שיטת זיהוי זו המבוססת על ננו-מולקולות הוכיחה את הפוטנציאל לאפיין פיזית ולזהות מולקולות בודדות. עבודה עם חלקיקי מתכת, שהיא מטרת הסרטון הזה, מאתגרת את הבנתנו מה מגביל את הדיוק והדיוק של המדידה. היתרון העיקרי של טכניקה זו היא כי מנגנון זה יש רוחב פס גדול יותר מאשר הגדרת זיכרון bilayer השומנים המסורתית, אשר מאפשר לנו לראות תוצאות מהירות יותר ותגובות נוספות nanopore.
טכניקה זו התאפשרה משום שבתחילת שנות התשעים הוכח כי גת בננו-נקבוביות חלבון, כלומר מעבר בין מצבים שונים, ניתן לשלוט ומולקולות יכולות להיקשר לקיר הנקבוביות. טכניקה זו מפותחת עבור יישומים מסחריים של ריצוף DNA מכיוון שהיא משתמשת בדגימות מינימליות. היא אינה דורשת תוויות פלואורסצנטיות ומשתמשת באורכים ארוכים בהרבה של קריאה מאשר שיטות קונבנציונליות.
טכניקה זו פותחה גם כדי להפלות בין פולימרים בהתבסס על גודלם עם דיוק ומהירות גדולים יותר מאשר אלקטרופורזה ג'ל כרומטוגרפיה. ראשית, להכין 500 מיליליטר של פתרון של נתרן כלורי טוחן אחד ו 10 מילימולר מונוסודיום פוספט במים אולטרה פלור כמו אלקטרוליט. מומלץ להשתמש בפתרונות ודוגמאות טריים עם הגדרה מסוימת זו.
בנוסף, מצאנו כי מים deionized באיכות גבוהה חשוב מאוד עבור בהצלחה להרכיב ממברנות. לאחר מכן, לשלב מיליגרם אחד של אבקת S.aureus אלפא המוליסין מונומרית מסוג ליופילים עם מיליליטר אחד של מים אולטרה-אפורים. אל תשכח כי עבודה עם Staph aureus אלפא המולין רעלן חלבון יכול להיות מסוכן.
בצע את אמצעי הזהירות ב- MSDS בעת ביצוע הליך זה. לאחר מכן, להכין ארבעה מיליליטר של חמישה מיליגרם למיליליטר DPhyPC ב endecaine בבקבוקון זכוכית scintillation. מכסים את הבקבוקון בכובע מצופה פוליטראפלואורואתילן ומאחסנים אותו בארבע מעלות צלזיוס עד חודש.
לאחר מכן, להמיס 57.6 מיליגרם של 12-phosphotungstic חומצה לחות ב 10 מיליליטר של האלקטרוליט כדי להפוך פתרון פוליוקסומט שני מילימולרית. חלק את פתרון ה-POM לשתי מנות של חמישה מיליליטר. השתמש בשלושה טוחנות נתרן הידרוקסיד כדי להתאים את ה- pH של פתרון POM אחד ל 5.5.
כדי להתחיל להתכונן לבדיקה, להרכיב את תא הבדיקה של מנגנון אלקטרופיזיולוגיה bilayer שומנים פלינארית. ראשית, יש לגרד חוט כסף עם נייר זכוכית של 600 חצץ ולהשרות אותו באקונומיקה מסחרית מבוססת נתרן hypochlorite במשך 10 דקות כדי להפוך את האלקטרודה חוט כלוריד כסף כסף. יש לשטוף ולייבש את אלקטרודה התיל לפני החדרתה לתוך נימי הקוורץ של המנגנון.
שמור את האלקטרודה בתוך קרום קוורץ ננופור, או QNM, הפרדת נימי והמאגר. ואז למקם גלילי כסף כסף כלוריד גלולה אלקטרודה רכוב על חוט כסף במאגר. חבר את שתי האלקטרודות ללוח מעגלי המגבר.
לאחר מכן, פתח את תוכנית רכישת הנתונים והתחל את אספקת החשמל באפס מילי-וולט. ודא שלא זוהה זרם DC בין האלקטרודות בתא הריק. במהלך הדגמה זו חשוב לראות כיצד הלחץ המשדר יכול להשפיע על היווצרות הממברנה ועל היווצרות הננו-פורר לאחר מכן.
מבלי לעשות את שני השלבים האלה נכון, הניסויים לא יעבדו. טען כמיליליטר של אלקטרוליט לתוך מזרק וחבר אותו לקו הנוזלים המחובר למאגר. הוסף אלקטרוליט למאגר עד שפנים של ה- QNM שקועים, כפי שמצוין על ידי הזרם היוני בין האלקטרודות הרוויות את המגבר.
אם המגבר אינו רווי, שחרר את ה- QNM על ידי הפעלת מתח פופ של פלוס או מינוס וולט אחד או הגדלת הלחץ נימי בכ -300 מילימטרים של כספית. השתמש בשתי הטכניקות במידת הצורך. לאחר שהמגבר רווי, מוציאים אלקטרוליט מהמאגר עד שרמות הפתרון יורדות מתחת ל- QNM, כפי שמצוין על ידי הזרם שחוזר לאפס.
