Cette méthode de détection à base de nanopore a démontré le potentiel de caractériser et d’identifier physiquement les molécules individuelles. Travailler avec metallo-nanoparticules, qui est le but de cette vidéo, est difficile de notre compréhension de ce qui limite la précision et la précision de la mesure. Le principal avantage de cette technique est que cet appareil a une plus grande bande passante que la mémoire de bicouche lipidique traditionnelle mise en place, ce qui nous permet de voir des résultats plus rapides et plus de réactions dans nanopore.
Cette technique a été rendue possible parce qu’au début des années 1990, il a été démontré que le gating dans les nanopores protéiques, c’est-à-dire le passage d’un état à l’autre, peut être contrôlé et que les molécules peuvent se lier à la paroi poreuse. Cette technique est en cours de développement pour les applications commerciales de séquençage de l’ADN parce qu’elle utilise un minimum d’échantillons. Il ne nécessite pas d’étiquettes fluorescentes et utilise des longueurs de lecture beaucoup plus longues que les méthodes conventionnelles.
Cette technique a également été développée pour discriminer entre les polymères en fonction de leur taille avec une plus grande précision et vitesse que l’électrophoresis gel et la chromatographie. Tout d’abord, préparer 500 millilitres d’une solution de chlorure de sodium mono molaire et 10 millimolaires de phosphate monosodique dans l’eau ultrapure que l’électrolyte. Il est préférable d’utiliser des solutions et des échantillons frais avec cette mise en place particulière.
En outre, nous avons constaté que l’eau déionisée de haute qualité est très importante pour former avec succès des membranes. Ensuite, combinez un milligramme de poudre monomère monmérique lyophilisée de type sauvage S.aureus alpha hémolysine avec un millilitre d’eau ultrapure. N’oubliez pas que travailler avec staph aureus alpha protéine toxine à l’hémolysine peut être dangereux.
Suivez les précautions du MSDS lors de l’exécution de cette procédure. Ensuite, préparez quatre millilitres de cinq milligrammes par millilitre DPhyPC en endecaine dans un flacon de scintillation en verre. Capez le flacon avec un bouchon doublé de polytétrafluoroéthylène et rangez-le à quatre degrés Celsius jusqu’à un mois.
Après cela, dissoudre 57,6 milligrammes d’hydrate d’acide phosphotungstique 12 en 10 millilitres de l’électrolyte pour faire une solution polyoxométalate de deux millimolaires. Divisez la solution POM en deux portions de cinq millilitres. Utilisez de l’hydroxyde de sodium trois molaire pour ajuster le pH d’une solution POM à 5,5.
Pour commencer à préparer le test, assemblez la cellule d’essai d’un appareil d’électrophysiologie de bicouche lipidique planaire. Tout d’abord, abradez un fil d’argent avec du papier de verre de 600 grains et trempez-le dans de l’eau de Javel à base d’hypochlorite de sodium disponible dans le commerce pendant 10 minutes pour fabriquer l’électrode de fil de chlorure argenté-argent. Rincer et sécher l’électrode métallique avant de l’insérer dans le capillaire à quartz de l’appareil.
Gardez l’électrode à l’intérieur de la membrane quartz-nanopore, ou QNM, séparant le capillaire et le réservoir. Placez ensuite une électrode cylindrique de granulés de chlorure argent-argent montée sur un fil d’argent dans le réservoir. Connectez les deux électrodes au circuit de l’amplificateur.
Ensuite, ouvrez le programme d’acquisition de données et démarrez l’alimentation électrique à zéro millivolts. Confirmez qu’aucun courant de DC n’est détecté entre les électrodes de la cellule vide. Au cours de cette démonstration, il est important de voir comment la pression transcapillaire peut avoir un impact sur la formation de membranes et la formation subséquente de nanopores.
Sans faire ces deux étapes correctement, les expériences ne fonctionnent pas. Chargez environ un millilitre d’électrolyte dans une seringue et connectez-le à la ligne fluide reliée au réservoir. Ajouter de l’électrolyte au réservoir jusqu’à ce que la face du QNM soit submergée, comme l’indique le courant ionique entre les électrodes saturant l’amplificateur.
Si l’amplificateur ne sature pas, désagorger le QNM en appliquant une tension pop de plus ou moins un volt ou en augmentant la pression capillaire d’environ 300 millimètres de mercure. Utilisez les deux techniques si nécessaire. Une fois que l’amplificateur sature, retirez l’électrolyte du réservoir jusqu’à ce que les niveaux de solution descendent en dessous du QNM, comme indiqué par le courant revenant à zéro.
