Name: protocol for producing three-dimensional infrared video of freezing in plants
Uploaded: 2018-09-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
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この作品は、米国農務省の自社資金によって支えられました。

1. 準備
<ol><li>機器、材料、および記録および植物の凍結のビデオを処理するソフトウェアを収集します。<ol>
<li>で、電源スイッチを設定することによってプログラム可能な冷凍庫を起動し、0 ° C に温度を設定プログラムは、冷凍庫には 1 ° C/時間-8 ° C に達する。</li>
	</ol>
</li>
	<li>1 つ 6 週古いイチゴの植物 2-5 花と冷凍庫に 1 リットル容器で栽培されていたを配置します。</li>
	<li>2 IR カメラ (例えば、FLIR T620 カメラ) を設置固定ストラップと木製の小さなブロックを使用して、レンズの正しい収束角度を生成します。 メモ: 2 台のカメラのレンズの中心のスペースに最適な距離は、一般的に目1または 7 cm 間の距離と同じにすると見なされます。</li>
	<li>10 × 10 cm 研究室ジャックと冷凍庫の中でジャックが集中するイメージを許可する植物に十分に近い位置に両方のカメラをマウントします。垂直方向と水平方向にカメラを調整して植物の同じ部分が両方のカメラから表示されます。ジャックを使用して、垂直方向に全体の植物や土の部分に 2 のイメージが含まれているような方法で両方のカメラを配置します。</li>
	<li>コンピューターの USB コンセントに USB コネクタを使用して 2 台のカメラを接続します。</li>
	<li>植物の継続的な監視を許可する両方のカメラ 2 の A/C コンセントに差し込みます。</li>
</ol>2. コンピューターおよび録音のためのソフトウェアのセットアップ
<ol><li>IR カメラ ソフトウェア 2 のアイコンをダブルクリックしてソフトウェアの 2 つのウィンドウ (カメラごとに 1 ウィンドウ) を開く x。[ヘルプ] メニューの左側のウィンドウで左のカメラと右側のウィンドウで右のカメラを接続する指示に従います。 注: ソフトウェアを使用しての詳細は、[ヘルプ] メニューからアクセスできます。単色パレットは、この例では赤青の 3 D レンダリングの着色を使用しての必要性のために最適です。</li>
	<li>画面キャプチャ ソフトウェアを開くには、プログラムのアイコンをダブルクリックします。クリックし同時に両方のカメラのスクリーン キャプチャを許可する両方のカメラが含まれていますので、フレームをドラッグして取り込み枠を調整します。 注: 両方のカメラからのビデオ ストリームを同時にキャプチャ画面は、それは左と右のビューの完璧な同期を可能にするため重要です。</li>
	<li>ビデオ処理ソフトウェアで簡単に処理 3 h 単位でビデオを記録します。 注: フリーズ イベントの前にいくつかの時間記録することが重要ですので、植物がフリーズを正確を知ることは不可能はないです。セグメントに記録するオプション、このソフトウェアの機能なので、これが 3 時間を記録する設定がお勧め。ソフトウェアは自動的に 3 h の記録を保存し、新しい録音を開始します。3 h 記録用ファイルが自動的に名前の後数値のシーケンスが与えられます。各動画ファイルになります 20 gb 10 からこのサイズの複数のファイルのハード ドライブ上に十分な領域があることがように。</li>
	<li>コント ローラー メニューの実行を選択することにより冷凍庫プログラムを起動し、画面キャプチャを開始します。ウィンドウのRecボタンを押します。キャプチャする画面の領域を示すアウトラインが赤色を確認します。</li>
	<li>イチゴの植物の-8 ° C まで凍結を記録し、1 時間冷凍庫の温度を保持します。</li>
	<li>冷凍庫が +2 ° c. になるまで 2 ° C/h で冷凍庫の温度を上げる録音を停止します。 注: 凍結時間合計は 14 h です。</li>
	<li>目的のファイルを .mp4 フォーマットから .mov ファイル変換ソフトウェアを使用してに変換します。 注: この場合、1 つ以上の凍結イベントを含む単一の 3 h ファイル使用されます。</li>
</ol>3. ビデオ イメージング ソフトウェアを使用してビデオの処理
注: ビデオ イメージング ソフトウェアは、この例で使用されます。ソフトウェアを使用する方法についてのチュートリアルがオンラインあります。この例はソフトウェアの基本的な知識を仮定します。「組成物」、「層」と「レンダー キュー」、と同様、様々 なパネルと、それらの操作方法など用語の理解前提すると。
<ol><li>イメージング ソフトウェアに興味の .mov ファイルをインポートし、プロジェクト パネルの下部にコンポジションアイコンにファイルをドラッグするには、[プロジェクト] パネル内には、任意の場所をダブルクリックします。元動画と同じフォルダーにプロジェクトを保存します。 注: 録画されたビデオはプレビュー ウィンドウに表示されます。</li>
	<li>プレビュー ウィンドウの下部にある関心領域のアイコンをクリックし、カーソルを使用して、左のカメラから記録だけを説明します。</li>
	<li>同じ .mov ビデオを同じビデオの 2 番目のコンポジションを作成するコンポジションアイコンにドラッグします。3.3、手順を繰り返しますが、今回は、右のカメラのみを選択するのにカーソルを使用します。</li>
	<li>コンポジションを選択 > 左側のビューの作物は、関心のある領域にコンプをします。右側のビューに、この手順を繰り返します。左と右であるを示す各構成の名前を変更します。</li>
	<li>それと、組成を選択上部メイン メニューをクリックして左の組成をハイライト表示 >レンダー キューに追加します。</li>
	<li>レンダー キューで出力モジュールをクリックし、ビデオはビデオ (例えば、QuickTime ビデオ) としてレンダリングされるかどうかを確認します。高速レンダリングできるように解像度を下げるレンダリング設定をクリックします。への出力イチゴ左ビデオの名前をクリックし、元の録音や、プロジェクトと同じフォルダーに保存します。保存をクリックし、[レンダリング] パネルの右上で [レンダリング] ボタンをクリックします。</li>
	<li>イチゴ右組成の 3.6 のステップを繰り返します。</li>
	<li>プロジェクト パネルをダブルクリックし、レンダリングされたちょうどイチゴ左とイチゴ右のビデオをインポートします。</li>
	<li>両方のビデオを選択し、プロジェクト パネルの下部にコンポジション アイコンにドラッグします。まだ期間を求めるポップアップ画面、3 h の持続期間のための 5 0 3 を入力します。 注: 両方のビデオは、正確に同期はプロジェクト パネルになるが、コンポジション パネルの最上位のビデオのみが表示されます。</li>
	<li>他のイメージを表示するには、画層をオフに少し眼球をクリックします。カーソルを使用してプレビュー パネルでの画像の回転制御を許可するようにコントロール/Wを押します。カーソルを使用して、オンとオフを最上位のレイヤーをクリックして、上部または両方のイメージは、同じ回転面を確認する底面の回転面を調整します。3 D メガネ サブルーチン内で直接の X および Y 平面を調整します。</li>
	<li>コンポジション パネルの最上位のレイヤーを強調表示および効果を選択 >視点> 上部メニューから3 D メガネ。 注: 3 D のパラメーター メガネ効果ポップアップ表示されますコントロール パネル内。</li>
