בחינת התחדשות שרירים במודלים של דגי זברה של מחלת שרירים

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לבחון ולכומת התחדשות שרירים במודל דגי זברה של מחלת שרירים. שיטה זו מספקת צינור תפוקה גבוהה כי הוא לא רק חסכוני, אלא גם רבייה מאוד ניקוד הפוטנציאל המתחדש של שריר חולה בסביבה in vivo. הדגמת ההליך איתי תהיה אבניקה רופארליה, עמיתת מחקר במכון האוסטרלי לרפואה רגנרטיבית.

עבור גנוטיפינג עובר חי, לקלף את סרט המגן הברור מפני השטח העליונים של שבב מיצוי DNA 24 תאים ולהשתמש קצה מסנן microliter 20 עם קצה לחתוך להעביר עובר אחד מרדים ב 13 microliters של מדיום עובר לתוך כל תא של השבב. כאשר כל העוברים נטענו, הר בעדינות את השבב על פלטפורמת הגנוטיפינג של עובר דג הזברה על ידי הצבת צד אחד בראשון, ואחריו שאר השבב. הדביק את מכסה הפלטפורמה המגנטית מעל השבב כדי למנוע אידוי של מדיום עובר במהלך פרוטוקול מיצוי ה- DNA ולסגור את המכסה.

הגדר את יחידת הבסיס ל- 2.4 וולט, 0.051 אמפר ו- 0.12 וואט והתחל את פרוטוקול חילוץ הדנ"א. הפלטפורמה צריכה להתחיל לרטט, אשר ניתן להעריך על ידי נגיעה עדינה במכסה. בזמן שהתוכנית פועלת, הכינו צלחת של 24 באר על ידי הוספת מיליליטר אחד של מדיום עובר לכל באר ולסמן צינורות רצועה שמונה באר שישמשו לאיסוף חומר DNA מכל עובר.

לאחר שמונה דקות של מיצוי, לחץ על כפתור ההפעלה / כיבוי כדי לעצור את הרטט של הפלטפורמה, הסר בעדינות את המכסה המגנטי והרם את השבב מהפלטפורמה. מעבירים 10 מיקרוליטרים של עובר בינוני מתא אחד לבאר המתאימה של צינור הפסים שמונה-well ומיד מוסיפים שתי טיפות של מדיום עובר טרי לתאים. מעבירים את העובר מהתא לבאר מתאימה של צלחת 24-באר שהוכנה בעבר.

כאשר כל העוברים הועברו, מניחים את הצלחת באינקובטור של 28 מעלות צלזיוס. בצע את בדיקות הגנוטיפינג המתאימות במורד הזרם על החומר הגנטי שנאסף בצינורות הרצועה שמונה בארות כדי לקבוע את הגנוטיפ של כל עובר. לאחר הגנוטיפ של כל עובר זוהה, להעביר את העוברים ל 90 מילימטר צלחות פטרי המכיל 25 מיליליטר של מים בינוניים ודגורת הצלחות ב 28 מעלות צלזיוס עד פגיעה בשרירים.

בארבעה ימים לאחר ההפריה, השתמשו בצינור כדי להעביר זחל אחד מרדים לצלחת פטרי חדשה ולהסיר בזהירות כל מדיום עודף מהמנה תחת מיקרוסקופ ניתוח. כוון את הדג כך שהראש נמצא בצד שמאל, הזנב הוא בצד ימין, אזור הגב הוא למעלה, והאזור הגחון הוא למטה, ולהשתמש מחט 30 מד כדי להפוך דקירה מדויקת מהירה לתוך אחד עד שני סומיטים בשריר epaxial מעל נקבובית anal ואופקי myoseptum. החל טיפה של בינוני עובר על דג הזברה הפצוע ולהעביר בזהירות את הזחל לתוך באר אחת של צלחת 24 באר המכילה מיליליטר אחד של מדיום עובר טרי לבאר.

