עבודה זו נתמכה על ידי משרד החקלאות מימון ללא צורך במיקור חוץ.

1. הכנה
<ol><li>לאסוף ציוד, חומרים ותוכנות להקליט ולעבד את הוידאו של הצמח קפוא.<ol>
<li>להתחיל מקפיא לתכנות על-ידי הגדרת מתג ההפעלה עלוהגדר את הטמפרטורה 0 ° C. תוכנית ההקפאה כדי להגיע-8 ° C-h 1 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>במקום אחד בן 6 שבועות תות צמח עם 2-5 פרחים גדל בתוך מיכל 1 ליטר למקפיא.</li>
	<li>להגדיר 2 מצלמות IR (למשל, מצלמות פליר T620) באמצעות רצועות הצמדה גוש עץ קטן כדי לייצר את הזווית הנכונה התכנסות של העדשות. הערה: המרחק האופטימלי מרחב המרכז של עדשות המצלמות 2 נחשבת בדרך כלל להיות זהה המרחק בין העיניים1 או כ- 7 ס מ.</li>
	<li>הר שתי המצלמות ג'ק מעבדה 10 x 10 ס מ, מיקום השקע במקפיא קרוב מספיק למפעל כדי לאפשר לתמונה להיות ממוקד. התאם את המצלמות אנכית או אופקית כך מאותו חלק של הצמח הוא גלוי של שתי מצלמות. השתמש את ג'ק למיקום שתי המצלמות אנכית בצורה כזאת, כי 2 תמונות מכילים את כל המפעל, חלק של הקרקע.</li>
	<li>לחבר את 2 מצלמות באמצעות מחבר USB לשקעים USB במחשב.</li>
	<li>חבר את השקעים ג / 2 שתי מצלמות כדי לאפשר ניטור רציף של הצמחים.</li>
</ol>2. המחשב וההתקנה תוכנה להקלטה
<ol><li>פתיחת 2 חלונות (1 חלון לכל מצלמה) של התוכנה על-ידי לחיצה כפולה על הסמל של התוכנה מצלמת אינפרא-אדום 2 x. בצע את ההוראות בתפריט ' עזרה ' כדי לחבר את המצלמה שמאלה בחלון השמאלי ואת המצלמה ימינה בחלון הנכון. הערה: הפרטים עבור שימוש בתוכנה ניתן לגשת דרך התפריט ' עזרה '. לוח מונוכרומטי היא המתאימה ביותר עבור דוגמה זו עקב הצורך בשימוש אדום-כחול לציפוי רינדור 3D.</li>
	<li>פתח את התוכנה ללכידת מסך על-ידי לחיצה כפולה על הסמל עבור התוכנית. להתאים את המסגרת לכידת על ידי לחיצה וגרירה המסגרת אז זה כולל שתי מצלמות כדי לאפשר של לכידת מסך של שתי מצלמות בו זמנית. הערה: מסך לכידת זרם הווידאו של שתי מצלמות בו זמנית חיוני משום שהוא מאפשר סנכרון מושלם של תצוגות שמאלה וימינה.</li>
	<li>להקליט הוידאו בדרגות 3-h עיבוד קל בתוכנת עיבוד וידאו. הערה: זה בלתי אפשרי לדעת בדיוק מתי הצמח יהיה להקפיא, לכן חשוב להקליט זמן מה לפני האירוע ההקפאה. האפשרות להקליט בקטעים היא תכונה של תוכנה זו, לכן מומלץ כי זה מוגדר כדי להקליט במשך 3 שעות. התוכנה לשמור באופן אוטומטי את ההקלטה 3-h, ולאחר מכן להתחיל הקלטות חדשות. הקובץ עבור כל 3-h הקלטה אוטומטית יינתן רצף מספרי אחרי השם. כל קובץ וידאו יהיו בין 10 ל- 20 GB, אז ודא כי מספיק שטח זמין בדיסק קשיח עבור קבצים מרובים בסדר גודל כזה.</li>
	<li>הפעלת התוכנית מקפיא על-ידי בחירת להפעיל התפריט בקר ולהתחיל לכידת מסך. לאחר מכן לחץ על לחצן Rec על החלון. ודא כי החלוקה לרמות מציג את האזור של המסך בשבי הופך לאדום.</li>
	<li>להקליט את הצמח תות שדה קפוא ל- 8 ° C והחזק את הטמפרטורה של מקפיא לשעה.</li>
	<li>להעלות את הטמפרטורה של המקפיא-2 ° C h עד במקפיא +2 מעלות צלזיוס. לעצור את ההקלטה. הערה: הכוללת הקפאת הזמן היא 14 h.</li>
	<li>המר את הקבצים עניין מתבנית .mp4 .mov באמצעות תוכנת המרה של הקובץ. הערה: במקרה זה, קובץ h 3 יחיד המכיל אירועים ההקפאה 1 או יותר ייעשה שימוש.</li>
</ol>3. עיבוד וידאו באמצעות סרטון הדמיה תוכנה
הערה: תוכנות ליצירת תמונות וידאו ייעשה שימוש בדוגמה זו. הדרכות כיצד להשתמש בתוכנה זמינים באינטרנט. דוגמה זו יניחו ידע בסיסי של התוכנה. ההנחה היא ההבנה של מונחים כגון "קומפוזיציה", "שכבה", ו "לעיבוד תור", כמו גם לוחות שונים, כיצד לטפל בהם.