	<li>コントロール パネルで「左表示」の右側のボックスをクリックして、コントロール パネルは、プロジェクト パネルから分離されていません、プロジェクト パネルの上部にコントロール パネル」タブをクリックします。ドロップ ダウン メニューでコンポジション パネルで 2 の動画を一覧表示、「左ビュー」のリストにビデオをハイライトします。「右側面図」に対してこの手順をを繰り返します。</li>
	<li>、 3 D ビューの右側のボックスで赤青 LRを選択します。</li>
	<li>赤青のメガネを使用すると、プロジェクト パネルの表示を確認します。3 D ビューは、正しいと思われる場合、は、左右を入れ替えをクリックしてみてください。任意のゴーストと目のひずみを除去するためにシーンの収束と垂直方向の配置を調整します。</li>
	<li>ビデオの 3 D の側面が許容される、それをクリックして構成を強調表示し、コンポジションを選択 >レンダー キューに追加手順 3.7 で行われていた。プロジェクト内の他のファイルと同じフォルダーにビデオをレンダリングします。 注: このファイルはかなり大きくなります。ファイルが表示されると、それは再レンダリングされたビデオ処理ソフトウェアを使用してファイル サイズを小さくできます。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Geng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+display+technologies.">Three-dimensional display technologies.</a> Advances in Optics and Photonics. 5, 456-535 (2013).</li><li>Ceccardi, T. L., Heath, R. L., Ting, I. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-temperature+exotherm+measurement+using+infrared+thermography.">Low-temperature exotherm measurement using infrared thermography.</a> HortScience. 30, 140-142 (1995).</li><li>Wimmer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> History of thermal imaging, Security Sales and Integration. , (2011).</li><li>Wisniewski, M., Lindow, S. E., Ashworth, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observations+of+ice+nucleation+and+propagation+in+plants+using+infrared+video+thermography.">Observations of ice nucleation and propagation in plants using infrared video thermography.</a> Plant Physiology. 113, 327-334 (1997).</li><li>Kuprian, E., Tuong, T., Pfaller, K., Livingston, D. P., Neuner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+supercooling+of+reproductive+shoots+is+enabled+by+structural+ice+barriers+being+active+despite+an+intact+xylem+connection.">Persistent supercooling of reproductive shoots is enabled by structural ice barriers being active despite an intact xylem connection.</a> Public Library of Science ONE. 11, e0163160 (2016).</li><li>Livingston, D. P., Tuong, T. D., Murphy, J. P., Gusta, L., Wisniewski, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-definition+infrared+thermography+of+ice+nucleation+and+propagation+in+wheat+under+natural+frost+conditions+and+controlled+freezing.">High-definition infrared thermography of ice nucleation and propagation in wheat under natural frost conditions and controlled freezing.</a> Planta. 247, 791-806 (2017).</li><li>Boyles, R. P., Raman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+climate+patterns+and+trends+in+North+Carolina+(1949-1998).">Analysis of climate patterns and trends in North Carolina (1949-1998).</a> Environment International. 29 (2-3), 263-275 (2003).</li><li>Poling, E. B., Poling, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Managing+Cold+Events.">Managing Cold Events.</a> A Growers' Guide to Production, Economics and Marketing. , 75-97 (2015).</li><li>Hacker, J., Neuner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ice+porpagaion+in+plants+visualized+at+the+tissue+level+by+infrared+differential+thermal+analysis+(IDTA).">Ice porpagaion in plants visualized at the tissue level by infrared differential thermal analysis (IDTA).</a> Tree Physiology. 27, 1661-1670 (2007).</li><li>He, J. Q., Harrison, R. J., Li, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+3D+imaging+system+for+strawberry+phenotyping.">A novel 3D imaging system for strawberry phenotyping.</a> Plant Methods. 13, 93-101 (2017).</li></ol>

