Multiks immünfloresans protokollerinin geliştirilmesi ve transferi karmaşık ve zorlu olduğundan bu protokol önemlidir. Birçok laboratuvar için optimize edilmiş bir protokolün toe tutması paha biçilmezdir. Multi-spektral immünofloresans, tümörün içinde ve çevresinde birden fazla hücre tipinin hem yerini hem de kimliğini değerlendirmemizi sağlar.
Bu bağışıklık onkolojisi çalışmalarında bilginin güçlü bir kombinasyonudur. Multipleks immünoresans için en zorlayıcı kullanımı immün onkoloji olduğunu. Ama setu birden fazla bağışıklık hücresi tipleri anket yeteneği tüm oto-immün ve inflamatuar tedaviler arasında kaldıraçlı olabilir.
Solidual hücrelerin içinde ve çevresinde immün hücrelerin yerini ve fenotip bilmek tümörspesifik immünoterapi hem prognostik ve öngörülebilir tepkiler. Protokolün optimizasyonu ve doğrulanması aceleye alınmaması gereken önemli adımlardır. Yeni geliştiriciler multi-spektral görüntüleme ile ilgili eserler yeni tür kendilerini tanımak gerekir.
Baz çoklu pleks protokolünü bulmak için otomatik lekeleyiciye önceden yükleyin. Protokol ekranında tercih edilen 'yerine' için filtre uygulayın. Değişiklik yapmadan önce özgün protokolü kaydedin ve protokoller sekmesini tıklatın ve kopyayı seçmek için Opal 6 Multiplex'e sağ tıklayın.
Yeni pencerede adı 7 Multiplex Protocol 1'in olarak değiştirin ve doğru aygıtla ilişkili sekmeyi seçin. Ek tablo S1'de protokolü eşleştirin ve reaktif olarak peroksidaz inhibitörü seçerek, on dakikalık paroksidies inhibisyonu adım eklemek için reaktif ekleyin.' Engelleme adımları bir protein kiaz inhibitörü engelleme tampon kullanmak onaylamak, her birincil anti-vücut uygun reaktif anlamına gelir, ikincil anti-vücut adımları bir horseradish peroksidaz polimer kullanmak ve multi-spektral otomasyon kiti ile sağlanan spektral dapi kullanılır.
Protokol peroksidaz inhibitörü içerdiğinden emin olun, altı ardışık boyama her bir protein engelleme adımı içeren çalışır, birincil bir anti-vücut, ikincil bir anti-vücut, bir Tiramid zemin, ve sonra antijen alma anti-organları kaldırmak için. Bırakma denetimlerini eklemek için 7 Multiplex Protocol 1'name'i kopyalayın ve 7 Multiplex Protocol 1 CD68 Drop olarak değiştirin. CD68 anti-body reaktifini Mouse IgG olarak değiştirin ve protokolü kaydedin.
Ardından, her bırakma denetimi için bir tane ve aynı şekilde tam iso tipi denetim için bir tane olmak üzere altı yeni protokol daha oluşturun. Her hedef için, burada size gösterdiğim gibi bir bırakma kontrol protokolü yapın. Bir araştırma algılama kiti hazırlamak için, 1X tris tamponlu tuzlu için işaretlenmiş 30 mililitrelik açık kabı 1X tris-tamponlu tuzlu ile doldurun ve kabı Multiplex Araştırma Kiti 1'deki tutamaçtan en uzak konuma yerleştirin.
Etiket iki 30 mililitre açık kaplar muli-spektral blok've multi-spektral ikincil, ve çok spektral Boyama Kiti tampon antikor dilüent engelleme 30 mililitre ile mutli-spektral blok konteyner doldurun. Multi-spektral Boyama Kiti anti-Mouse anti-kuduz ikincil antikor polimer 30 mililitre ile multi-spektral ikincil konteyner doldurun ve on 7 mililitre açık kaplar her 600 mikrolitre antikor dilüent ekleyin. Daha sonra, masada belirtilen hacimlerde uygun tüpler konsantre birincil antikor ekleyin ve nazik pipetleme ile karıştırın.
Bir 7 mililitrelik açık konteyner içine çift distile su 3 mililitre, artı spektral dapi 12 damla ekleyin ve ikinci bir 7 mililitre açık konteyner içine peroksidaz blok 3 mililitre. 75 mikrolitre dimetil sülfoksit ile her liathalize zemini yeniden askıya alın ve pipetleme ile karıştırın. Daha sonra, Tyramide sinyal amplifikasyon zemin stokları hazır olana kadar 4 santigrat derece saklayın.
Bireysel TSA zemin seyreltmelerini hazırlarken. Tüm reaktifleri otomatik boya makinesine kaydedin, ardından her bir kabı bir reaktif rafına yerleştirin ve tüm reaktifleri otomatik boya makinesine yükleyin. Lekeleyici varlığı algılar ve her reaktifin hacmini onaylar.