<ol><li>לחץ פעמיים במקום כלשהו בתוך החלונית ' פרוייקט ' כדי לייבא את הקובץ. mov עניין תוכנת הדמיה, גרור את הקובץ אל הסמל ' קומפוזיציה ' בחלק התחתון של החלונית ' פרוייקט '. ואז לשמור את הפרוייקט לאותה תיקיה המכיל קטעי וידאו מקוריים. הערה: וידאו מוקלט יהיה גלוי בחלונית התצוגה המקדימה.</li>
	<li>לחץ על סמל האזור של עניין לאורך החלק התחתון של חלון התצוגה המקדימה, באמצעות הסמן, מתאר רק את ההקלטה מן המצלמה השמאלית.</li>
	<li>גרור על אותו סרטון .mov הסמל הרכב כדי ליצור הרכב השני של אותו סרטון. חזור על שלב 3.3, אבל הפעם, השתמש הסמן כדי לבחור רק המצלמה ימינה.</li>
	<li>בחר את הרכב > חיתוך מבנה שכבות האזור של אינטרס עבור התצוגה השמאלי. חזור על הפעולה עבור התצוגה. לשנות את הרכב אחד כדי לציין שהוא ימין ועל שמאל.</li>
	<li>לסמן את הרכב השמאלי על-ידי לחיצה על זה, בתפריט הראשי בחלק העליון, בחירת הרכב > הוספה לתור רינדור.</li>
	<li>בתור רינדור, לחץ על מודול וודא כי הסרטון יוצג ככתב וידאו (למשל, וידאו QuickTime). לחצו על ' קביעות רינדור ' כדי להפחית את הרזולוציה כדי לאפשר של רינדור מהיר יותר. לחץ על הפלט, שם וידאו תות שמאל, ולשמור אותו באותה תיקיה שבה את ההקלטה המקורית ואת הפרוייקט. לחץ על שמורולאחר מכן לחץ על לחצן רינדור בצד הימני העליון של החלונית ' רינדור '.</li>
	<li>חזור על צעד 3.6 ההרכב תות ימינה .</li>
	<li>לחץ פעמיים על החלונית ' פרוייקט ' ויבא תות תות ימינה ושמאלה קטעי וידאו כי היו רק שניתנו.</li>
	<li>להדגיש שני סרטוני הווידאו ולגרור אותם אל הסמל ' קומפוזיציה ' בחלק התחתון של החלונית ' פרוייקט '. במסך הנפתח מבקש עדיין משך, הזן 3 באפסים 5 עבור משך 3-h. הערה: שני סרטוני הווידאו, בדיוק מסונכרנת, תהיה בחלונית ' פרוייקט ', אך רק הווידאו העליון בפאנל הקומפוזיציה יהיה גלוי.</li>
	<li>כדי להציג את התמונה השנייה, לחץ על גלגל העין קטן כדי לבטל את השכבה. הקש שליטה/W כדי לאפשר פקד המסתובבת של התמונות בחלונית התצוגה המקדימה באמצעות הסמן. באמצעות הסמן, לחיצה על השכבה העליונה, להתאים את ההיבט המסתובבת של החלק העליון או התחתון התצוגה כדי לוודא גם תמונות נמצאים באותו מישור הסיבוב. ואז להתאים את המטוס X ו- Y ישירות בתוך קוד המקור של משקפי 3D.</li>
	<li>להאיר את השכבה העליונה של החלונית ' קומפוזיציה ', בחר אפקט > מבט > משקפי תלת-ממד מתוך התפריט בחלק העליון. הערה: הפרמטרים עבור 3D משקפיים אפקט יופיע בתוך לוח הבקרה.</li>
	<li>בחלונית ' בקרה ', לחץ על התיבה בצד ימין של "מבט שמאלה" — אם לוח הבקרה אינו מופרד מהחלונית ' ' פרוייקט, לחץ על הכרטיסיה של לוח הבקרה בחלק העליון של החלונית ' פרוייקט '. רשימה של קטעי וידאו 2 בפאנל הקומפוזיציה בתפריט הנפתח, לסמן את הוידאו ברשימה עבור התצוגה"שמאל". חזור על שלב זה עבור "תצוגה נכון".</li>
	<li>בתיבה בצד ימין של תצוגת תלת-ממד, בחרו LR כחול אדום.</li>
	<li>בעזרת משקפיים אדום-כחול, בדוק את התצוגה בחלונית ' פרוייקט '. אם התצוגה 3D נראה שגוי, נסה ללחוץ על החלף משמאל לימין. להתאים למקום התכנסות יישור אנכי כדי לחסל כל זן לברורות ועין.</li>