著者が明らかに何もありません。

2 つの赤外線カメラがこのプロトコルに必要な彼らは1わずかに異なった角度から被写体を目的とする必要があります。5-8 cm からするレンズが必要になりますが、両方は撮影される被写体の同じ場所を目的とする必要があります。2 カメラのレンズの視聴者の目のための代理の一種と考えます。左のカメラは、左目と右目に右のカメラに似ています。後処理ソフトウェアは赤?...

物理的な 3次元の世界に住んでいるにもかかわらず、研究者は 2次元の視覚的な観測をレポートに制限多い。2 D 画像が重要な情報を伝えるために一般に十分なの深さに関する情報のこの欠乏は感知し、現実世界のオブジェクトの複雑さを理解する当社の能力を制限します。1
深さに関する情報のこの欠乏は、1の初期の 1900 年代以来商業映画産業を中心に 3 D 映像を生成するインセンティブを提供しています。ただし、静止画像およびビデオでクリアな 3 D 情報を生成すると、それらのイメージの作成にかかわる複雑さが原因で妨げられています。3 D 映画を生成する最も簡単な方法は、立体写真で使用の原則に基づきます。立体写真は、脳内で 3 D イメージを伝えるわずかに異なる角度から同じオブジェクトの 2 つの画像を利用しています。これを可能にするために、それぞれの目は (すなわち、左目で左側の画像、右目で右側の画像)、それぞれのイメージでのみ調べる必要があります。目がない当然のことながらこれを行うので、立体の帽子はこの可能な1をように設計されています。いくつか立体 3 D 映画は、赤と緑 (またはシアン) を使用してカラー インター レースまたはアナグリフ メソッドがの開発中に使用されているテクニック、同様偏波インター レース、時間多重とヘッド マウント ・ ディスプレイ技術を表示します。ガラスは、最も簡単なと最も高価な手法の一つです。3 D イメージングと関連する様々 な技術の包括的な見直し、庚1レビューを参照してください。
原則に基づいて監視赤外線サーモグラフィを用いた植物の凍結水がフリーズしたときそれは内部エネルギー2を放棄する必要があります。このエネルギーは電磁スペクトルの赤外領域の検出には、熱の形で。赤外線エネルギーを記録することができるカメラは、1929年3以来使用されています。IR フィルムの植物の凍結技術を使用して最初のパブリッシュされたレポートは、Cecardiらから2、使用するカメラの解像度が、組織の凍結を開始する場所を正確に判断することは困難になります。ウィスニエフ スキーら4には、高解像度のカメラを使用していくつかの植物の氷核生成のより正確なサイトが決定されます。赤外線サーモグラフィの改善に使用される技術が、高い解像度の画像は5と6氷形成の正確な局在を凍結への障壁など発見をもたらした。
IR の被験者を撮影の 1 つの難しさは、温度のわずかな違いが原因です。ほとんどのオブジェクト フィールドのビューを正確にどのオブジェクトは、凍結を決定するが難しく、同じような色になります。これは、葉または小麦6の根など、ある特定の臓器凍結の順序を決定するときに重要です。植物の凍結の IR ビデオを 3 D で描出できた、植物のどの部分は時間の特定の時点で凍結を決定する精度が向上があります。
イチゴは、氷点下の気温が生産者のためかなりの懸念であるアメリカ合衆国の特定の領域での作物です。いくつかの成長の条件の下で、表示平均昨年春の前に 2 〜 3 週間を凍結するイチゴの花が一般的です。凍結イベントは、6 月の後半の花の死でアパラチア山脈7通常結果の一部の地域で発生します。したがって、霜保護です重要なは、これらの対象地域でのイチゴ栽培冷凍イベント。たとえば、ノース カロライナ州のイチゴ栽培する必要があります霜保護平均で 4-6 霜イベント前にブルームと前半 1-2 ハード フリーズ開花期間8の間。凍結耐性は、イチゴの品種を開発するのに役立つ、凍結、氷核形成と植物の他の部分へ伝播のサイトなどのさまざまな側面を理解することが重要です。赤外線サーモグラフィは、これらの問題に対処するための効果的な手段を提供します。
ここでは、イチゴを使用して 3 d アナグリフ法を用いた凍結イベントを記録するための手法を示します。イチゴは、葉と花 3 D 空間が広く分布し、2 D 赤外線映像で表示する場合を区別するために困難にすることができますのでこの例に適しています。

