Ce protocole est significatif car l’optimisation du développement et le transfert des protocoles d’immunofluorescence multiplexe sont complexes et difficiles. Pour de nombreux laboratoires, la prise d’un protocole optimisé est inestimable. L’immunofluorescence multispectrale nous permet d’évaluer à la fois l’emplacement et l’identité de plusieurs types de cellules dans et autour de la tumeur.
Il s’agit d’une puissante combinaison d’informations dans les études d’oncologie immunitaire. L’utilisation la plus convaincante pour l’immunofluorescence multiplexe est l’oncologie immunitaire. Mais la capacité d’arpenter plusieurs types de cellules immunitaires en setu peut être exploitée à travers toutes les thérapies auto-immunes et inflammatoires.
Connaître l’emplacement et le phénotype des cellules immuno dans et autour des cellules solidual est à la fois des réponses pronostiques et prévisibles à l’immunothérapie spécifique à la tumeur. L’optimisation et la validation du protocole sont des étapes clés qui ne doivent pas être précipitées. Les nouveaux développeurs devraient se familiariser avec les nouveaux types d’artefacts associés à l’imagerie multispectrale.
Pour localiser le protocole multi-plex de base, préchargez-le sur le stainer automatisé. Filtre pour tous au lieu de preferred’on l’écran du protocole. Avant d’apporter des modifications enregistrer le protocole d’origine et cliquez sur l’onglet protocoles, et cliquez à droite Opal 6 Multiplex pour sélectionner copie.
Changez le nom en 7 Multiplex Protocol 1'in the new window et sélectionnez l’onglet associé à l’appareil correct. Faire correspondre le protocole dans le tableau supplémentaire S1'and click ajouter reagent pour ajouter une étape d’inhibition paroxidies de dix minutes, en sélectionnant l’inhibiteur de la peroxidase comme le reagent. Confirmez que les étapes de blocage utilisent un tampon bloquant l’inhibiteur de la kinase protéique, que chaque anticorps primaire fait référence au reagent approprié, que les étapes secondaires anticorps utilisent un polymère de peroxyde de raifort et que le dapi spectral fourni avec le kit d’automatisation multispectrale est utilisé.
Assurez-vous que le protocole contient l’inhibiteur de la peroxyde, suivi de six taches séquentielles contenant chacune une étape de blocage des protéines, un anticorps primaire, un anticorps secondaire, un plancher de tyramide, puis une récupération d’antigène pour enlever les anticorps. Pour ajouter les commandes de drop, copiez le nom 7 Multiplex Protocol 1'name et changez-le en 7 Multiplex Protocol 1 CD68 Drop. Modifiez le réaccente anticorps CD68 en Mouse IgG et enregistrez le protocole.
Ensuite, créez six nouveaux protocoles, un pour chaque contrôle de chute, et un pour le contrôle complet de type iso de la même manière. Établis un protocole de contrôle de la chute pour chaque cible de la même manière que je vous l’ai montré ici. Pour préparer une trousse de détection de recherche, remplissez le récipient ouvert de 30 millilitres marqué pour la solution saline tamponnée 1X tris avec saline tamponnée 1X tris, et placez le conteneur dans la position la plus éloignée de la poignée dans le kit de recherche Multiplex 1.
Étiquetez deux récipients ouverts de 30 millilitres muli-spectral block’and multi-spectral secondaire, et remplissez le récipient de bloc mutli-spectral avec 30 millilitres d’anticorps tampon bloquant diluant du kit de coloration multispectrale. Remplissez le récipient secondaire multispectral de 30 millilitres de polymère anticorps secondaire anti-souris anti-souris du kit de coloration multispectrale et ajoutez 600 microlitres diluants anticorps à chacun des dix contenants ouverts de 7 millilitres. Ensuite, ajoutez l’anticorps primaire concentré aux tubes appropriés dans les volumes indiqués dans le tableau, et mélangez par pipetting doux.
Ajouter 3 millilitres d’eau distillée double, plus 12 gouttes de dapi spectral dans un récipient ouvert de 7 millilitres, et 3 millilitres de bloc de peroxidase dans un deuxième récipient ouvert de 7 millilitres. Suspendre à nouveau chaque plancher liathalisé avec 75 microlitres de sulfure de diméthyle et mélanger au pipetage. Ensuite, conservez les stocks de plancher d’amplification du signal tyramide à 4 degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils soient prêts.
Tout en préparant les dilutions individuelles de plancher de TSA. Enregistrez tous les reagents sur l’auto-stainer, puis placez chaque conteneur dans un rack de réaccage et chargez tous les reagents sur le stainer automatisé. Le stainer détectera la présence et confirmera le volume de chaque reagent.