	<li>כאשר ההיבט תלת-ממד של הווידאו קבילה, לסמן את ההרכב על ידי לחיצה על אותו ובחר הרכב > הוסף לעיבוד תור כפי שנעשה בשלב 3.7. רינדור הוידאו לתוך באותה תיקיה שבה הקבצים האחרים בפרויקט. הערה: קובץ זה יהיה די גדול. ברגע שהקובץ כבר שניתנו, זה יכול להיות מחדש לאחר הרינדור גודל קובץ קטן יותר שימוש בתוכנת עיבוד וידאו.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Geng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+display+technologies.">Three-dimensional display technologies.</a> Advances in Optics and Photonics. 5, 456-535 (2013).</li><li>Ceccardi, T. L., Heath, R. L., Ting, I. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-temperature+exotherm+measurement+using+infrared+thermography.">Low-temperature exotherm measurement using infrared thermography.</a> HortScience. 30, 140-142 (1995).</li><li>Wimmer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> History of thermal imaging, Security Sales and Integration. , (2011).</li><li>Wisniewski, M., Lindow, S. E., Ashworth, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observations+of+ice+nucleation+and+propagation+in+plants+using+infrared+video+thermography.">Observations of ice nucleation and propagation in plants using infrared video thermography.</a> Plant Physiology. 113, 327-334 (1997).</li><li>Kuprian, E., Tuong, T., Pfaller, K., Livingston, D. P., Neuner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+supercooling+of+reproductive+shoots+is+enabled+by+structural+ice+barriers+being+active+despite+an+intact+xylem+connection.">Persistent supercooling of reproductive shoots is enabled by structural ice barriers being active despite an intact xylem connection.</a> Public Library of Science ONE. 11, e0163160 (2016).</li><li>Livingston, D. P., Tuong, T. D., Murphy, J. P., Gusta, L., Wisniewski, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-definition+infrared+thermography+of+ice+nucleation+and+propagation+in+wheat+under+natural+frost+conditions+and+controlled+freezing.">High-definition infrared thermography of ice nucleation and propagation in wheat under natural frost conditions and controlled freezing.</a> Planta. 247, 791-806 (2017).</li><li>Boyles, R. P., Raman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+climate+patterns+and+trends+in+North+Carolina+(1949-1998).">Analysis of climate patterns and trends in North Carolina (1949-1998).</a> Environment International. 29 (2-3), 263-275 (2003).</li><li>Poling, E. B., Poling, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Managing+Cold+Events.">Managing Cold Events.</a> A Growers' Guide to Production, Economics and Marketing. , 75-97 (2015).</li><li>Hacker, J., Neuner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ice+porpagaion+in+plants+visualized+at+the+tissue+level+by+infrared+differential+thermal+analysis+(IDTA).">Ice porpagaion in plants visualized at the tissue level by infrared differential thermal analysis (IDTA).</a> Tree Physiology. 27, 1661-1670 (2007).</li><li>He, J. Q., Harrison, R. J., Li, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+3D+imaging+system+for+strawberry+phenotyping.">A novel 3D imaging system for strawberry phenotyping.</a> Plant Methods. 13, 93-101 (2017).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