<table><tbody><tr><td>T620 Infrared Camera and software</td><td>FLIR</td><td>55903-5122</td><td>2 cameras are needed. Software works only on a Windows-based computer</td></tr><tr><td>After Effects</td><td>Adobe</td><td>15.0.1.73</td><td>Post-Production Video Editing Software</td></tr><tr><td>Bandicam</td><td>Bandisoft</td><td>4.1.2.1385</td><td>Screen Capture Software</td></tr><tr><td>Laboratory Scissor Jack&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Eisco</td><td>CH0642A</td><td>Steel Platform 13X15 cm</td></tr><tr><td>Fastening Strap</td><td>Velcro</td><td>90441</td><td>To hold camera on jack.&amp;nbsp; Should be at least 60cm long by 2cm wide</td></tr><tr><td>Media Converter</td><td>iSkysoft</td><td>10.0.6</td><td>Software to convert mp4 files to .mov&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

protocol for producing three-dimensional infrared video of freezing in plants

植物の凍結監視できます赤外線 (IR) 水がフリーズしたとき熱を発するため。ただし、色のコントラストの問題難しく 2 次元 (2 D) 赤外線画像やや解釈します。IR イメージまたは 3 次元 (3 D) で凍結植物のビデオを表示すると、氷核生成のためのサイトのより正確な同定だけでなく、凍結の進行でしょう。本稿では、凍結いちごプラントの 3 D 赤外線ビデオを生成する比較的単純な手段を示しています。イチゴは、世界の多くの地域でイベントのフリーズ予期しない春を受ける経済的に重要な作物です。ブリーダーと凍結状態時に植物に損傷を防ぐためにより経済的な方法と栽培イチゴの凍結の正確な理解を提供します。
このテクニックは、冷凍イチゴを映画にわずかに異なる角度で 2 つの赤外線カメラの位置決めを伴います。同時に両方のカメラを記録する画面キャプチャ ソフトウェアを使用して、2 つのビデオ ストリームを正確に同期されます。録音が、イメージング ソフトウェアにインポートできなくなり、アナグリフ技術を使用して処理されます。赤青のメガネを使用すると、3 D 映像がやすく葉の表面に氷核生成の正確なサイトを判別します。

驚いたことに、すべて葉/花が同時に凍結したこと (補足ビデオ 1) 凍結いちごプラントの IR ビデオが示されます。葉と花の両方を個別に異なる温度で凍結したが、葉凍結以前花よりも、高い温度で。さらに、凍結は、葉ではなく、必ずしも各葉の同じ位置で始めた。一方、これらの結果は、イチゴのない以前に記載されている、同様の結果は他の植物種<su...