כדי להתחיל את תהליך היווצרות bilayer השומנים, להעלות את רמת פתרון האלקטרוליטים הרבה מעל הפנים של QNM ולציין כמה פתרון לקח. לאחר מכן טובלים טיפ פיפט של 10 מיקרוליטר בתת פתרון DPHyPC וציירו את כל השומנים הנראים לעין לתוך הקצה. לגעת בקצה של פיפטה אל פני השטח של פתרון האלקטרוליטים ולאפשר השומנים לזרום מן פיפטה על פני ממשק האוויר-מים.
המתן שתיים עד חמש דקות עד ששומנים יתפשטו באופן אחיד על פני הפתרון. לאחר מכן, לאט למשוך את האלקטרוליט עד פני השטח של הפתרון הוא מתחת QNM ולאחר מכן לאט להוסיף מספיק אלקטרוליט כדי להעלות את הפתרון מעל QNM כדי ליצור את קרום bilayer השומנים בידוד. אם bilayer אינו נוצר לאחר שלושה ניסיונות, להחיל חלק אחר של השומנים כפי שתואר קודם לכן ולחזור על התהליך.
לאחר bilayer נראה שנוצר, להגביר את הלחץ נימי פופ bilayer ולאחר מכן רפורמה זה על ידי הורדת לאט והעלאת רמת הפתרון באותו אופן כמו קודם. חזור על תהליך זה מספר פעמים כדי להבטיח שה- QNM לא יהיה סתום ונוצר bilayer. לאחר מכן, להפשיר aliquot של חלבון אלפא המולין על קרח או בטמפרטורת החדר.
מלאו את המאגר ב-250 ננוגרם חלבון אלפא המוליטסין מונומרי וכ-250 מיקרוליטרים של מים אולטרה-אפורים. לאחר מכן, להחיל הטיה 200 כדי 400 מילי וולט כדי לגרום היווצרות נקבוביות. כדי להקל על היווצרות הנקבוביות, להגדיל את הלחץ נימי על ידי 40 עד 200 מילימטרים של כספית כדי להרחיב את bilayer מן QNM.
לאחר צורות nanopore, להפחית את ההטיה להחיל על מתח המדידה ולהפחית את הלחץ על כמחצית לחץ הכניסה. כדי להתחיל בבדיקה, הסתגל מחדש למתח היסט DC כדי להבטיח שאין זרם נמדד כאשר הפוטנציאל המוחל מוגדר לאפס. לאחר מכן, לרכוש עקבות זרם יוני עבור פוטנציאל מיושם של 120 כדי שלילי 120 millivolts ביחס למאגר.
אשר כי אין מזהמים, אשר יצוין על ידי מצור זרם ספונטני. הוסף 1 עד 6 מיקרוליטר של פתרון אשכול POM pH 5.5 שני מילימולר למאגר. החל מדידות סדרות זמן של זרם יוני במתח מיושם של 120 מילי-וולט שליליים.
התנועה של מולקולות חומצה זרחנית איניונית בודדת דרך תעלת אלפא המואליסין ייצרה מחסומים ארעיים שהקטינו את הזרם היוני הנקבוביות הפתוחות הממוצע בכ -80%משך הזמן זרם המצור קשורים ישירות לאינטראקציה של חלקיקים-נקבוביות, ומאפשרים להבדיל בין מינים יוניים בהיסטוגרמות של יחסי עומק המצור היחסיים. ב pH 5.5, שתי פסגות נצפו עם יחסי עומק של כ 0.06 ו 0.16. בהתבסס על NMR זרחני, הפסגה הקטנה הייתה מין הזרחן שישה מינוס והפסגה העיקרית הייתה המינים שבעה מינוס.
ב-pH 7.5, הריכוזים היחסיים עברו ליחס גבוה יותר של המינים 6 מינוס למינים של שבעה מינוס. הירידה של פי 20 באירועי המצור ביחס ל-pH 5.5 יוחסה להשפלה ליונים חופשיים של פוספטים ותונגסטאטים. התאמת הפצות זמן המגורים דרשה פונקציות מעריכיות מרובות, המציין סוגים מרובים של אינטראקציות חלקיקים-נקבוביות בתוך כל מין יוני.
זמני המגורים הקצרים יותר ב- pH 7.5 הציעו אינטראקציות חלקיקים-נקבוביות חלשות יותר מאשר pH 5.5, בקנה אחד עם מחקרים קודמים המראים שינויים תלויי pH במספר היחסי של חיובים קבועים הלומן ערוץ המולין אלפא או ליד. מים שעברו דה-מיון בטוהר גבוה הם קריטיים להגדרה המסוימת הזו. מחסנית סינון אורגנית שהוצאה הייתה הגורם הסביר לכך שהמעבדה שלנו לא הצליחה ליצור ממברנות ב- QNMs במשך חודשים.
אנשים חדשים לגרסה מסוימת זו של השיטה עשויים גם להיאבק כי הממברנות הם כל כך קטנים ויש טריק כדי לקבל nanopores להיווצר. שיטה זו, אשר החלה לפני כמה עשורים, הוכיח שימושי לניתוח יונים, חומצות גרעין, פולימרים סינתטיים, כמו גם ריצוף DNA. זה יכול גם למצוא יישומים בביופיזיקה וביולוגיה בסיסית של התא.
לדוגמה, הליך זה יכול לשמש לחקר המאפיינים הפיזיקליים של פולימרים סינתטיים וביופולימרים כדי לחקור את גודלם, אינטראקציות עם מולקולות אחרות, ושאלות חשובות אחרות.