שתי מצלמות IR הנחוץ עבור פרוטוקול זה, הם חייב להיות מכוון את הנושא מזוויות שונות במקצת1. זה ידרוש את העדשות כדי להיות בין 5-8 ס מ אחד מהשני, אבל שניהם חייב להיות מכוון באותו המקום על הנושא כדי להצטלם. לחשוב על עדשות מצלמה 2 כסוג של הפונדקאית לעיניים של הצופה. המצלמה שמאלה הוא אנלוגי ...

למרות לחיות בעולם של שלושת הממדים הפיזיים, חוקרים מוגבלות לעתים קרובות לדיווח על תצפיות חזותיות בדו-ממד. תמונות דו-ממד אמנם בדרך כלל מספיקות להעביר מידע חשוב, חוסר מידע על עומק מגבילה את היכולת שלנו תופסים ומבינים את המורכבות של אובייקטים בעולם האמיתי. 1
זה מחסור במידע לגבי העומק מספק תמריץ בהפקת סרטי תלת-ממד בעיקר בתעשיית הקולנוע המסחרי מאז המאה ה-20 המוקדמות1. עם זאת, הפקת מידע ברור 3D ב עדיין תמונות וקטעי וידאו מתעכבת על ידי המורכבויות מעורב בהפקת תמונות אלה. הגישה הפשוטה ביותר כדי לייצר קולנוע תלת-ממד מבוססת על עקרונות שימוש בצילום סטריאוסקופי. צילום סטריאוסקופי מנצל שתי תמונות של אותו אובייקט מזוויות שונות במקצת שאיור תמונת תלת-ממד במוח. כדי להפוך את זה אפשרי, כל עין חייבים להסתכל רק את תדמיתה בהתאמה (קרי, העין השמאלית על התמונה השמאלית, העין הימנית על התמונה הנכונה). מאז העיניים לא טבעי יעשו זאת, כיסוי ראש סטריאוסקופי תוכנן כדי להפוך זה אפשרי1. כמה סטריאוסקופי הצגת טכניקות, כמו גם כמו קיטוב-שזירה, זמן-מרובב, וטכניקות תצוגה ראשי-הר, השתמשו במהלך הפיתוח של סרטי תלת מימד, אבל בשיטת השזירה צבע או טכנולוגיית באמצעות אדום, ירוק (או ציאן) משקפיים היא אחד של טכניקות הפשוטה והזולה ביותר. לסקירה מקיפה של 3D הדמיה וטכניקות שונות של המעורבים, ראה את הסקירה על ידי גנג1.
ניטור קפוא צמחים באמצעות IR צילום תרמי מבוססת על העיקרון כי כאשר המים קופא, זה צריך לוותר על אנרגיה פנימית2. אנרגיה זו היא בצורה של חום, אשר הוא לזיהוי האזור האינפרא-אדום של הספקטרום האלקטרומגנטי. מסוגל להקליט את האנרגיה IR מצלמות היו בשימוש מאז 19293. הדוח שפורסם הראשון בטכנולוגיה IR לסרט קפוא צמחים הוא מ. Cecardi et al. 2, אבל הרזולוציה של המצלמה בשימוש מקשה לקבוע במדויק הרקמה איפה הקפאת מאותחלת. ויזנייבסקי. et al. 4 נקבע אתרים מדויקת יותר של קרח התגרענות של מספר מיני צמחים בעזרת מצלמה ברזולוציה גבוהה יותר. ככל שהטכנולוגיה בשימוש IR צילום תרמי משופר, תמונות ברזולוציה גבוהה הוביל תגליות כגון חסמי מקפיא5 ולוקליזציה הסלולר מדויק של היווצרות קרח6.
קושי אחד לצלם נושאים IR נגרמת על ידי הבדלים קטנים בטמפרטורות. זה יגרום רוב האובייקטים בתוך שדה הראייה להיות בצבע דומה, ולכן קשה לקבוע בדיוק אילו אובייקטים הוא/הם קופאים. זה יכול להיות חשוב בעת קביעת סדר קפוא רקמות ספציפיות, כגון עלים או שורשי חיטה6. אם הוידאו IR של צמחים קפוא יכול לדימות תלת-ממד, המזוןאפשר לשפר את הדיוק של לקבוע איזה חלק של הצמח קפוא בנקודה מסוימת בזמן.
תות שדה הוא יבול באזורים מסוימים של ארצות הברית שבה יורדות הטמפרטורות הקפאה של ניכרת דאגה למגדלים. בתנאים מסוימים גדל והולך, זה נפוץ תות שדה פרחים יופיעו 2-3 שבועות לפני הממוצע באביב שעבר להקפיא. אירוע הקפאת יכול להתרחש בסוף יוני באזורים מסוימים של הרי האפלצ'ים7 , בדרך כלל תוצאות במוות של הפרח. הגנה פרוסט, לפיכך, הוא קריטי עבור מגדלי תות באזורים נתונים אלה להקפיא את האירועים. מגדלי תות בצפון קרוליינה, לדוגמה, פרוסט-להגן, בממוצע בין 4-6 אירועים פרוסט לפני בלום ו 1-2 קופא קשה במהלך המוקדמות פורחים תקופה8. כדי לסייע לפתח אחרים תות שדה קפוא סובלני יותר, חשוב להבין היבטים שונים של ההקפאה, כגון האתרים של קרח התגרענות והתפשטות לחלקים אחרים של הצמח. IR צילום תרמי מספק אמצעי יעיל לטיפול בבעיות אלה.
כאן, אנו משתמשים תות שדה להמחשת טכניקה עבור הקלטת אירועים הקפוא בשיטת טכנולוגיית תלת-ממד. תות שדה הוא גם מתאים עבור דוגמה זו כי עלים, פרחים מופצים באופן נרחב במרחב תלת-ממדי, ואפשר להבחין כאשר צפו בסרטי 2D אינפרא-אדום.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="811">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">T620 Infrared Camera and software</td>
			<td style="width:71px;">FLIR</td>
			<td style="width:119px;">55903-5122</td>
			<td style="width:323px;">2 cameras are needed. Software works only on a Windows-based computer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:299px;">After Effects</td>
			<td style="width:71px;">Adobe</td>
			<td style="width:119px;">15.0.1.73</td>
			<td style="width:323px;">Post-Production Video Editing Software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Bandicam</td>
			<td style="width:71px;">Bandisoft</td>
			<td style="width:119px;">4.1.2.1385</td>
			<td>Screen Capture Software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Laboratory Scissor Jack&#160;&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Eisco</td>
			<td style="width:119px;">CH0642A</td>
			<td>Steel Platform 13X15 cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Fastening Strap</td>
			<td style="width:71px;">Velcro</td>
			<td style="width:119px;">90441</td>
			<td>To hold camera on jack.&#160; Should be at least 60cm long by 2cm wide</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Media Converter</td>
			<td style="width:71px;">iSkysoft</td>
			<td style="width:119px;">10.0.6</td>
			<td>Software to convert mp4 files to .mov&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protocol for producing three-dimensional infrared video of freezing in plants

