פרוטוקול זה מתאר שיטה לסינון מהיר של אלפי גנומים באמצעות זרע של דג זברה בהזרקת F0 CRISPR. טכניקה זו היא יתרון בנגישות שלה. במקום גישות יקרות ומיוחדות המבוססות על ריצוף, השיטה שלנו משתמשת באנזימי הגבלת PCR ואלקטרופורזה בג'ל כדי לסנן נשאי F0 זכרים עבור indels או עריכות גנום ספציפיות.
החלק הקשה ביותר של הליך זה הוא פשוט לקבל את הזרע במהירות, אבל זה הופך להיות טכניקה טובה עבור הפריה חוץ גופית אם אנחנו עובדים עם הרבה דגים דיסמורפיים, ולכן זו דרך קלה עבורנו לחצות דגים שעושים לנו צרות. התחילו בהקמת מיכלי רבייה הן לדגי הבר והן לדגיית F0 ודגרו על המכלים למשך הלילה. לאחר הרדמת הדג הזכר למחרת, השתמשו בכף מחוררת כדי להעביר אותו לערימה של מגבות נייר נקיות.
גלגלו בעדינות את הדג כדי להסיר עודפי מים. יש להסיר את כל המים על ידי ייבוש עם רקמה נקייה ומקופלת. בעזרת הכפית המחוררת, מעבירים את הדג לספוג המוכן.
הניחו את צד הגחון של הדג כלפי מעלה וכתם בעדינות את האזור סביב סנפירי פי הטבעת עם נייר טישו מקופל ונקי. כדי לאסוף את הזרע, השתמש בצינור נימי כדי להזיז בעדינות את סנפירי האגן מקו האמצע, לחשוף את cloaca. מניחים את צינור הנימים ליד cloaca.
בעזרת האצבעות או זוג מלקחיים פילטר, סחטו בעדינות את דפנות הדג מהזימים כלפי מטה. באמצעות פעולה נימית, לאסוף את הזרע בצינור ולמקם אותו בצינור PCR המכיל 40 מיקרוליטר של 50 מילימולר נתרן הידרוקסיד פתרון, ולאחר מכן לגרש את הדגימה לתוך הצינור. לאחר סיבוב דגימות הזרע בצנטריפוגה קטנה, הכניסו את צינורות ה-PCR למחזור תרמי.
הפעל את המחזור על ידי חימום הדגימות במשך 40 דקות ב 95 מעלות צלזיוס ולאחר מכן קירור ב 25 מעלות צלזיוס. לאחר הסרת הדגימות מהמחזור, נטרלו את ה- pH על ידי הוספת 10 מיקרוליטר של טריס הידרוכלוריד מולארי אחד של pH שמונה. מערבבים על ידי שאיפת המתלה ולאחר מכן צנטריפוגות את הדגימות.
כוונו את המחזור התרמי ל-95 מעלות צלזיוס לצורך חימום מוקדם. ובינתיים, הכינו 25 מיקרוליטר של תערובת תגובת PCR לכל דגימת זרע. מערבבים היטב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה, ואז מסובבים את הדגימות.
מניחים את הדגימות במחזור התרמי שחומם מראש וקובעים את המחזור. כדי לקבל תמיסת ג'ל, יש לחמם במיקרוגל תמיסת ג'ל אגרוז 4% שהוכנה על ידי ערבוב אבקת אגרוז, כתם ג'ל וחיץ TBE. יוצקים את תמיסת הג'ל למסגרת יציקת ג'ל ומכניסים מסרק בצד אחד.
לאחר התמצקות הג'ל, הסר בזהירות את המסרק. מניחים את הג'ל במתקן אלקטרופורזה כך שהבארות יהיו הקרובות ביותר לאלקטרודה השלילית. יוצקים את חיץ הריצה TBE לתוך האסדה עד שהבארות שקועות במלואן.
התחל לטעון את הג'ל על ידי pipeting חמישה מיקרוליטר של סולם DNA לתוך הבאר הראשונה. לטעון את הבארות הנותרות עם 5 עד 10 מיקרוליטר של מוצר PCR. הפעל את הג'ל במשך שעה אחת במתח של 150 וולט כדי להבטיח הפרדה נאותה של המגברים.
השתמש במצלמת הג'ל כדי להציג את רצועות ה- DNA. ניתוח לוקוס P2RY12 הראה כי האמפליקון מסוג Wild הציג רצועה אחת באורך של 250 זוגות בסיסים בעוד שהאמפליקונים הזכריים שהוזרקו F0 והכילו indels רצו כרצועות מרובות. ניתוח לוקוס DNAH10 הראה כי אמפליקון מסוג Wild רץ כרצועה אחת של 400 זוגות בסיסים ארוכים.
אמפליקונים זכריים בהזרקת F0 המכילים אינדלים רצו כמספר רצועות או כרצועה אחת עם ניידות ג'ל מופחתת. למספר אחד הגברי המוזרק F0 הייתה רצועה נוספת במוצר המעוכל, שנעדרה במוצר ה-PCR, מה שהפך אותו למועמד המייסד הטוב ביותר להקמת קו נוק-אין מוטנטי. אם דג זכר אינו מייצר זרע כאשר הוא סחוט, עדיף לנוח את הדגים במשך שבוע ולנסות שוב במקום לסחוט אותם חזק מדי ולהסתכן בפגיעה בהם.
ברגע שה-FC או המייסד הזכר מוצלבים, האללים צריכים להיות מאומתים ברצף בצאצאי F1. ריצוף ישיר של אמפליקונים F1 וביצוע ניתוח אללים הטרוזיגוטי היא דרך קלה לעשות זאת.
