Diese nanoporbasierte Detektionsmethode hat das Potenzial gezeigt, einzelne Moleküle physikalisch zu charakterisieren und zu identifizieren. Die Arbeit mit Metallo-Nanopartikeln, die der Zweck dieses Videos ist, stellt unser Verständnis dessen in Frage, was die Genauigkeit und Präzision der Messung einschränkt. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass dieses Gerät eine größere Bandbreite als herkömmliche Lipid-Bilayer-Speicher-Setup hat, die uns schnellere Ergebnisse und mehr Reaktionen in Nanoporen sehen lässt.
Diese Technik wurde ermöglicht, weil Anfang der 1990er Jahre gezeigt wurde, dass Das Gating in Protein-Nanoporen, d.h. das Wechseln zwischen verschiedenen Zuständen, gesteuert werden kann und Moleküle an die Porenwand binden können. Diese Technik wird für kommerzielle DNA-Sequenzierungsanwendungen entwickelt, da sie minimale Proben verwendet. Es erfordert keine fluoreszierenden Etiketten und verwendet viel längere Leselängen als herkömmliche Methoden.
Diese Technik wurde auch entwickelt, um Polymere basierend auf ihrer Größe mit größerer Genauigkeit und Geschwindigkeit als Gelelektrophorese und Chromatographie zu unterscheiden. Bereiten Sie zunächst 500 Milliliter einer Lösung aus einmolarem Natriumchlorid und 10-Millimolar-Mononatriumphosphat in Reinstwasser als Elektrolyt vor. Es ist am besten, frische Lösungen und Proben mit diesem speziellen Setup zu verwenden.
Darüber hinaus stellten wir fest, dass hochwertiges entionisiertes Wasser sehr wichtig ist, um erfolgreich Membranen zu bilden. Als nächstes kombinieren Sie ein Milligramm lyophilisiertes Monomeric-S.aureus-Alpha-Hämolysinpulver mit einem Milliliter Reinstwasser. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Staph aureus alpha Hämolysin-Toxin-Protein gefährlich sein kann.
Befolgen Sie bei diesem Verfahren die Vorsichtsmaßnahmen im MsDS. Als nächstes bereiten Sie vier Milliliter von fünf Milligramm pro Milliliter DPhyPC in Endecain in einer Glasszintillationsdurchstechflasche vor. Die Durchstechflasche mit einer mit Polytetrafluorethylen gefütterten Kappe kappen und bis zu einem Monat bei vier Grad Celsius lagern.
Danach 57,6 Milligramm 12-Phosphotungssäurehydrat in 10 Milliliter des Elektrolyten auflösen, um eine zweimillimolarle Polyoxometalat-Lösung zu bilden. Teilen Sie die POM-Lösung in zwei Fünf-Milliliter-Portionen auf. Verwenden Sie dreimolares Natriumhydroxid, um den pH-Wert einer POM-Lösung auf 5,5 einzustellen.
Um mit der Vorbereitung auf den Test zu beginnen, montieren Sie die Testzelle eines planaren Lipid-Bilayer-Elektrophysiologiegeräts. Zuerst einen Silberdraht mit 600-Grit-Schleifpapier abschleifen und in handelsübliche Natriumhypochlorit-basierte Bleichmittel für 10 Minuten einweichen, um die Silber-Silber-Chlorid-Drahtelektrode herzustellen. Spülen und trocknen Sie die Drahtelektrode, bevor Sie sie in die Quarzkapillare des Geräts einsetzen.
Bewahren Sie die Elektrode in der Quarz-Nanopore-Membran (QNM) auf und trennen Sie die Kapillare und das Reservoir. Dann legen Sie eine zylindrische Silber-Silber-Chlorid-Pellet-Elektrode auf einem Silberdraht im Reservoir montiert. Schließen Sie beide Elektroden an die Verstärkerplatine an.
Öffnen Sie anschließend das Datenerfassungsprogramm und starten Sie das Netzteil bei null Millivolt. Vergewissern Sie sich, dass zwischen den Elektroden in der leeren Zelle kein Gleichstrom erkannt wird. Während dieser Demonstration ist es wichtig zu beobachten, wie sich der transkapillare Druck auf die Membranbildung und die anschließende Nanoporenbildung auswirken kann.
Ohne diese beiden Schritte richtig zu machen, werden die Experimente nicht funktionieren. Laden Sie etwa einen Milliliter Elektrolyt in eine Spritze und schließen Sie sie an die mit dem Reservoir angeschlossene Flüssigkeitsleitung an. Fügen Sie Elektrolyt in das Reservoir, bis die Fläche des QNM untergetaucht ist, wie durch den Ionenstrom zwischen den Elektroden, die den Verstärker sätten, angezeigt wird.
Wenn der Verstärker nicht sättigt, entstopft das QNM, indem sie eine Popspannung von plus oder minus einem Volt anbringen oder den Kapillardruck um etwa 300 Millimeter Quecksilber erhöhen. Verwenden Sie bei Bedarf beide Techniken. Sobald der Verstärker gesättigt ist, ziehen Sie Elektrolyt aus dem Reservoir, bis die Lösungspegel unter das QNM fallen, wie durch den Strom angegeben, der auf Null zurückkehrt.
Um den Lipid-Bilayer-Bildungsprozess zu beginnen, heben Sie den Elektrolytlösungspegel weit über das Gesicht des QNM und beachten Sie, wie viel Lösung das benötigte. Dann tauchen Sie eine 10-Mikroliter-Pipettenspitze in die DPHyPC-Lösung und ziehen Sie alle sichtbaren Lipide in die Spitze. Berühren Sie die Spitze der Pipette an die Oberfläche der Elektrolytlösung und lassen Sie das Lipid von der Pipette über die Luft-Wasser-Schnittstelle fließen.
