Этот метод обнаружения на основе нанопора продемонстрировал потенциал для физической характеристики и идентификации отдельных молекул. Работа с металло-наночастицами, что является целью этого видео, бросает вызов нашему пониманию того, что ограничивает точность и точность измерений. Основным преимуществом этой техники является то, что этот аппарат имеет большую пропускную способность, чем традиционные липидные двуслойные настройки памяти, что позволяет нам видеть более быстрые результаты и больше реакций в нанопорах.
Этот метод стал возможен, потому что в начале 1990-х годов было показано, что gating в белковых нанопорах, то есть, переключение между различными состояниями, можно контролировать и молекулы могут связываться с стеной поры. Этот метод разрабатывается для коммерческих приложений для секвенирования ДНК, поскольку он использует минимальные образцы. Он не требует флуоресцентных меток и использует гораздо больше длины чтения, чем обычные методы.
Этот метод также был разработан для различения полимеров на основе их размера с большей точностью и скоростью, чем гель электрофорез и хроматография. Во-первых, подготовить 500 миллилитров раствора одномолярного хлорида натрия и 10-миллимолярный фосфат натрия в ультрапурной воде в качестве электролита. Лучше всего использовать свежие решения и образцы с этой конкретной настройки.
Кроме того, мы обнаружили, что высококачественная деионизированная вода очень важна для успешного формирования мембран. Затем смешайте один миллиграмм лиофилизированного мономерного альфа-гемолитического порошка дикого типа S.aureus с одним миллилитром ультрачистой воды. Не забывайте, что работа со стафилококком альфа-гемолизин токсин белка может быть опасным.
Следуйте мерам предосторожности в MSDS при выполнении этой процедуры. Затем приготовьте четыре миллилитров по пять миллиграммов на миллилитр DPhyPC в эндекаине в стеклянном сцинтилляционном флаконе. Крышка флакон с полиэтиленовой подкладкой крышкой и хранить его при четырех градусах по Цельсию на срок до месяца.
После этого растворите 57,6 миллиграммов 12-фосфотунгститового кислотного гидрата в 10 миллилитров электролита, чтобы сделать двухмилимолярный полиоксометатный раствор. Разделите раствор POM на две пятими миллилитровые части. Используйте трехмолярный гидроксид натрия для регулировки рН одного раствора POM до 5,5.
Чтобы начать подготовку к тесту, соберите испытательную клетку планарного липидного двухслойного электрофизиологического аппарата. Во-первых, абраде серебряной проволоки с 600-песчаной наждачной бумагой и замочить его в коммерчески доступных гипохлорит на основе отбеливателя на 10 минут, чтобы сделать серебряно-серебряный хлорид проволоки электрода. Промыть и высушить проволочный электрод, прежде чем вставить его в кварцевой капилляр аппарата.
Храните электрод внутри кварцево-нанопорной мембраны, или ЗНМ, разделяя капилляр и резервуар. Затем поместите цилиндрический серебристо-серебряный хлоридный электрод, установленный на серебряной проволоке, в резервуар. Подключите оба электрода к плате усилителя.
Далее откройте программу сбора данных и запустите энергоснабжение на нулевом милливольте. Подтвердите, что между электродами в пустой клетке не обнаружен ток постоянного тока. Во время этой демонстрации важно наблюдать, как транскапильярионое давление может повлиять на образование мембран и последующее образование нанопор.
Без правильного выполнения этих двух шагов эксперименты не будут работать. Загрузите около одного миллилитра электролита в шприц и соедините его с линией жидкости, подключенной к резервуару. Добавьте электролит в резервуар до тех пор, пока лицо НМ не будет погружено в воду, о чем свидетельствует ионный ток между электродами, насыщающих усилитель.
Если усилитель не насыщается, раскатать ННМ, применяя поп-напряжение плюс-минус один вольт или увеличивая капиллярное давление примерно на 300 миллиметров ртути. При необходимости используйте оба метода. После того, как усилитель насыщается, вывести электролит из резервуара до тех пор, пока уровень раствора падает ниже НМ, о чем свидетельствует ток, возвращающийся к нулю.