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Protocol for Producing Three-Dimensional Infrared Video of Freezing in Plants

ここでは、イチゴ植物の 3 つの次元で凍結をイメージするためのプロトコルを提案する.わずかに異なる角度で配置されている 2 台の赤外線カメラを使用して、3 つの次元の植物の凍結を観察する赤青アナグリフ動画を生成します。

植物の凍結の三次元赤外線ビデオを制作するためのプロトコル

Freezing in plants can be monitored using infrared (IR) thermography, because when water freezes, it gives off heat. However, problems with color contrast ...

protocol-for-producing-three-dimensional-infrared-video-freezing

Research

JoVE Journal

Environment

6.1K ビュー.  United States Department of Agriculture and North Carolina State University. ここでは、イチゴ植物の 3 つの次元で凍結をイメージするためのプロトコルを提案する.わずかに異なる角度で配置されている 2 台の赤外線カメラを使用して、3 つの次元の植物の凍結を観察する赤青アナグリフ動画を生成します。

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The Use of High-resolution Infrared Thermography (HRIT) for the Study of Ice Nucleation and Ice Propagation in Plants

Freezing events that occur when plants are actively growing can be a lethal event, particularly if the plant has no freezing tolerance. Such frost events often have devastating effects on agricultural production and can also play an important role in shaping community structure in natural populations of plants, especially in alpine, sub-arctic, and arctic ecosystems. Therefore, a better understanding of the freezing process in plants can play an important role in the development of methods of frost protection and understanding mechanisms of freeze avoidance. Here, we describe a protocol to visualize the freezing process in plants using high-resolution infrared thermography (HRIT). The use of this technology allows one to determine the primary sites of ice formation in plants, how ice propagates, and the presence of ice barriers. Furthermore, it allows one to examine the role of extrinsic and intrinsic nucleators in determining the temperature at which plants freeze and evaluate the ability of various compounds to either affect the freezing process or increase freezing tolerance. The use of HRIT allows one to visualize the many adaptations that have evolved in plants, which directly or indirectly impact the freezing process and ultimately enables plants to survive frost events.

The Use of High-resolution Infrared Thermography HRIT for the Study of Ice Nucleation and Ice Propagation in Plants

Here we present a protocol that allows one to visualize sites of ice formation and avenues of ice propagation in plants utilizing high resolution infrared thermography (HRIT).

植物の氷核と氷伝播の研究のための高解像度赤外線サーモグラフィ（HRIT）の使用

Freezing events that occur when plants are actively growing can be a lethal event, particularly if the plant has no freezing tolerance. Such frost events ...

環境学

RGB and Spectral Root Imaging for Plant Phenotyping and Physiological Research: Experimental Setup and Imaging Protocols

Better understanding of plant root dynamics is essential to improve resource use efficiency of agricultural systems and increase the resistance of crop cultivars against environmental stresses. An experimental protocol is presented for RGB and hyperspectral imaging of root systems. The approach uses rhizoboxes where plants grow in natural soil over a longer time to observe fully developed root systems. Experimental settings are exemplified for assessing rhizobox plants under water stress and studying the role of roots. An RGB imaging setup is described for cheap and quick quantification of root development over time. Hyperspectral imaging improves root segmentation from the soil background compared to RGB color based thresholding. The particular strength of hyperspectral imaging is the acquisition of chemometric information on the root-soil system for functional understanding. This is demonstrated with high resolution water content mapping. Spectral imaging however is more complex in image acquisition, processing and analysis compared to the RGB approach. A combination of both methods can optimize a comprehensive assessment of the root system. Application examples integrating root and aboveground traits are given for the context of plant phenotyping and plant physiological research. Further improvement of root imaging can be obtained by optimizing RGB image quality with better illumination using different light sources and by extension of image analysis methods to infer on root zone properties from spectral data.

An experimental protocol is presented for assessment of soil grown plant root systems with RGB and hyperspectral imaging. Combination of RGB image time series with chemometric information from hyperspectral scans optimizes insights into plant root dynamics.

RGB とスペクトルのルート画像植物表現型解析および生理学的研究: 実験概要およびイメージ投射プロトコル

Better understanding of plant root dynamics is essential to improve resource use efficiency of agricultural systems and increase the resistance of crop ...

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of plant leaves or vertebrate lungs further difficulties arise from multiple transitions in refractive index between cellular components, between cells and airspaces and between the biological tissue and the rest of the optical system. Moreover, refractive index mismatches lead to attenuation of fluorophore excitation and signal emission in fluorescence microscopy. We describe here the application of the perfluorocarbon, perfluorodecalin (PFD), as an infiltrative imaging medium which optically improves laser scanning confocal microscopy (LSCM) sample imaging at depth, without resorting to damaging increases in laser power and has minimal physiological impact2. We describe the protocol for use of PFD with Arabidopsis thaliana leaf tissue, which is optically complex as a result of its structure (Figure 1). PFD has a number of attributes that make it suitable for this use3. The refractive index of PFD (1.313) is comparable with that of water (1.333) and is closer to that of cytosol (approx. 1.4) than air (1.000). In addition, PFD is readily available, non-fluorescent and is non-toxic. The low surface tension of PFD (19 dynes cm-1) is lower than that of water (72 dynes cm-1) and also below the limit (25 - 30 dyne cm-1) for stomatal penetration4, which allows it to flood the spongy mesophyll airspaces without the application of a potentially destructive vacuum or surfactant. Finally and crucially, PFD has a great capacity for dissolving CO2 and O2, which allows gas exchange to be maintained in the flooded tissue, thus minimizing the physiological impact on the sample. These properties have been used in various applications which include partial liquid breathing and lung inflation5,6, surgery7, artificial blood8, oxygenation of growth media9, and studies of ice crystal formation in plants10. Currently, it is common to mount tissue in water or aqueous buffer for live confocal imaging. We consider that the use of PFD as a mounting medium represents an improvement on existing practice and allows the simple preparation of live whole leaf samples for imaging.