Warten Sie zwei bis fünf Minuten, bis sich das Lipid gleichmäßig über die Lösung ausbreitet. Als nächstes ziehen Sie den Elektrolyten langsam zurück, bis sich die Oberfläche der Lösung unterhalb des QNM befindet, und fügen Sie dann langsam genug Elektrolyt hinzu, um die Lösung über dem QNM zu erhöhen, um die isolierende Lipid-Bilayer-Membran zu bilden. Wenn sich die Bilayerin nach drei Versuchen nicht bildet, wenden Sie einen anderen Teil des Lipids wie zuvor beschrieben an und wiederholen Sie den Vorgang.
Sobald sich der Zweischichter gebildet zu haben scheint, erhöhen Sie den Druck auf die Kapillare, den Doppelton zu knallen und ihn dann zu reformieren, indem Sie das Lösungsniveau langsam senken und auf die gleiche Weise wie zuvor erhöhen. Wiederholen Sie diesen Vorgang mehrmals, um sicherzustellen, dass das QNM nicht verstopft ist und sich eine Bilayergebildethatgebildet hat. Als nächstes tauen Sie ein Aliquot von Alpha-Hämolysin-Protein auf Eis oder bei Raumtemperatur auf.
Füllen Sie das Reservoir mit 250 Nanogramm monomerem Alpha-Hämolysin-Protein und etwa 250 Mikroliter Reinstwasser. Wenden Sie dann eine 200 bis 400 Millivolt Bias an, um die Porenbildung zu induzieren. Um die Porenbildung zu erleichtern, erhöhen Sie den Kapillardruck um 40 bis 200 Millimeter Quecksilber, um die Doppelschicht aus dem QNM zu erweitern.
Sobald sich eine Nanopore bildet, reduzieren Sie die angewendete Verzerrung auf die Messspannung und reduzieren Sie den Druck auf etwa die Hälfte des Einführdrucks. Um mit dem Test zu beginnen, richten Sie die DC-Offsetspannung neu, um sicherzustellen, dass kein gemessener Strom vorhanden ist, wenn das angewendete Potential auf Null gesetzt ist. Als nächstes erhalten Sie eine ionenische Stromspur für ein angewendetes Potential von 120 bis negative 120 Millivolt relativ zum Reservoir.
Bestätigen Sie, dass es keine Verunreinigungen gibt, die durch spontane Stromblockaden angezeigt werden. Fügen Sie dem Reservoir einen bis sechs Mikroliter pH 5,5-POM-Clusterlösung mit zwei Millimolaren hinzu. Wenden Sie ionische Stromreihenmessungen bei einer angelegten Spannung von negativen 120 Millivolt an.
Die Bewegung einzelner anionischer Phosphotungssäuremoleküle durch den Alpha-Hämolysinkanal erzeugte transiente Blockaden, die den mittleren offenporischen Ionenstrom um etwa 80% verringerten Der Dauer- und Blockadestrom stehen in direktem Zusammenhang mit der Partikel-Poren-Wechselwirkung, so dass ionische Arten in Histogrammen der relativen Blockadetiefenverhältnisse unterschieden werden können. Bei pH 5,5 wurden zwei Spitzen mit Tiefenverhältnissen von etwa 0,06 und 0,16 beobachtet. Basierend auf Phosphor NMR, der kleine Höhepunkt war die sechs-Minus-Phosphowolframat-Arten und der hauptgipfel war die Sieben-Minus-Arten.
Bei pH 7,5 verlagerten sich die relativen Konzentrationen auf ein höheres Verhältnis der 6-Minus-Arten zu den Sieben-Minus-Arten. Der 20-fache Rückgang der Blockadeereignisse im Vergleich zu pH 5,5 wurde auf den Abbau freier Phosphat- und Wolframationen zurückgeführt. Die Anpassung der Verweilzeitverteilungen erforderte mehrere exponentielle Funktionen, die mehrere Arten von Partikel-Pore-Wechselwirkungen innerhalb jeder ionischen Spezies anzeigten.
Die kürzeren Verweilzeiten bei pH 7,5 deuteten auf schwächere Partikel-Pore-Wechselwirkungen als pH 5,5 hin, die mit früheren Studien übereinstimmen, die pH-abhängige Veränderungen in der relativen Anzahl der fixen Ladungen in oder in der Nähe des Alpha-Hämolysinkanallumens zeigen. Hochreines deionisiertes Wasser ist für diese spezielle Einrichtung von entscheidender Bedeutung. Eine verbrauchte Bio-Filterpatrone war die wahrscheinliche Ursache dafür, dass unser Labor monatelang keine Membranen auf den QNMs bilden konnte.
Personen, die neu in dieser speziellen Version der Methode könnte auch kämpfen, weil die Membranen so klein sind und es einen Trick gibt, Nanoporen zu bilden. Diese Methode, die vor mehreren Jahrzehnten ins Leben gerufen wurde, hat sich für die Analyse von Ionen, Nukleinsäuren und synthetischen Polymeren sowie für die DNA-Sequenzierung als nützlich erwiesen. Es könnte auch Anwendungen in der Biophysik und grundlegenden Zellbiologie finden.
Beispielsweise kann dieses Verfahren verwendet werden, um die physikalischen Eigenschaften von synthetischen Polymeren und Biopolymeren zu untersuchen, um ihre Größe, Wechselwirkungen mit anderen Molekülen und andere wichtige Fragen zu untersuchen.