הקפאת בצמחים ניתן לנטר באמצעות אינפרא-אדום (IR) הדמאה תרמית, כי כאשר המים קופא, זה נותן את החום. אולם, בעיות עם ניגודיות הצבעים לעשות 2 ממדים תמונות אינפרא-אדום (2D) קצת קשה לפרש. הצגת תמונה IR או הוידאו של צמחים קפוא 3 ממדי (3D) תאפשר של זיהוי מדויק יותר של אתרי התגרענות קרח, כמו גם את ההתקדמות של הקפאה. בנייר זה, נדגים אמצעי פשוט יחסית לייצר סרטון אינפרא-אדום תלת-ממד של צמח תות שדה קפוא. תות שדה הוא לתוצר חקלאי חשוב מבחינה כלכלית כי הוא נתון קפיץ לא צפוי להקפיא אירועים בתחומים רבים של העולם. הבנה מדויקת של הקפואות תות תספק מגדלים והן מגדלי עם דרכים חסכוני יותר כדי למנוע נזק לצמחים במהלך הקפאת התנאים.
הטכניקה מערבת מיצוב של שתי מצלמות IR בזוויות שונות במקצת לצלם את תות שדה קפוא. שני הזרמים וידאו תסונכרן דווקא באמצעות תוכנה ללכידת מסך מקליט שתי מצלמות בו זמנית. ההקלטות מכן ייובאו לתוך התוכנה הדמיה ומעובדים בטכניקה של טכנולוגיית. בעזרת משקפיים אדום-כחול, וידאו תלת-ממד זה מקל לקבוע האתר המדויק של קרח התגרענות על משטחים עלה.

באופן מפתיע, וידאו IR של צמח תות שדה קפוא (1 וידאו משלימה) ציינו כי לא כל עלים/פרחים קפא באותו זמן. העלים ופרחים קפא בנפרד בטמפרטורות שונות, אך העלים קפא מוקדם יותר מאשר את הפרחים, בטמפרטורה גבוהה. בנוסף, הקפאת החל העלים אך לא בהכרח במיקום זהה על כל עלה. ואילו תוצאות א?...

Watch this Scientific Journal Video about Protocol for Producing Three-Dimensional Infrared Video of Freezing in Plants at JoVE.com

Protocol for Producing Three-Dimensional Infrared Video of Freezing in Plants

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לשיקוף צמח תות שדה קפוא 3 מידות. שתי מצלמות אינפרא אדום מוצבים בזווית שונה במקצת משמשים להפקת סרט אדום-כחול טכנולוגיית להתבונן על הקפאת של הצמח 3 מימדים.

פרוטוקול להפקת וידאו תלת ממדי אינפרא-אדום להקפאת בצמחים

Freezing in plants can be monitored using infrared (IR) thermography, because when water freezes, it gives off heat. However, problems with color contrast ...

protocol-for-producing-three-dimensional-infrared-video-freezing

Research

JoVE Journal

Environment

6.1K Views.  United States Department of Agriculture and North Carolina State University. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לשיקוף צמח תות שדה קפוא 3 מידות. שתי מצלמות אינפרא אדום מוצבים בזווית שונה במקצת משמשים להפקת סרט אדום-כחול טכנולוגיית להתבונן על הקפאת של הצמח 3 מימדים.

Video: Protocol for Producing Three-Dimensional Infrared Video of Freezing in Plants

High-resolution, High-speed, Three-dimensional Video Imaging with Digital Fringe Projection Techniques

Digital fringe projection (DFP) techniques provide dense 3D measurements of dynamically changing surfaces.&#160;Like the human eyes and brain, DFP uses triangulation between matching points in two views of the same scene at different angles to compute depth.&#160;However, unlike a stereo-based method, DFP uses a digital video projector to replace one of the cameras1. The projector rapidly projects a known sinusoidal pattern onto the subject, and the surface of the subject distorts these patterns in the camera&#8217;s field of view. Three distorted patterns (fringe images) from the camera can be used to compute the depth using triangulation.
Unlike other 3D measurement methods, DFP techniques lead to systems that tend to be faster, lower in equipment cost, more flexible, and easier to develop.&#160;DFP systems can also achieve the same measurement resolution as the camera.&#160;For this reason, DFP and other digital structured light techniques have recently been the focus of intense research (as summarized in1-5). Taking advantage of DFP, the graphics processing unit, and optimized algorithms, we have developed a system capable of 30&#160;Hz 3D video data acquisition, reconstruction, and display for over 300,000 measurement points per frame6,7.&#160;Binary defocusing DFP methods can achieve even greater speeds8.
Diverse applications can benefit from DFP techniques. Our collaborators have used our systems for facial function analysis9, facial animation10, cardiac mechanics studies11, and fluid surface measurements, but many other potential applications exist.&#160;This video will teach the fundamentals of DFP techniques and illustrate the design and operation of a binary defocusing DFP system.

This video describes the fundamentals of digital fringe projection techniques, which provide dense 3D measurements of dynamically changing surfaces.&#160;It also demonstrates the design and operation of a high-speed binary defocusing system based on these techniques.

ברזולוציה גבוהה, במהירות גבוהה, הדמיה וידאו תלת ממדית עם טכניקות הקרנה הדיגיטלי פרינג&#39;

Digital fringe projection (DFP) techniques provide dense 3D measurements of dynamically changing surfaces.&#160;Like the human eyes and brain, DFP uses ...