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

We describe the use of perfluorodecalin as an infiltrative mounting medium. This is a simple method for improving depth of imaging in Arabidopsis thaliana leaf tissue with minimal physiological impact.

イメージングのための簡単​​な方法シロイヌナズナ浸潤イメージング媒体としてPerfluorodecalinを使って葉

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of ...

生物学

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue patterning. During animal development, key cell proliferation and patterning events occur very quickly. For instance, in Caenorhabditis elegans all cell divisions required for the larval body plan are completed within six hours after fertilization, with seven mitotic cycles1; the sixteen or more mitoses of Drosophila embryogenesis occur in less than 24 hr2. In contrast, cell divisions during plant development are slow, typically on the order of a day 3,4,5 . This imposes a unique challenge and a need for long-term live imaging for documenting dynamic behaviors of cell division and differentiation events during plant organogenesis. Arabidopsis epidermis is an excellent model system for investigating signaling, cell fate, and development in plants. In the cotyledon, this tissue consists of air- and water-resistant pavement cells interspersed with evenly distributed stomata, valves that open and close to control gas exchange and water loss. Proper spacing of these stomata is critical to their function, and their development follows a sequence of asymmetric division and cell differentiation steps to produce the organized epidermis (Fig. 1).
This protocol allows observation of cells and proteins in the epidermis over several days of development. This time frame enables precise documentation of stem-cell divisions and differentiation of epidermal cells, including stomata and epidermal pavement cells. Fluorescent proteins can be fused to proteins of interest to assess their dynamics during cell division and differentiation processes. This technique allows us to understand the localization of a novel protein, POLAR6, during the proliferation stage of stomatal-lineage cells in the Arabidopsis cotyledon epidermis, where it is expressed in cells preceding asymmetric division events and moves to a characteristic area of the cell cortex shortly before division occurs. Images can be registered and streamlined video easily produced using public domain software to visualize dynamic protein localization and cell types as they change over time.

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

We describe a protocol using chamber slides and media to immobilize plant cotyledons for confocal imaging of the epidermis over several days of development, documenting stomatal differentiation. Fluorophore-tagged proteins can be tracked dynamically by expression and subcellular localization, increasing understanding of their possible roles during cell division and cell-type differentiation.

の長期、高分解能共焦点タイムラプスイメージング<em&gt;シロイヌナズナ子葉</em発芽過程&gt;表皮

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, because of laborious and time-consuming protocols that also demand experience in preparation of artifact-free samples, TEM is not considered a user-friendly technique. Traditional sample preparation for TEM used chemical fixatives to preserve cellular structures. High-pressure freezing is the cryofixation of biological samples under high pressures to produce very fast cooling rates, thereby restricting ice formation, which is detrimental to the integrity of cellular ultrastructure. High-pressure freezing and freeze substitution are currently the methods of choice for producing the highest quality morphology in resin sections for TEM. These methods minimize the artifacts normally associated with conventional processing for TEM of thin sections. After cryofixation the frozen water in the sample is replaced with liquid organic solvent at low temperatures, a process called freeze substitution. Freeze substitution is typically carried out over several days in dedicated, costly equipment. A recent innovation allows the process to be completed in three hours, instead of the usual two days. This is typically followed by several more days of sample preparation that includes infiltration and embedding in epoxy resins before sectioning. Here we present a protocol combining high-pressure freezing and quick freeze substitution that enables plant sample fixation to be accomplished within hours. The protocol can readily be adapted for working with other tissues or organisms. Plant tissues are of special concern because of the presence of aerated spaces and water-filled vacuoles that impede ice-free freezing of water. In addition, the process of chemical fixation is especially long in plants due to cell walls impeding the penetration of the chemicals to deep within the tissues. Plant tissues are therefore particularly challenging, but this protocol is reliable and produces samples of the highest quality.

Obtaining high-quality transmission electron microscopy images is challenging, especially in the case of plant cells, which have abundant large water-filled vacuoles and aerated spaces. Tandem high-pressure freezing and quick freeze substitution greatly reduce preparation time of plant samples for TEM while producing samples with excellent ultrastructural preservation.