Чтобы начать процесс формирования липидного двухслойного раствора, поднимите уровень раствора электролита значительно выше лица ННМ и обратите внимание на то, сколько раствора потребовалось. Затем окуните 10-микролитровый наконечник пипетки в раствор DPHyPC и нарисуйте все видимые липиды в кончик. Прикоснитесь к кончику пипетки к поверхности электролитного раствора и позвольте липипиду течь из пипетки через воздушно-водный интерфейс.
Подождите две-пять минут, пока липид равномерно распределится по раствору. Затем медленно свяжайте электролит до тех пор, пока поверхность раствора не будет ниже НМ, а затем медленно добавляйте достаточно электролита, чтобы поднять раствор над НМ, чтобы сформировать изоляционные липидные двуслойные мембраны. Если билейзер не формируется после трех попыток, нанесите другую порцию липидов, как описано ранее, и повторите процесс.
После того, как двуслойный, кажется, сформировались, увеличить давление на капилляр, чтобы поп bilayer, а затем реформировать его, медленно снижая и поднимая уровень раствора таким же образом, как и раньше. Повторите этот процесс несколько раз, чтобы убедиться, что НМ не засоряется и образовался билейер. Далее оттаивать алицит альфа-гемолизин белка на льду или при комнатной температуре.
Заполните резервуар 250 нанограммами мономерного альфа-гемолитического белка и около 250 микролитров ультрачистой воды. Затем нанесите уклон от 200 до 400 милливольт, чтобы вызвать образование пор. Для облегчения формирования пор, увеличить капиллярного давления на 40 до 200 миллиметров ртутного столба, чтобы расширить билейер от йНМ.
После того, как нанопор формы, уменьшить применяется отношение к измерению напряжения и уменьшить давление примерно до половины давления вставки. Чтобы начать тест, скорректируете напряжение DC-offset, чтобы убедиться, что нет измеренного тока, когда применяемый потенциал установлен на ноль. Затем приобрети след ионной тока для прикладного потенциала от 120 до отрицательных 120 милливольт по отношению к резервуару.
Подтвердите, что нет никаких загрязняющих веществ, о которых свидетельствуют спонтанные нынешние блокады. Добавьте к резервуару от одного до шести микролитров рН 5,5 двухмилимолярный кластерный раствор POM. Применение ионных текущих измерений тайм-ряда при прикладном напряжении отрицательных 120 милливольт.
Движение отдельных анионных молекул фосфотунговой кислоты через альфа-гемолитический канал производило переходные блокады, которые уменьшили средний открытый поры ионный ток примерно на 80% Продолжительность и блокадный ток напрямую связаны с взаимодействием частиц и пор, что позволяет дифференцировать ионные виды в гистограммах относительных коэффициентов глубины блокады. При рН 5,5 наблюдались два пика с коэффициентами глубины около 0,06 и 0,16. Основываясь на фосфорных ЯМР, незначительный пик был шесть см. фосфотунгот видов и основной пик был семь с минусом видов.
При рН 7.5 относительные концентрации сместились к более высокому соотношению 6-минус видов к семи-минус видам. 20-кратное снижение числа событий блокады по сравнению с рН 5,5 объясняется деградацией свободных фосфатов и ионов вольфсударства. Установка распределения времени проживания требовала нескольких экспоненциальных функций, указывающих на несколько типов взаимодействий частиц и пор в каждом ионной категории.
Более короткое время пребывания при рН 7.5 предложило более слабые взаимодействия частиц и пор, чем рН 5.5, в соответствии с предыдущими исследованиями, показывающими рН-зависимые изменения в относительном количестве фиксированных зарядов в люмене альфа-гемолизина или вблизи него. Высокой чистоты деионизированной воды имеет решающее значение для этой конкретной настройки. Оттраченный картридж фильтра органики был вероятной причиной того, что наша лаборатория была не в состоянии сформировать мембраны на хм в течение нескольких месяцев.
Индивидуалы новые к этой определенной версии метода могли также бороться потому что мембраны настолько малы и выходка к получать nanopores сформировать. Этот метод, который был начат несколько десятилетий назад, оказался полезным для анализа ионов, нуклеиновых кислот и синтетических полимеров, а также секвенирования ДНК. Он также может найти применение в биофизике и биологии основных клеток.
Например, эта процедура может быть использована для изучения физических свойств синтетических полимеров и биополимеров для исследования их размера, взаимодействия с другими молекулами и других важных вопросов.