כאשר כל הזחלים נפצעו, מניחים את הצלחת בחממה של 28 מעלות צלזיוס עד שדג הזברה מדמה. כדי לכמת את התחדשות השרירים, פתח תמונה של יום אחד לאחר פציעה בתוכנת ניתוח תמונה מתאימה והשתמש בכלי המצולע כדי לצייר צורה סביב אתר הפצע. השתמש בתוכנה כדי למדוד את האזור ולהתכוון לעוצמת ה- birefringence של האזור ולהעתיק ערכים אלה לתאים D3 ו- E3 של התבנית שסופקה.

צייר שני אזורים נוספים שכל אחד מהם משתרע על פני סומיט אחד עד שני סומיטים שלא נפגעו ומדוד את האזור ומשמעותו עוצמות birefringence של כל אחד מהאזורים האלה. העתק ערכים אלה לתאים D4 ו- D5 ו- E4 ו- E5 בתבנית. לאחר מכן חזור על המדידה עבור אותם אזורים בתמונת שלושת הימים שלאחר הפציעה.

כאשר ההשתתפות הדו-צדדית נמדדה באותו אופן בכל התמונות, חשב את ההשתנות המנורמלת עבור כל אזור על-ידי חלוקת עוצמת ההשתתפות הממוצעת של כל אזור לפי האזור שלו. עבור כל נקודת זמן, לחשב את birefringence מנורמל הממוצע של שני האזורים ללא פגע כדי לספק נקודת התייחסות עבור השריר ללא פגע. כדי לקבוע את היקף הפגיעה בשרירים ביום הראשון לאחר הפציעה, חלקו את ההפרשה המנורמלת של אזור הפציעה על ידי ההפרשה הנורמלית הממוצעת של האזורים שלא נפגעו.

כדי לקבוע את מידת התחדשות השרירים, חלקו את ההפרשה המנורמלת של אזור הפציעה בשלושת הימים שלאחר הפגיעה בעוצמה הנורמלית הממוצעת של האזורים הלא נפגעים בשלב זה. לבסוף, לחשב את המדד הרגנרטיבי על ידי חלוקת הערך להיקף התחדשות השריר ביום השלישי לאחר הפגיעה על ידי הערך להיקף הפגיעה בשריר ביום הראשון לאחר הפציעה. בניתוח מייצג זה, מצמד של עוברים מהצלבה בין שני דגי זברה הטרוזיגוס Lama2 הועבר לשבב מיצוי DNA ולאחר מכן genotyped.

בעוד פגיעה בשרירים גורמת לירידה בעוצמת ההפחתה ביום הראשון לאחר הפציעה, התחדשות מוצלחת של השרירים גורמת לירידה בעוצמה בתוך אותו אזור. ראוי לציין גם כי בעוד זחלים מסוג בר להציג עוצמת birefringence אחידה עקב דפוס שרירים נורמלי, עוצמת birefringence בשריר של Lama2 נוקאאוט זחלים אינה אחידה מאוד ספורדי סביר בשל שלמות שריר מופחתת. כפי שנצפה, הן סוג פראי וזחלים Lama2 לקוי להפגין עוצמת birefringence מוגברת באופן משמעותי באתר הפצע בשלושה ימים לאחר פציעה לעומת ביום אחד לאחר פציעה, המציין כי השריר התחדש.

קביעת המדד המתחדש מגלה כי זחלים לקויים Lama2 להציג עלייה בולטת התחדשות שרירים לעומת חיות סוג בר. בעוד פרוטוקול זה יאפשר לנו לזהות כל שינוי ביכולת של השריר להתחדש במודלים של מחלת שרירים, במורד הזרם ניתוח תאי ומולקולרי צריך להתבצע כדי לזהות את המנגנונים האחראים לשינויים שנצפו. שיטה זו אפשרה לנו לזהות כיצד תפקוד לקוי של תאי גזע שרירים ופגיעה באלמנטים נישה הקשורים תורם פתוגנזה מחלת שרירים, ולכן מאפשר לנו לזהות מנגנוני מחלה חדשניים.