Engineering

The Use of High-resolution Infrared Thermography (HRIT) for the Study of Ice Nucleation and Ice Propagation in Plants

Freezing events that occur when plants are actively growing can be a lethal event, particularly if the plant has no freezing tolerance. Such frost events often have devastating effects on agricultural production and can also play an important role in shaping community structure in natural populations of plants, especially in alpine, sub-arctic, and arctic ecosystems. Therefore, a better understanding of the freezing process in plants can play an important role in the development of methods of frost protection and understanding mechanisms of freeze avoidance. Here, we describe a protocol to visualize the freezing process in plants using high-resolution infrared thermography (HRIT). The use of this technology allows one to determine the primary sites of ice formation in plants, how ice propagates, and the presence of ice barriers. Furthermore, it allows one to examine the role of extrinsic and intrinsic nucleators in determining the temperature at which plants freeze and evaluate the ability of various compounds to either affect the freezing process or increase freezing tolerance. The use of HRIT allows one to visualize the many adaptations that have evolved in plants, which directly or indirectly impact the freezing process and ultimately enables plants to survive frost events.

The Use of High-resolution Infrared Thermography HRIT for the Study of Ice Nucleation and Ice Propagation in Plants

Here we present a protocol that allows one to visualize sites of ice formation and avenues of ice propagation in plants utilizing high resolution infrared thermography (HRIT).

השימוש ברזולוציה גבוהה אינפרא אדום תרמוגרפיה (HRIT) לחקר הקרח נוקלאציה וקרח רביה בצמחים

Freezing events that occur when plants are actively growing can be a lethal event, particularly if the plant has no freezing tolerance. Such frost events ...

RGB and Spectral Root Imaging for Plant Phenotyping and Physiological Research: Experimental Setup and Imaging Protocols

Better understanding of plant root dynamics is essential to improve resource use efficiency of agricultural systems and increase the resistance of crop cultivars against environmental stresses. An experimental protocol is presented for RGB and hyperspectral imaging of root systems. The approach uses rhizoboxes where plants grow in natural soil over a longer time to observe fully developed root systems. Experimental settings are exemplified for assessing rhizobox plants under water stress and studying the role of roots. An RGB imaging setup is described for cheap and quick quantification of root development over time. Hyperspectral imaging improves root segmentation from the soil background compared to RGB color based thresholding. The particular strength of hyperspectral imaging is the acquisition of chemometric information on the root-soil system for functional understanding. This is demonstrated with high resolution water content mapping. Spectral imaging however is more complex in image acquisition, processing and analysis compared to the RGB approach. A combination of both methods can optimize a comprehensive assessment of the root system. Application examples integrating root and aboveground traits are given for the context of plant phenotyping and plant physiological research. Further improvement of root imaging can be obtained by optimizing RGB image quality with better illumination using different light sources and by extension of image analysis methods to infer on root zone properties from spectral data.

An experimental protocol is presented for assessment of soil grown plant root systems with RGB and hyperspectral imaging. Combination of RGB image time series with chemometric information from hyperspectral scans optimizes insights into plant root dynamics.

RGB והדמיה ספקטרלי שורש הצמח Phenotyping ומחקר פיזיולוגיים: הגדרת הניסוי והדמיה פרוטוקולים

Better understanding of plant root dynamics is essential to improve resource use efficiency of agricultural systems and increase the resistance of crop ...

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of plant leaves or vertebrate lungs further difficulties arise from multiple transitions in refractive index between cellular components, between cells and airspaces and between the biological tissue and the rest of the optical system. Moreover, refractive index mismatches lead to attenuation of fluorophore excitation and signal emission in fluorescence microscopy. We describe here the application of the perfluorocarbon, perfluorodecalin (PFD), as an infiltrative imaging medium which optically improves laser scanning confocal microscopy (LSCM) sample imaging at depth, without resorting to damaging increases in laser power and has minimal physiological impact2. We describe the protocol for use of PFD with Arabidopsis thaliana leaf tissue, which is optically complex as a result of its structure (Figure 1). PFD has a number of attributes that make it suitable for this use3. The refractive index of PFD (1.313) is comparable with that of water (1.333) and is closer to that of cytosol (approx. 1.4) than air (1.000). In addition, PFD is readily available, non-fluorescent and is non-toxic. The low surface tension of PFD (19 dynes cm-1) is lower than that of water (72 dynes cm-1) and also below the limit (25 - 30 dyne cm-1) for stomatal penetration4, which allows it to flood the spongy mesophyll airspaces without the application of a potentially destructive vacuum or surfactant. Finally and crucially, PFD has a great capacity for dissolving CO2 and O2, which allows gas exchange to be maintained in the flooded tissue, thus minimizing the physiological impact on the sample. These properties have been used in various applications which include partial liquid breathing and lung inflation5,6, surgery7, artificial blood8, oxygenation of growth media9, and studies of ice crystal formation in plants10. Currently, it is common to mount tissue in water or aqueous buffer for live confocal imaging. We consider that the use of PFD as a mounting medium represents an improvement on existing practice and allows the simple preparation of live whole leaf samples for imaging.