Une fois que tous les reagents ont été chargés, activez le protocole pour exécuter pendant la nuit. À la fin de la procédure de coloration, montez les échantillons avec des feuillets de couverture et chargez les échantillons dans le scanner de plate-forme d’imagerie multispectrale pour la numérisation. Lorsque tous les échantillons ont été scannés, les images seront formatées sous forme de fichiers qptiff.
Ouvrez un logiciel d’analyse qptiff approprié, et cliquez sur slide’toboggan pour ouvrir une analyse de diapositives entière de cinq filtres de la diapositive d’intérêt. Connectez-vous et utilisez l’outil timbre pour sélectionner cinq régions pour l’imagerie multispectrale. Sous Sélectionnez pour : sélectionnez Acquisition’under Size in Fields : sélectionnez 1x1 et sous Field resolution’select 0.5 micromètres 20x.
Basé sur cette coloration de cytokératine sélectionnez plusieurs régions avec le tissu positif de tumeur de cytokeratin, et le tissu stromal négatif de cytokeratin à l’image du balayage global. Lorsque toutes les images multispectrales ont été sélectionnées, passez au logiciel Vectra et modifiez la tâche de l’imagerie scan’to multispectrale pour chaque diapositive. Ensuite, cliquez sur l’analyse pour effectuer la collection d’imagerie multispectrale.
Lorsque l’acquisition d’images multispectrales est terminée, utilisez le logiciel spectral de dé mixage pour ouvrir des fichiers dans le dossier d’image multispectrale. Sous format d’image’select multi-spectral’Under sample format’select fluorescence’And under Spectral Library Source’select inForm’To select the floors, select and load all six floors, and dapi from the sample library slides, and click prepare all. Le logiciel spectral de non-mélange effectuera le démixage spectral sur toutes les images ouvertes à l’aide des profils spectraux fournis.
Identifier et annoter le profil spectral auto-fluorescent. Assurez-vous de vérifier la fonction auto-fluorescente pour vous assurer qu’elle est complètement capturée dans le canal auto-fluorescent après le non-mélange et pour tester différents échantillonnages jusqu’à ce qu’elle soit enlevée de façon acceptable. Ensuite, évaluez le modèle de coloration par rapport aux taches chromogènes simples de la même cible dans les diapositives séquentielles du même tissu avec un pathologiste.
Pour évaluer l’intensité de fluorescence de chaque canal, utilisez l’outil de dénombrement pour sonder les images ouvertes. Ensuite, revenez au protocole de coloration et ajustez la concentration de la TSA pour répondre aux dénombrements normalisés qui dépassent ou n’atteignent pas la plage acceptable. Dans cette analyse représentative le tissu d’amygdale a démontré une coloration clairement définie de cytokeratin dans la surface d’amygdale, épithélium squamous sans fond dans le tissu lymphoïde avec la cytokeratine et la coloration PDL-1 apparente dans l’épithélium réticulé des cryptes.
Les centres germinaux folliculaires étaient facilement reconnaissables et riches en lymphocytes positifs Ki-67. Les macrophages présents dans les centres germinaux ont été identifiés par leur expression CD-68 avec quelques macrophages également observés à l’extérieur du centre germinal. Lymphocytes tachés de CD-8 avec une distribution de cellule T et l’expression de PD-1 fortement souillés petits lymphocytes groupés à la périphérie du centre germinal, aussi bien que dispersés dans la région interfollicular.
Après que le modèle prévu de coloration ait été confirmé dans le contrôle de tissu d’amygdale, la même coloration pourrait alors être évaluée dans un échantillon de cancer de poumon. Les contrôles négatifs de l’isotype et les contrôles des gouttes devraient également être évalués; non seulement pour la détection de l’arrière-plan et de l’auto fluorescence, mais aussi pour les effets de parapluie et les saignements spectraux. Les contrôles de chute sont importants pour évaluer les artefacts potentiels dans la coloration en raison de la méthode d’immunofluorescence multi-plex lors de l’optimisation d’un nouveau panneau multi-plex.
Chaque commande de chute doit montrer le même modèle de coloration que le panneau multi-plex complet, à l’exception de l’anticorps primaire unique qui doit être enlevé sur chaque commande spécifique. Le profilage immuno avec immunofluorescence multispectrale permet la stratification des tumeurs et des régions par des critères immunitaires qui peuvent ensuite être étudiés par des études génomiques, transcriptomiques et protéomiques massivement multiplexes. J’ai utilisé l’immunofluorescence multi-plex pour étudier les mécanismes d’action en oncologie et les troubles auto-immunitaires qui permet l’identification et la caractérisation des cellules immunitaires et pathogènes dans une seule section en setu.
Des précautions générales doivent être prises lorsque l’on travaille avec des anticorps contre les protéines humaines, le tyramide et le dapi, mais aucun reagent ou matériau de ce protocole n’est connu pour être particulièrement dangereux.