タンデム高圧凍結および透過型電子顕微鏡のための植物組織の急速凍結置換

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ binding proteins that initiate Ca2+ signaling cascades. However, we still know little about how stimulus specific Ca2+ signals are generated. The specificity of a Ca2+ signal may be attributed to the sophisticated regulation of the activities of Ca2+ channels and/or transporters in response to a given stimulus. To identify these cellular components and understand their functions, it is crucial to use systems that allow a sensitive and robust recording of Ca2+ signals at both the tissue and cellular levels. Genetically encoded Ca2+ indicators that are targeted to different cellular compartments have provided a platform for live cell confocal imaging of cellular Ca2+ signals. Here we describe instructions for the use of two Ca2+ detection systems: aequorin based FAS (film adhesive seedlings) luminescence Ca2+ imaging and case12 based live cell confocal fluorescence Ca2+ imaging. Luminescence imaging using the FAS system provides a simple, robust and sensitive detection of spatial and temporal Ca2+ signals at the tissue level, while live cell confocal imaging using Case12 provides simultaneous detection of cytosolic and nuclear Ca2+ signals at a high resolution.

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Ca2+ signaling regulates diverse biological processes in plants. Here we present approaches for monitoring abiotic stress induced spatial and temporal Ca2+ signals in Arabidopsis cells and tissues using the genetically encoded Ca2+ indicators Aequorin or Case12.

時空のCaを測定する<sup&gt; 2 +</supシロイヌナズナ植物における&gt;シグナル

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ ...

Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the observation of the whole organ with a high spatial- as well as temporal resolution over prolonged periods of time, which may cause photo-toxic effects. This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy, which is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel. The plant is mounted in such a way that the roots are submerged in a liquid medium while the leaves remain in the air. In order to ensure photosynthetic activity of the plant, a custom-made lighting system illuminates the leaves. To keep the roots in darkness the water surface is covered with sheets of black plastic foil. This method allows long-term imaging of plant organ development in standardized conditions.

This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy. The setup is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel and letting it grow in controlled bright conditions. This allows long-term observation of plant organ development in standardized conditions.

ゲルの表面上に成長する植物の根の光シート蛍光顕微鏡

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the ...

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is regulated spatially and temporally. The use of a fluorescent gene under the control of an immunity-related promoter in combination with an automated fluorescence microscopy is a simple way to understand spatiotemporal regulation of plant immunity. In contrast to the root tissues that have been used for a number of various intravital fluorescent imaging experiments, there exist few fluorescent live-imaging examples for the leaf tissues that encounter an array of airborne microbial infections. Therefore, we developed a simple method to mount leaves of Arabidopsis thaliana plants for live-cell imaging over an extended period of time. We used transgenic Arabidopsis plants expressing the yellow fluorescent protein (YFP) genefused to the nuclear localization signal (NLS) under the control of the promoter of a defense-related marker gene, Pathogenesis-Related 1 (PR1). We infiltrated a transgenic leaf with Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (avrRpt2) strain (Pst_a2) and performed in vivo time-lapse imaging of the YFP signal for a total of 40 h using an automated fluorescence stereomicroscope. This method can be utilized not only for studies on plant immune responses but also for analyses of various developmental events and environmental responses occurring in leaf tissues.

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

We report a simple and versatile method for performing fluorescent live-imaging of Arabidopsis thaliana leaves over an extended period of time. We use a transgenic Arabidopsis plant expressing a fluorescent reporter gene under the control of an immunity-related promoter as an example for gaining spatiotemporal understanding of plant immune responses.

シロイヌナズナの取付汎用性の高い方法は、生体のタイムラプス イメージングの葉します。

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is ...

Identification of Novel Regulators of Plant Transpiration by Large-Scale Thermal Imaging Screening in Helianthus Annuus

Plant adaptation to biotic and abiotic stresses is governed by a variety of factors, among which the regulation of stomatal aperture in response to water deficit or pathogens plays a crucial role. Identifying small molecules that regulate stomatal movement can therefore contribute to understanding the physiological basis by which plants adapt to their environment. Large-scale screening approaches that have been used to identify regulators of stomatal movement have potential limitations: some rely heavily on the abscisic acid (ABA) hormone signaling pathway, therefore excluding ABA-independent mechanisms, while others rely on the observation of indirect, long-term physiological effects such as plant growth and development. The screening method presented here allows the large-scale treatment of plants with a library of chemicals coupled with a direct quantification of their transpiration by thermal imaging. Since evaporation of water through transpiration results in leaf surface cooling, thermal imaging provides a non-invasive approach to investigate changes in stomatal conductance over time. In this protocol, Helianthus annuus seedlings are grown hydroponically and then treated by root feeding, in which the primary root is cut and dipped into the chemical being tested. Thermal imaging followed by statistical analysis of cotyledonary temperature changes over time allows for the identification of bioactive molecules modulating stomatal aperture. Our proof-of-concept experiments demonstrate that a chemical can be carried from the cut root to the cotyledon of the sunflower seedling within 10 minutes. In addition, when plants are treated with ABA as a positive control, an increase in leaf surface temperature can be detected within minutes. Our method thus allows the efficient and rapid identification of novel molecules regulating stomatal aperture.

