توفر هذه الطريقة منصة عالية الإنتاجية لفحص السالمونيلا وشيغيلا. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي التكرار ، محددة ، حساسة ، والإنتاجية عالية. هذه التقنية تجمع بين الأسلوب السريع NAAT والثقافة التي تم تطبيقها في الوقت الحقيقي فحص PCR أولاً، ثم تم إرسال تلك إيجابية لثقافة البكتيريا وتحديد الهوية.
على الرغم من أن هذه الطريقة تركز على فحص السالمونيلا وشيغيلا، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضًا على مسببات الأمراض الأخرى مثل فيبريوس، المكورات العنقودية، الإشريكية القولونية، وهلم جرا. مظاهرة بصرية من هذا الأسلوب أمر بالغ الأهمية كما اختيار مستعمرة الصحيح من الصعب بسبب النباتات الخلفية في العينات. للبدء، إضافة ثلاثة ملليلتر من مرق المغذيات إلى كل عينة.
ثم، احتضان العينات في 36 درجة مئوية لمدة ست ساعات. بعد ذلك، الطرد المركزي ثقافة ما قبل التخصيب في 800 gs لمدة دقيقتين. ثم، نقل المُنَتَكّن إلى أنبوب جديد، والطرد المركزي مرة أخرى لخمس دقائق في 12000 gs.
بعد التخلص من المابير، إضافة 100 ميكرولترات من محلول استخراج الحمض النووي إلى بيليه. ثم، دوامة الأنبوب لمدة دقيقة واحدة. بعد ذلك، قم بتسخن العينة عند 1000 درجة مئوية في الحمام الجاف.
بعد تكرار الطرد المركزي، وجمع عظمى في أنبوب جديد. أولا، إنشاء خليط التفاعل وتعيين برنامج ركوب الدراجات وفقا لبروتوكول النص. ثم، تنفيذ PCR في الوقت الحقيقي على جهاز PCR الفلورسنت في الوقت الحقيقي.
أولاً، أضف 100 ميكرولترات من ثقافة ما قبل التخصيب إلى خمسة ملليلترات من السيلنيت الكريستال المتوسط. ثم، احتضان الثقافة في 36 درجة مئوية لمدة 18 إلى 24 ساعة. بعد ذلك، جمع حلقة واحدة من الثقافة ونشرها على لوحة.
ثم، احتضان لوحة في 36 درجة مئوية لمدة 18 إلى 24 ساعة. بعد الحضانة، حدد المستعمرات المشبوهة ونقلها إلى طبق. احتضان لوحة في 36 درجة مئوية لمدة 18 إلى 24 ساعة.
ثم، تحديد مستعمرة المشبوهة باستخدام نظام التعرف على الميكروبات الآلي. لبدء وصف O-antigen، أضف قطرة واحدة من سيرا بوليفالنت O-antigen إلى شريحة نظيفة. نقل حلقة واحدة من مستعمرة إلى الشريحة وطحن في سيرا.
إذا كانت البكتيريا تبدو وكأنها الرمال المتدفقة، كرر العلاج السابق مع سيرا أحادي التكافؤ O-مستضد حتى يتميز المستضد. لبدء H-antigen التوصيف، إضافة قطرة واحدة من Sera بوليفالنت مستضد H إلى شريحة نظيفة. ثم، وجمع حلقة واحدة من مستعمرة والشبكة في سيرا.
استخدم Sera أحادي التكافؤ من قبل المستضد H-antigen لتكرار العلاج حتى يتميز المستضد H محدد. لفصل الثقافة، وجمع حلقة واحدة من ثقافة ما قبل التخصيب ونشرها على طبق. ثم، احتضان المكان في 36 درجة مئوية لمدة 18 إلى 24 ساعة.
بعد الحضانة، وجمع مستعمرة مشبوهة يبحث على لوحة. احتضان لوحة في 36 درجة مئوية لمدة 17 إلى 24 ساعة. ثم، إخضاع المستعمرة لتحديد البيوكيميائية باستخدام نظام تعريف الميكروبية الآلي.
بعد ذلك، تطبيق قطرة واحدة من الأنواع شيغيلا متعدد التكافؤ سيرا على شريحة نظيفة. ثم، استخدام حلقة صغيرة لجمع بعض البكتيريا وطحنه في سيرا. وأخيرا، إذا يشبه سيرا الرمال المتدفقة، استخدم أنواع شيغيلا أحادية التكافؤ لتزيد من تميز البكتيريا.
باستخدام هذا البروتوكول، تم فحص عينات البراز من المرضى لأنواع السالمونيلا وشيغيلا. وباستخدام نظام PCR في الوقت الحقيقي، كان هناك تضخيم ناجح في قناة HEX، مما يشير إلى أن العينة كانت إيجابية لأنواع السالمونيلا. وأشارت كذلك في الوقت الحقيقي إلى أن العينة الثانية كانت إيجابية بالنسبة إلى السالمونيلا وتم اختيارها لثقافة أنواع السالمونيلا الموجهة.
في الثقافة الموجهة من الأنواع السالمونيلا، كانت مطلية المستعمرات الوردي والأرجواني بشكل منفصل وتخضع لتحديد الكيماويات الحيوية. وأشارت النتائج إلى أن المستعمرات من العينة الثانية هي Salmonella paratyphi B.Using PCR في الوقت الحقيقي، وكان هناك تضخيم ناجح في قناة FAM، مما يشير إلى أن العينة كانت إيجابية لأنواع شيغيلا. وأشارت كذلك في الوقت الحقيقي إلى أن العينة 10 كانت إيجابية بالنسبة لشيغيلا واختيرت لثقافة موجهة.
في الثقافة الموجهة لأنواع شيغيلا، كانت المستعمرات الوردية الحمراء وغير الملونة مطلية بشكل منفصل وتخضع لتحديد الكيماويات الحيوية. وأشارت النتائج إلى أن العينة 10 تحتوي على بكتيريا المرحلة الثانية من شيغيلا. أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم تذكر الحد من الأسلوب بسبب اختلاف التسلسل.
بعد هذا الإجراء، يمكن تنفيذ أساليب أخرى، مثل الثقافة المباشرة، من أجل تجنب نتائج PCR السلبية الخاطئة في الوقت الحقيقي. هذه التقنية تمهد الطريق للباحثين في مجال السالمونيلا والشيغيلا الكشف، كما يمكن أن البروتوكول الجديد زيادة معدل إيجابي بمقدار شقين وانخفاض عبء العمل وTAT بشكل كبير. لا ننسى أن العمل مع السالمونيلا وشيغيلا يمكن أن تكون خطيرة للغاية، ومعدات الحماية الشخصية، والمعدات الشخصية، وينبغي دائما أن تؤخذ أثناء تنفيذ هذا الإجراء.
