Este método fornece uma plataforma de alto rendimento para a triagem de Salmonella e Shigella. A principal vantagem dessa técnica é a repetição, específica, sensível e de alta produtividade. Esta técnica combina o método rápido NAAT e a cultura em que a triagem pcr em tempo real foi aplicada primeiro, e depois as positivas foram enviadas para cultura e identificação de bactérias.
Embora este método se concentre na triagem de Salmonella e Shigella, ele também pode ser aplicado a outros patógenos como Vibrios, Staphylococcus, E.Coli e et cetera. A demonstração visual deste método é fundamental, pois a seleção da colônia correta é difícil devido à flora de fundo em amostras. Para começar, adicione três mililitros de caldo de nutrientes a cada amostra.
Em seguida, incubar as amostras a 36 graus Celsius por seis horas. Depois disso, centrifugar a cultura pré-enriquecimento a 800 gs por dois minutos. Em seguida, transfira o supernasal para um novo tubo, e centrífuga-lo novamente por cinco minutos a 12.000 gs.
Depois de descartar o supernascer, adicione 100 microliters de solução de extração de DNA à pelota. Então, vórtice do tubo por um minuto. Em seguida, aqueça a amostra a 1.000 graus Celsius no banho seco.
Depois de repetir a centrifugação, colete o sobrenatante em um novo tubo. Primeiro, crie a mistura de reação e defina o programa de ciclismo de acordo com o protocolo de texto. Em seguida, execute PCR em tempo real em uma máquina PCR fluorescente em tempo real.
Primeiro, adicione 100 microliters da cultura pré-enriquecimento a cinco mililitros de meio de cristal selenita. Em seguida, incubar a cultura a 36 graus Celsius por 18 a 24 horas. Em seguida, colete um laço da cultura e espalhe-o em um prato.
Em seguida, incubar a placa a 36 graus Celsius por 18 a 24 horas. Após a incubação, selecione colônias suspeitas e transfira-as para uma placa. Incubar a placa a 36 graus Celsius por 18 a 24 horas.
Em seguida, identifique a colônia suspeita usando um sistema automatizado de identificação microbiana. Para iniciar a caracterização do O-antígeno, adicione uma gota do sera polivalente de o-antígeno a um slide limpo. Transfira um laço da colônia para o escorregador e moê-lo na sera.
Se as bactérias se parecerem com areia fluindo, repita o tratamento anterior com soro monovalente de O-antígeno até que o antígeno seja caracterizado. Para iniciar a caracterização h-antígeno, adicione uma gota de sera polivalente de h-antígeno a um slide limpo. Então, colecione um loopful da colônia e grid-lo na sera.
Use soro monovalente H-antígeno para repetir o tratamento até que o antígeno H específico seja caracterizado. Para separar a cultura, recolham um laço da cultura pré-enriquecimento e espalhem-na em um prato. Em seguida, incubar o lugar a 36 graus Celsius por 18 a 24 horas.
Após a incubação, colete uma colônia suspeita em um prato. Incubar a placa a 36 graus Celsius por 17 a 24 horas. Em seguida, sujeitar a colônia à identificação bioquímica por meio de um sistema automatizado de identificação microbiana.
Em seguida, aplique uma gota de sera polivalente da espécie Shigella em um slide limpo. Em seguida, use um micro-loop para coletar algumas das bactérias e moê-la na soro. Finalmente, se o sera se assemelha à areia fluindo, use a espécie shigella monovalente sera para caracterizar ainda mais as bactérias.
Usando este protocolo, amostras de fezes de pacientes foram rastreadas para as espécies Salmonella e Shigella. Utilizando PCR em tempo real, houve amplificação bem sucedida no canal HEX, indicando que a amostra foi positiva para as espécies de Salmonella. Outros PCR em tempo real indicaram que a amostra dois foi positiva para Salmonella e foi escolhida para a cultura guiada das espécies de Salmonella.
Na cultura guiada das espécies Salmonella, as colônias rosa e roxa foram banhadas separadamente e submetidas à identificação bioquímica. Os resultados indicaram que as colônias da amostra dois eram Salmonella paratyphi B.Utilizando PCR em tempo real, houve amplificação bem sucedida no canal FAM, indicando que a amostra foi positiva para as espécies de Shigella. Outros PCR em tempo real indicaram que a amostra 10 foi positiva para Shigella e foi escolhida para cultura guiada.
Na cultura guiada das espécies shigella, as colônias rosa-vermelha e incolor foram banhadas separadamente e submetidas à identificação bioquímica. Os resultados indicaram que a amostra 10 continha bactérias Shigella sonnei fase II. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar a limitação do método devido à variação da sequência.
Após esse procedimento, outros métodos, como a cultura direta, podem ser realizados para evitar resultados falsos negativos negativos de PCR em tempo real. Essa técnica abre caminho para pesquisadores no campo da detecção de Salmonella e Shigella, já que o novo protocolo poderia aumentar a taxa positiva em duas vezes e diminuir significativamente a carga de trabalho e a TAT. Não se esqueça que trabalhar com Salmonella e Shigella pode ser extremamente perigoso, e os equipamentos de proteção individual, EPI, devem ser sempre tomados durante a realização deste procedimento.
