoreszenzmarkierung zur Visualisierung niedrig exprimierter Proteine im Zebrafisch

CRISPR/Cas9-mediated knock-in (KI) technology allows for easier fluorescent-protein tagging in zebrafish (Danio rerio), a preferred model organism for in ...

Genotyping and Quantification of In Situ Hybridization Staining in Zebrafish

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in developmental biology for decades. Traditionally, most gene expression studies relied on visual evaluation of the ISH signal, a method that is prone to bias, particularly in cases where sample identities are known a priori. We have previously reported on a method to circumvent this bias and provide a more accurate quantification of ISH signals. Here, we present a simple guide to apply this method to quantify the expression levels of genes of interest in ISH-stained embryos and correlate that with their corresponding genotypes. The method is particularly useful to quantify spatially restricted gene expression signals in samples of mixed genotypes and it provides an unbiased and accurate alternative to the traditional visual scoring methods.

Gene editing technologies have enabled researchers to generate zebrafish mutants to investigate gene function with relative ease. Here, we provide a guide to perform parallel embryo genotyping and quantification of in situ hybridization signals in zebrafish. This unbiased approach provides greater accuracy in phenotypical analyses based on in situ hybridization.

Genotypisierung und Quantifizierung der In-Situ-Hybridisierungsfärbung in Zebrafischen

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in ...

Examining Muscle Regeneration in Zebrafish Models of Muscle Disease

Skeletal muscle has a remarkable ability to regenerate following injury, which is driven by obligate tissue resident muscle stem cells. Following injury, the muscle stem cell is activated and undergoes cell proliferation to generate a pool of myoblasts, which subsequently differentiate to form new muscle fibers. In many muscle wasting conditions, including muscular dystrophy and ageing, this process is impaired resulting in the inability of muscle to regenerate. The process of muscle regeneration in zebrafish is highly conserved with mammalian systems providing an excellent system to study muscle stem cell function and regeneration, in muscle wasting conditions such as muscular dystrophy. Here, we present a method to examine muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease. The first step involves the use of a genotyping platform that allows the determination of the genotype of the larvae prior to eliciting an injury. Having determined the genotype, the muscle is injured using a needle stab, following which polarizing light microscopy is used to determine the extent of muscle regeneration. We therefore provide a high throughput pipeline which allows the examination of muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease.

Skeletal muscle regeneration is driven by tissue resident muscle stem cells, which are impaired in many muscle diseases such as muscular dystrophy, and this results in the inability of muscle to regenerate. Here, we describe a protocol that allows the examination of muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease.

Untersuchung der Muskelregeneration in Zebrafischmodellen von Muskelerkrankungen

Skeletal muscle has a remarkable ability to regenerate following injury, which is driven by obligate tissue resident muscle stem cells. Following injury, ...

Aufbereitung von Darmzellen aus Zebrafischlarven für die Einzelzell-RNA-Sequenzierung

Gut Isolation from Zebrafish Larvae for Single-cell RNA Sequencing

The gastrointestinal (GI) tract performs a range of functions essential for life. Congenital defects affecting its development can lead to enteric neuromuscular disorders, highlighting the importance to understand the molecular mechanisms underlying GI development and dysfunction. In this study, we present a method for gut isolation from zebrafish larvae at 5 days post fertilization to obtain live,&#160;viable cells which can be used for single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) analysis. This protocol is based on the manual dissection of the zebrafish intestine, followed by enzymatic dissociation with papain. Subsequently, cells are submitted to fluorescence-activated cell sorting, and viable cells are collected for scRNA-seq. With this method, we were able to successfully identify different intestinal cell types, including epithelial, stromal, blood, muscle, and immune cells, as well as enteric neurons and glia. Therefore, we consider it to be a valuable resource for studying the composition of the GI tract in health and disease, using the zebrafish.

Autor im Rampenlicht: Isolierung und Analyse von Darmzellen von Zebrafischlarven zur Untersuchung transkriptomischer Aspekte der gastrointestinalen Entwicklung 

Here, we describe a method for gut isolation from zebrafish larvae at 5 days post fertilization, for single-cell RNA sequencing analysis.

Hochdurchsatz-DNA-Extraktion und Genotypisierung von 3dpf Zebrafischlarven durch Fin Clipping

Zusammenfassung

Weitere Videos entdecken

Probenvorbereitung und Analyse der RNASeq-basierte Genexpressionsdaten von Zebrafisch

DNA-Replikation Timing mit Zebrafisch als ein In Vivo Modell-System-Profiling

Isolierung und Charakterisierung von Einzelzellen aus Zebrafischembryonen

Screening von Spermien zur schnellen Isolierung von Keimbahnveränderungen im Zebrafisch

Fluoreszenzmarkierung zur Visualisierung niedrig exprimierter Proteine im Zebrafisch

Fluoreszenzmarkierung zur Visualisierung niedrig exprimierter Proteine im Zebrafisch

Fluoreszenzmarkierung zur Visualisierung niedrig exprimierter Proteine im Zebrafisch

Genotypisierung und Quantifizierung der In-Situ-Hybridisierungsfärbung in Zebrafischen

Untersuchung der Muskelregeneration in Zebrafischmodellen von Muskelerkrankungen

Darmisolierung aus Zebrafischlarven für die Einzelzell-RNA-Sequenzierung