Identification of Novel Regulators of Plant Transpiration by Large-Scale Thermal Imaging Screening in Helianthus Annuus

We provide a method for identifying modulators of foliar transpiration by large-scale screening of a compound library.

ヘリアンサス・アンヌウスにおける大規模な熱画像スクリーニングによる植物蒸散の新規レギュレーターの同定

Plant adaptation to biotic and abiotic stresses is governed by a variety of factors, among which the regulation of stomatal aperture in response to water ...

Optical Clearing of Plant Tissues for Fluorescence Imaging

It is challenging to directly observe the internal structure of multi-layered and opaque plant specimens, without dissection, under a microscope. In addition, autofluorescence attributed to chlorophyll hampers the observation of fluorescent proteins in plants. For a long time, various clearing reagents have been used to make plants transparent. However, conventional clearing reagents diminish fluorescent signals; therefore, it has not been possible to observe the cellular and intracellular structures with fluorescent proteins. Reagents were developed that can clear plant tissues by removing chlorophyll while maintaining fluorescent protein stability. A detailed protocol is provided here for the optical clearing of plant tissues using clearing reagents, ClearSee (CS) or ClearSeeAlpha (CSA). The preparation of cleared plant tissues involves three steps: fixation, washing, and clearing. Fixation is a crucial step in maintaining the cellular structures and intracellular stability of fluorescent proteins. The incubation time for clearing depends on the tissue type and species. In Arabidopsis thaliana, the time required for clearing with CS was 4 days for leaves and roots, 7 days for seedlings, and 1 month for pistils. CS also required a relatively short time of 4 days to make the gametophytic leaves of Physcomitrium patens transparent. In contrast, pistils in tobacco and torenia produced brown pigment due to oxidation during CS treatment. CSA reduced the brown pigment by preventing oxidation and could make tobacco and torenia pistils transparent, although it took a relatively long time (1 or 2 months). CS and CSA were also compatible with staining using chemical dyes, such as DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) and Hoechst 33342 for DNA and Calcofluor White, SR2200, and Direct Red 23 for the cell wall. This method can be useful for whole-plant imaging to reveal intact morphology, developmental processes, plant-microbe interactions, and nematode infections.

Here, a method is described for making plant tissues transparent while maintaining the stability of fluorescent proteins. This technique facilitates deep imaging of cleared plant tissues without physical sectioning.

蛍光イメージングのための植物組織の光学的クリアリング

It is challenging to directly observe the internal structure of multi-layered and opaque plant specimens, without dissection, under a microscope. In ...

植物の凍結の三次元赤外線ビデオを制作するためのプロトコル

要約

さらに動画を探す

この動画の章

植物の氷核と氷伝播の研究のための高解像度赤外線サーモグラフィ（HRIT）の使用

RGB とスペクトルのルート画像植物表現型解析および生理学的研究: 実験概要およびイメージ投射プロトコル

イメージングのための簡単な方法シロイヌナズナ浸潤イメージング媒体としてPerfluorodecalinを使って葉

の長期、高分解能共焦点タイムラプスイメージング

タンデム高圧凍結および透過型電子顕微鏡のための植物組織の急速凍結置換

時空のCaを測定する

ゲルの表面上に成長する植物の根の光シート蛍光顕微鏡

シロイヌナズナの取付汎用性の高い方法は、生体のタイムラプスイメージングの葉します。

ヘリアンサス・アンヌウスにおける大規模な熱画像スクリーニングによる植物蒸散の新規レギュレーターの同定

蛍光イメージングのための植物組織の光学的クリアリング

植物の凍結の三次元赤外線ビデオを制作するためのプロトコル

要約

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植物の氷核と氷伝播の研究のための高解像度赤外線サーモグラフィ（HRIT）の使用

RGB とスペクトルのルート画像植物表現型解析および生理学的研究: 実験概要およびイメージ投射プロトコル

イメージングのための簡単​​な方法シロイヌナズナ浸潤イメージング媒体としてPerfluorodecalinを使って葉

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タンデム高圧凍結および透過型電子顕微鏡のための植物組織の急速凍結置換

時空のCaを測定する

ゲルの表面上に成長する植物の根の光シート蛍光顕微鏡

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蛍光イメージングのための植物組織の光学的クリアリング

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