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

We describe the use of perfluorodecalin as an infiltrative mounting medium. This is a simple method for improving depth of imaging in Arabidopsis thaliana leaf tissue with minimal physiological impact.

שיטה פשוטה הדמיה ארבידופסיס מותיר שימוש Perfluorodecalin כנושאת הדמיה Infiltrative

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of ...

Biology

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue patterning. During animal development, key cell proliferation and patterning events occur very quickly. For instance, in Caenorhabditis elegans all cell divisions required for the larval body plan are completed within six hours after fertilization, with seven mitotic cycles1; the sixteen or more mitoses of Drosophila embryogenesis occur in less than 24 hr2. In contrast, cell divisions during plant development are slow, typically on the order of a day 3,4,5 . This imposes a unique challenge and a need for long-term live imaging for documenting dynamic behaviors of cell division and differentiation events during plant organogenesis. Arabidopsis epidermis is an excellent model system for investigating signaling, cell fate, and development in plants. In the cotyledon, this tissue consists of air- and water-resistant pavement cells interspersed with evenly distributed stomata, valves that open and close to control gas exchange and water loss. Proper spacing of these stomata is critical to their function, and their development follows a sequence of asymmetric division and cell differentiation steps to produce the organized epidermis (Fig. 1).
This protocol allows observation of cells and proteins in the epidermis over several days of development. This time frame enables precise documentation of stem-cell divisions and differentiation of epidermal cells, including stomata and epidermal pavement cells. Fluorescent proteins can be fused to proteins of interest to assess their dynamics during cell division and differentiation processes. This technique allows us to understand the localization of a novel protein, POLAR6, during the proliferation stage of stomatal-lineage cells in the Arabidopsis cotyledon epidermis, where it is expressed in cells preceding asymmetric division events and moves to a characteristic area of the cell cortex shortly before division occurs. Images can be registered and streamlined video easily produced using public domain software to visualize dynamic protein localization and cell types as they change over time.

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

We describe a protocol using chamber slides and media to immobilize plant cotyledons for confocal imaging of the epidermis over several days of development, documenting stomatal differentiation. Fluorophore-tagged proteins can be tracked dynamically by expression and subcellular localization, increasing understanding of their possible roles during cell division and cell-type differentiation.

לטווח ארוך הדמיה, ברזולוציה גבוהה Confocal זמן פקיעה של<em&gt; טבורית ארבידופסיס</em&gt; אפידרמיס במהלך הנביטה

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ binding proteins that initiate Ca2+ signaling cascades. However, we still know little about how stimulus specific Ca2+ signals are generated. The specificity of a Ca2+ signal may be attributed to the sophisticated regulation of the activities of Ca2+ channels and/or transporters in response to a given stimulus. To identify these cellular components and understand their functions, it is crucial to use systems that allow a sensitive and robust recording of Ca2+ signals at both the tissue and cellular levels. Genetically encoded Ca2+ indicators that are targeted to different cellular compartments have provided a platform for live cell confocal imaging of cellular Ca2+ signals. Here we describe instructions for the use of two Ca2+ detection systems: aequorin based FAS (film adhesive seedlings) luminescence Ca2+ imaging and case12 based live cell confocal fluorescence Ca2+ imaging. Luminescence imaging using the FAS system provides a simple, robust and sensitive detection of spatial and temporal Ca2+ signals at the tissue level, while live cell confocal imaging using Case12 provides simultaneous detection of cytosolic and nuclear Ca2+ signals at a high resolution.

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Ca2+ signaling regulates diverse biological processes in plants. Here we present approaches for monitoring abiotic stress induced spatial and temporal Ca2+ signals in Arabidopsis cells and tissues using the genetically encoded Ca2+ indicators Aequorin or Case12.

מדידת מרחב ובזמן Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; אותות בצמחים ארבידופסיס

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ ...

Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the observation of the whole organ with a high spatial- as well as temporal resolution over prolonged periods of time, which may cause photo-toxic effects. This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy, which is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel. The plant is mounted in such a way that the roots are submerged in a liquid medium while the leaves remain in the air. In order to ensure photosynthetic activity of the plant, a custom-made lighting system illuminates the leaves. To keep the roots in darkness the water surface is covered with sheets of black plastic foil. This method allows long-term imaging of plant organ development in standardized conditions.

This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy. The setup is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel and letting it grow in controlled bright conditions. This allows long-term observation of plant organ development in standardized conditions.

מיקרוסקופ פלואורסצנטי גיליון אור של שורשי הצמח גדל על פני השטח של ג&#39;ל

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the ...