Tüm reaktifler yüklendikten sonra, gece boyunca çalışacak protokolü etkinleştirin. Boyama işleminin sonunda, numuneleri kapak fişleri ile monte edin ve numuneleri tarama için Multi-Spectral Görüntüleme Platformu Tarayıcısına yükleyin. Tüm örnekler tarandığında, görüntüler qptiff dosyaları olarak biçimlendirilir.
Uygun bir qptiff analiz yazılımı programı açın ve ilgi slayt beş filtre tüm slayt tonu açmak için yük slayt'ı tıklatın. Giriş yapın ve çoklu spektral görüntüleme için beş bölge seçmek için damga aracını kullanın. Için Seç:Fields'da Acquisition'under Boyut'u seçin:1x1'i seçin ve Alan çözünürlüğü'nin altında 0,5 mikrometre 20x' seçin.
Bu sitokatin boyama dayanarak hem sitokeratin pozitif tümör dokusu ile çeşitli bölgeler seçin, ve sitoratin negatif stromal doku genel talan dan görüntülenecek. Tüm çok spektral görüntüler seçildiğinde, Vectra yazılımına geçin ve her slayt için görevi taramaya ve çoklu spektral görüntülemeye'ye değiştirin. Ardından, çoklu spektral görüntüleme koleksiyonunu gerçekleştirmek için tbm'yi tıklatın.
Çok spektral görüntü edinimi tamamlandığında, çok spektral görüntü klasöründeki dosyaları açmak için spektral karıştırma yazılımı kullanın. Resim formatı altında'select multi-spectral'Under sample format'select floresan'Ve Altında Spektral Kütüphane Kaynak'select inForm'To zeminseçin ve altı katı seçin ve yükleyin ve örnek kitaplık slaytlarından dapi ve tümünü hazırlayın. Spektral karıştırma yazılımı sağlanan spektral profilleri kullanarak tüm açık görüntülerin spektral unmixing gerçekleştirecektir.
Otomatik floresan spektral profili tanımlayın ve açıklama ekine belirtin. Karıştırmadan sonra otomatik floresan kanalda tamamen yakalandığından emin olmak ve kabul edilebilir bir şekilde çıkarılana kadar farklı örneklemeleri test etmek için otomatik floresan özelliğini kontrol ettiğinizden emin olun. Daha sonra aynı hedefin kromojenik tek lekeleri karşı boyama deseni bir patolog ile aynı dokunun sıralı slaytlar üzerinde değerlendirin.
Her kanalın floresan yoğunluğunu değerlendirmek için, açık görüntüleri incelemek için sayımaracını kullanın. Ardından, boyama protokolüne dönün ve Kabul edilebilir aralığı aşan veya ulaşamayan normalleştirilmiş sayımları giderecek Şekilde TSA konsantrasyonuna ayarlayın. Bu temsili analizde bademcik dokusu bademcik yüzeyinde açıkça tanımlanmış sitokatin boyama, sitokatin ile lenfoid dokuda arka plan olmadan skuamöz epitel ve kriptoların retiküle epitel belirgin PDL-1 boyama gösterdi.
Foliküler germinal merkezleri kolayca tanınabilir ve Ki-67 pozitif lenfositler açısından zengindi. Germinal merkezlerinde bulunan makrofajlar CD-68 ekspresyonu ile saptandı ve germinal merkezinin dışında da bazı makrofajlar gözlendi. T-hücre dağılımı ve PD-1 ekspresyonu ile CD-8 lekeli lenfositler güçlü mikrop merkezinin çevresinde kümelenmiş küçük lenfositler lekeli, yanı sıra interfolliküler bölgeye dağılmış.
Bademcik dokusu kontrolünde beklenen boyama paterni doğrulandıktan sonra, aynı boyama akciğer kanseri örneğinde değerlendirilebilir. İzotip negatif kontroller ve düşme kontrolleri de değerlendirilmelidir;sadece arka plan ve otomatik floresan tespiti için değil, aynı zamanda şemsiye etkileri ve spektral kanama için de. Damla kontrolleri, yeni bir multi-plekspanelin optimizasyonu sırasında çok pleksli immünoresans yöntemi nedeniyle boyama potansiyel eserlerinin değerlendirilmesi için önemlidir.
Her damla kontrolü tam multi-pleks panel olarak aynı boyama deseni göstermelidir, her özel kontrol üzerinde kaldırılmalıdır tek birincil antikor dışında. Multi-spektral immünoreskence ile immün profilleme daha sonra kitlesel multipleks genomik, transkripsiyonik ve proteomik çalışmalar ile araştırılabilir bağışıklık kriterleri ile tümörlerin ve bölgelerin tabakalaşması için izin verir. Onkoloji ve otoimmün bozukluklarda etki mekanizmalarını araştırmak için çok pleksli immünororesans kullandım.
İnsan proteinleri, Tiramid ve dapi'ye karşı antikorlarla çalışırken genel önlemler alınmalıdır, ancak bu protokolde hiçbir reaktif veya malzemenin özellikle tehlikeli olduğu bilinmemektedir.
