Этот метод обеспечивает высокую пропускную способность платформы для скрининга сальмонеллы и шигеллы. Основным преимуществом этой техники является повтор, специфичная, чувствительная и высокая пропускная способность. Этот метод сочетает в себе быстрый метод NAAT и культуру, в которой в режиме реального времени скрининг ПЦР был применен первый, а затем положительные были отправлены для культуры бактерий и идентификации.
Хотя этот метод фокусируется на скрининге сальмонеллы и шигеллы, он также может быть применен к другим патогенным микроорганизмам, таким как Vibrios, Staphylococcus, E.Coli и так далее. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как выбор правильной колонии затруднен из-за фоновой флоры в образцах. Для начала добавьте в каждый образец по три миллилитров питательного бульона.
Затем инкубировать образцы при 36 градусах по Цельсию в течение шести часов. После этого центрифугировать культуру предварительного обогащения на 800 г в течение двух минут. Затем перенесите супернатант в новую трубку и снова центрифуга в течение пяти минут при 12 000 г.
Отбросив супернатант, добавьте в гранулы 100 микролитров раствора для извлечения ДНК. Затем, вихрь трубки в течение одной минуты. Затем нагрейте образец при температуре 1000 градусов по Цельсию в сухой ванне.
Повторив центрифугу, соберите супернатант в новую трубку. Во-первых, создать реакционной смеси и установить велосипедную программу в соответствии с текстовым протоколом. Затем выполните ПЦР в режиме реального времени на флуоресцентной машине ПЦР в режиме реального времени.
Во-первых, добавьте 100 микролитров культуры предварительного обогащения к пяти миллилитров селенитной кристаллической среды. Затем инкубировать культуру при 36 градусах по Цельсию в течение 18-24 часов. Затем соберите одну петлю культуры и выложить ее на тарелку.
Затем инкубировать пластину при 36 градусах по Цельсию в течение 18 до 24 часов. После инкубации выберите подозрительные колонии и перенесите их на тарелку. Инкубировать пластину при 36 градусах по Цельсию в течение 18 до 24 часов.
Затем определите подозрительную колонию с помощью автоматизированной системы идентификации микробов. Чтобы начать характеристику O-антигена, добавьте одну каплю поливалентной сыворотки O-антигена в чистую горку. Перенесите одну петлю колонии на горку и измельчите ее в сере.
Если бактерии выглядят как струящийся песок, повторите предыдущую обработку моновалентной сывороткой O-антигена до тех пор, пока антиген не будет охарактеризован. Чтобы начать характеристику H-антигена, добавьте одну каплю поливалентной сыворотки H-антигена в чистую горку. Затем соберите один цикл колонии и сетки его в сере.
Используйте моновалентную серу H-антигена для повторного лечения до тех пор, пока не будет охарактеризован специфический H-антиген. Чтобы отделить культуру, соберите одну петлю культуры предварительного обогащения и распределив ее на тарелку. Затем, инкубировать место при 36 градусов по Цельсию в течение 18 до 24 часов.
После инкубации соберите подозрительную колонию на тарелку. Инкубировать пластину при 36 градусах по Цельсию в течение 17 до 24 часов. Затем подверги колонию биохимической идентификации с помощью автоматизированной системы идентификации микробов.
Затем нанесите одну каплю поливалентной сыворотки вида Шигелла на чистую горку. Затем используйте микро-петлю, чтобы собрать некоторые бактерии и измельчить его в серу. Наконец, если сера напоминает струящийся песок, используйте моновалентную серу видов Шигелла для дальнейшей характеристики бактерий.
Используя этот протокол, образцы стула у пациентов были проверены на сальмонеллы и шигеллы видов. Используя ПЦР в режиме реального времени, было успешное усиление в канале HEX, что указывает на то, что образец был положительным для видов сальмонеллы. Далее в режиме реального времени ПЦР указал, что образец два был положительным для сальмонеллы и был выбран для управляемых культуры видов сальмонеллы.
В управляемой культуре видов сальмонеллы розовые и фиолетовые колонии покрывались отдельно и подвергались биохимической идентификации. Результаты показали, что колонии из выборки два были Salmonella paratyphi B.Using в режиме реального времени ПЦР, было успешное усиление в канале FAM, что свидетельствует о том, что образец был положительным для видов Шигелла. Далее пЦР в режиме реального времени указал, что образец 10 является положительным для Шигеллы и был выбран для управляемой культуры.
В управляемой культуре видов Шигелла розово-красные и бесцветные колонии покрывались отдельно и подвергались биохимической идентификации. Результаты показали, что в образце 10 содержались бактерии Shigella sonnei фазы II. При попытке этой процедуры важно помнить об ограничении метода из-за изменения последовательности.
Следуя этой процедуре, другие методы, такие как прямая культура, могут быть выполнены, чтобы избежать ложных отрицательных результатов ПЦР в режиме реального времени. Этот метод прокладывает путь для исследователей в области обнаружения сальмонеллы и шигеллы, так как новый протокол может увеличить положительную скорость в два раза и значительно снизить рабочую нагрузку и ТАТ. Не забывайте, что работа с сальмонеллой и шигеллой может быть чрезвычайно опасной, и средства индивидуальной защиты, PPE, всегда должны быть приняты при выполнении этой процедуры.