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is regulated spatially and temporally. The use of a fluorescent gene under the control of an immunity-related promoter in combination with an automated fluorescence microscopy is a simple way to understand spatiotemporal regulation of plant immunity. In contrast to the root tissues that have been used for a number of various intravital fluorescent imaging experiments, there exist few fluorescent live-imaging examples for the leaf tissues that encounter an array of airborne microbial infections. Therefore, we developed a simple method to mount leaves of Arabidopsis thaliana plants for live-cell imaging over an extended period of time. We used transgenic Arabidopsis plants expressing the yellow fluorescent protein (YFP) genefused to the nuclear localization signal (NLS) under the control of the promoter of a defense-related marker gene, Pathogenesis-Related 1 (PR1). We infiltrated a transgenic leaf with Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (avrRpt2) strain (Pst_a2) and performed in vivo time-lapse imaging of the YFP signal for a total of 40 h using an automated fluorescence stereomicroscope. This method can be utilized not only for studies on plant immune responses but also for analyses of various developmental events and environmental responses occurring in leaf tissues.

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

We report a simple and versatile method for performing fluorescent live-imaging of Arabidopsis thaliana leaves over an extended period of time. We use a transgenic Arabidopsis plant expressing a fluorescent reporter gene under the control of an immunity-related promoter as an example for gaining spatiotemporal understanding of plant immune responses.

שיטה רב-תכליתי עבור הרכבה תודרנית יוצא Intravital הדמיה בצילום מואץ

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is ...

Identification of Novel Regulators of Plant Transpiration by Large-Scale Thermal Imaging Screening in Helianthus Annuus

Plant adaptation to biotic and abiotic stresses is governed by a variety of factors, among which the regulation of stomatal aperture in response to water deficit or pathogens plays a crucial role. Identifying small molecules that regulate stomatal movement can therefore contribute to understanding the physiological basis by which plants adapt to their environment. Large-scale screening approaches that have been used to identify regulators of stomatal movement have potential limitations: some rely heavily on the abscisic acid (ABA) hormone signaling pathway, therefore excluding ABA-independent mechanisms, while others rely on the observation of indirect, long-term physiological effects such as plant growth and development. The screening method presented here allows the large-scale treatment of plants with a library of chemicals coupled with a direct quantification of their transpiration by thermal imaging. Since evaporation of water through transpiration results in leaf surface cooling, thermal imaging provides a non-invasive approach to investigate changes in stomatal conductance over time. In this protocol, Helianthus annuus seedlings are grown hydroponically and then treated by root feeding, in which the primary root is cut and dipped into the chemical being tested. Thermal imaging followed by statistical analysis of cotyledonary temperature changes over time allows for the identification of bioactive molecules modulating stomatal aperture. Our proof-of-concept experiments demonstrate that a chemical can be carried from the cut root to the cotyledon of the sunflower seedling within 10 minutes. In addition, when plants are treated with ABA as a positive control, an increase in leaf surface temperature can be detected within minutes. Our method thus allows the efficient and rapid identification of novel molecules regulating stomatal aperture.

Identification of Novel Regulators of Plant Transpiration by Large-Scale Thermal Imaging Screening in Helianthus Annuus

We provide a method for identifying modulators of foliar transpiration by large-scale screening of a compound library.

זיהוי של הרגולטורים הרומן של דיות צמח על ידי הקרנת הדמיה תרמית בקנה מידה גדול בהליוציץ השנתי

Plant adaptation to biotic and abiotic stresses is governed by a variety of factors, among which the regulation of stomatal aperture in response to water ...

Optical Clearing of Plant Tissues for Fluorescence Imaging

It is challenging to directly observe the internal structure of multi-layered and opaque plant specimens, without dissection, under a microscope. In addition, autofluorescence attributed to chlorophyll hampers the observation of fluorescent proteins in plants. For a long time, various clearing reagents have been used to make plants transparent. However, conventional clearing reagents diminish fluorescent signals; therefore, it has not been possible to observe the cellular and intracellular structures with fluorescent proteins. Reagents were developed that can clear plant tissues by removing chlorophyll while maintaining fluorescent protein stability. A detailed protocol is provided here for the optical clearing of plant tissues using clearing reagents, ClearSee (CS) or ClearSeeAlpha (CSA). The preparation of cleared plant tissues involves three steps: fixation, washing, and clearing. Fixation is a crucial step in maintaining the cellular structures and intracellular stability of fluorescent proteins. The incubation time for clearing depends on the tissue type and species. In Arabidopsis thaliana, the time required for clearing with CS was 4 days for leaves and roots, 7 days for seedlings, and 1 month for pistils. CS also required a relatively short time of 4 days to make the gametophytic leaves of Physcomitrium patens transparent. In contrast, pistils in tobacco and torenia produced brown pigment due to oxidation during CS treatment. CSA reduced the brown pigment by preventing oxidation and could make tobacco and torenia pistils transparent, although it took a relatively long time (1 or 2 months). CS and CSA were also compatible with staining using chemical dyes, such as DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) and Hoechst 33342 for DNA and Calcofluor White, SR2200, and Direct Red 23 for the cell wall. This method can be useful for whole-plant imaging to reveal intact morphology, developmental processes, plant-microbe interactions, and nematode infections.

Here, a method is described for making plant tissues transparent while maintaining the stability of fluorescent proteins. This technique facilitates deep imaging of cleared plant tissues without physical sectioning.

ניקוי אופטי של רקמות צמחים להדמיית פלואורסצנטיות

It is challenging to directly observe the internal structure of multi-layered and opaque plant specimens, without dissection, under a microscope. In ...