Pour commencer le processus de formation de cale lipidique, augmenter le niveau de solution d’électrolyte bien au-dessus de la face du QNM et noter combien de solution qui a pris. Puis trempez une pointe de pipette de 10 microlitres dans la solution DPHyPC et dessinez tous les lipides visibles dans la pointe. Touchez la pointe de la pipette à la surface de la solution d’électrolyte et laissez le lipide s’écouler de la pipette à travers l’interface air-eau.
Attendez deux à cinq minutes pour que le lipide se propage uniformément à travers la solution. Ensuite, retirez lentement l’électrolyte jusqu’à ce que la surface de la solution soit inférieure au QNM, puis ajoutez lentement suffisamment d’électrolyte pour soulever la solution au-dessus du QNM pour former la membrane isolante de la bicouche lipidique. Si la bicouche ne se forme pas après trois tentatives, appliquer une autre partie du lipide comme décrit précédemment et répéter le processus.
Une fois que la bicouche semble s’être formée, augmenter la pression sur le capillaire pour faire éclater la bicouche, puis la réformer en abaissant lentement et en élevant le niveau de solution de la même manière qu’avant. Répétez ce processus plusieurs fois pour vous assurer que le QNM n’est pas obstrué et qu’une bicouche s’est formée. Ensuite, décongelez un aliquot de protéines alpha hémolysine sur la glace ou à température ambiante.
Remplissez le réservoir de 250 nanogrammes de protéines monomériques d’hémolysine alpha et d’environ 250 microlitres d’eau ultrapure. Ensuite, appliquez un biais de 200 à 400 millivolts pour induire la formation de pores. Pour faciliter la formation des pores, augmenter la pression capillaire de 40 à 200 millimètres de mercure pour étendre la calotte du QNM.
Une fois qu’un nanopore se forme, réduisez le biais appliqué à la tension de mesure et réduisez la pression à environ la moitié de la pression d’insertion. Pour commencer le test, réajustez la tension de décalage DC pour vous assurer qu’il n’y a pas de courant mesuré lorsque le potentiel appliqué est défini à zéro. Ensuite, acquérir une trace de courant ionique pour un potentiel appliqué de 120 à 120 millivolts négatifs par rapport au réservoir.
Confirmer qu’il n’y a pas de contaminants, ce qui serait indiqué par des blocages spontanés du courant. Ajouter un à six microlitres de solution de cluster POM de 5,5 à 5,5 milli molaires au réservoir. Appliquer des mesures de séries iniques actuelles à une tension appliquée de 120 millivolts négatifs.
Le mouvement des molécules individuelles d’acide phosphotungstique anionique à travers le canal alpha hémolysine a produit des blocages transitoires qui ont diminué le courant ionique moyen à pore ouvert d’environ 80%La durée et le courant de blocus sont tous deux directement liés à l’interaction particule-pore, permettant aux espèces ioniques d’être différenciées dans les histogrammes des rapports relatifs de profondeur de blocus. Au pH 5,5, deux pics ont été observés avec des ratios de profondeur d’environ 0,06 et 0,16. D’après le phosphore NMR, le pic mineur était l’espèce phosphotungstate de six moins et le pic principal était l’espèce de sept moins.
Au pH 7,5, les concentrations relatives sont passées à un ratio plus élevé de l’espèce de 6 moins à l’espèce de sept moins. La diminution de 20 fois des événements de blocus par rapport au pH 5.5 a été attribuée à la dégradation aux ions libres de phosphate et de tungstate. L’ajustement des distributions de temps de résidence a exigé de multiples fonctions exponentielles, indiquant plusieurs types d’interactions particule-pore au sein de chaque espèce ionique.
Les temps de résidence plus courts au pH 7.5 ont suggéré des interactions particule-pore plus faibles que le pH 5.5, conformément aux études antérieures montrant des changements dépendant du pH dans le nombre relatif de charges fixes dans ou près du lumen alpha de canal d’hémolysine. L’eau déionisée de haute pureté est essentielle pour cette mise en place particulière. Une cartouche de filtre organique dépensée a été la cause probable de notre laboratoire étant incapable de former des membranes sur les QNMs pendant des mois.
Les individus nouveaux à cette version particulière de la méthode pourraient également lutter parce que les membranes sont si petites et il ya une astuce pour obtenir nanopores à former. Cette méthode, qui a été lancée il y a plusieurs décennies, s’est avérée utile pour analyser les ions, les acides nucléiques et les polymères synthétiques ainsi que le séquençage de l’ADN. Il pourrait également trouver des applications en biophysique et en biologie cellulaire de base.
Par exemple, cette procédure peut être utilisée pour étudier les propriétés physiques des polymères synthétiques et des biopolymères pour étudier leur taille, leurs interactions avec d’autres molécules et d’autres questions importantes.
