هذا البروتوكول مهم لأن تطوير الأمثل ونقل بروتوكولات متعددة الفلوروسينات المناعية معقدة وصعبة. بالنسبة للعديد من المختبرات عقد ااسم من بروتوكول الأمثل لا تقدر بثمن. يسمح لنا الفلور المناعية متعددة الأطياف بتقييم كل من موقع وهوية أنواع الخلايا المتعددة في الورم وحوله.
هذا هو مزيج قوي من المعلومات في دراسات الأورام المناعية. الاستخدام الأكثر إقناعًا للفلوروسة المناعية المتعددة هو الأورام المناعية. ولكن يمكن الاستفادة من القدرة على مسح أنواع متعددة من الخلايا المناعية في سيتو عبر جميع العلاجات المناعية الذاتية والتهابات.
معرفة موقع ونمط الظاهري من الخلايا المناعية في وحول الخلايا الصلبة على حد سواء الردود التنبؤية ويمكن التنبؤ بها للعلاج المناعي الورم محددة. إن تحسين البروتوكول والتحقق منه هما خطوتان رئيسيتان لا ينبغي استعجالها. وينبغي للمطورين الجدد التعرف على أنواع جديدة من القطع الأثرية المرتبطة التصوير متعدد الأطياف.
لتحديد موقع بروتوكول قاعدة متعددة plex تحميلها مسبقا على تلطيخ الآلي. تصفية الكل'1 بدلاً من المفضل'ً على شاشة البروتوكول. قبل إجراء تغييرات حفظ البروتوكول الأصلي وانقر فوق علامة التبويب البروتوكولات، وانقر بزر الماوس الأيمن فوق أوبال 6 Multiplex لتحديد نسخة.
تغيير الاسم إلى 7 بروتوكول 1 متعددة في إطار جديد وحدد علامة التبويب المقترنة مع الجهاز الصحيح. تطابق البروتوكول في الجدول التكميلي S1'، وانقر فوق إضافة كاشف لإضافة خطوة تثبيط paroxidies دقيقة عشر، واختيار مثبطات البيروكسيديز كما الكاشف. تأكد من أن خطوات الحجب تستخدم حاجز منع مثبطات كيناز البروتين، أن كل المضادة للجسم الأولية يشير إلى الكاشف المناسب، أن الخطوات المضادة للجسم الثانوية استخدام البوليمر بيروكسيديز الفجل وأن الدابي الطيفي المقدمة مع مجموعة الأتمتة متعددة الطيفية يستخدم.
تأكد من أن البروتوكول يحتوي على مثبطات البيروكسيديز، تليها ستة تلطيخ متتابعة كل منهما يحتوي على خطوة حجب البروتين، ومضادة للجسم الأولية، ومضادة للجسم الثانوية، وأرضية التيراميد، ثم استرجاع المستضد لإزالة الأجسام المضادة. لإضافة عناصر تحكم الإفلات، انسخ اسم بروتوكول 1'1 المتعدد 7، ثم قم بتغييره إلى 7 Multix Protocol 1 CD68 إسقاط. تغيير كاشف المضادة للجسم CD68 إلى IgG ماوس وحفظ البروتوكول.
ثم قم بإنشاء ستة بروتوكولات جديدة أخرى، واحد لكل عنصر تحكم إسقاط، وواحد لتحكم ISO-نوع كامل بنفس الطريقة. قم بعمل بروتوكول تحكم لكل هدف بنفس الطريقة التي أريتك بها هنا لإعداد مجموعة الكشف عن الأبحاث، قم بتعبئة حاوية فتح 30 ملليلتر التي تم وضع علامة عليها لملوحة 1X tris-buffer مع ملحي 1X tris-buffered، ووضع الحاوية في الموضع البعيد عن المقبض في مجموعة أبحاث Multiplex 1.
تسمية اثنين من 30 ملليلتر فتح حاويات muli-spectral block'، ومتعددة الأطياف الثانوية، وملء حاوية كتلة mutli-spectral مع 30 ملليلتر من كتلة العازلة الجسم المضاد diluent من مجموعة تلطيخ متعددة الطيفية. ملء حاوية ثانوية متعددة الأطياف مع 30 ملليلتر من المضادة Mouse المضادة المضادة ماوس المضادة البوليمر من عدة تلطيخ متعددة الطيفية وإضافة 600 ميكرولترات من الجسم المضاد diluent إلى كل من عشر 7 milliliter الحاويات المفتوحة. بعد ذلك، إضافة الأجسام المضادة الأولية المركزة إلى الأنابيب المناسبة في وحدات التخزين المشار إليها في الجدول، ومزيج عن طريق الأنابيب لطيف.
إضافة 3 ملليلتر من الماء المقطر مزدوجة، بالإضافة إلى 12 قطرات من الدابي الطيفي في حاوية مفتوحة واحدة 7 ملليلتر، و 3 ملليلتر من كتلة بيروكسيديز في حاوية مفتوحة ثانية 7 ملليلتر. إعادة تعليق كل طابق liathalized مع 75 ميكرولترات من ثنائي الفينيل السلفوكسيد ومزيج عن طريق الأنابيب. ثم، تخزين الأسهم الكلمة إشارة التيراميد في 4 درجات مئوية حتى تصبح جاهزة.
أثناء إعداد تخفيفات أرضية TSA الفردية. تسجيل جميع الكواشف على لصناعة السيارات في stainer، ثم ضع كل حاوية في رف الكاشف وتحميل جميع الكواشف على تلين الآلي. سوف البقع الكشف عن وجود وتأكيد حجم كل كاشف.
بمجرد تحميل جميع الكواشف، قم بتنشيط البروتوكول لتشغيله بين عشية وضحاها. في نهاية الإجراء تلطيخ، تحميل العينات مع زلات الغطاء وتحميل العينات في الماسح الضوئي منصة التصوير متعدد الطيف لمسح. عندما يتم مسح كافة العينات، سيتم تنسيق الصور كملفات qptiff.
فتح برنامج تحليل qptiff المناسبة، وانقر فوق تحميل slide'لفتح خمسة مرشح مسح الشرائح كاملة من الشريحة من الفائدة. قم بتسجيل الدخول واستخدام أداة الطوابع لتحديد خمس مناطق للتصوير متعدد الأطياف. ضمن تحديد لـ:حدد اكتساب'تحت الحجم في الحقول: حدد 1x1 وتحت دقة الحقل'اِن حدد 0.5 ميكرومتر 20x.
استنادا إلى هذا cytokeratin تلطيخ حدد عدة مناطق مع كل من cytokeratin الأنسجة الورم إيجابية، وcytokeratin الأنسجة القوية السلبية لتكون صورة من المسح الضوئي الكلي. عندما يتم اختيار كافة الصور الطيفية المتعددة، قم بالتبديل إلى برنامج Vectra وتغيير المهمة من التصوير الضوئي إلى التصوير متعدد الأطياف'. ثم انقر فوق المسح الضوئي لتنفيذ مجموعة التصوير متعددة الأطياف.
عندما يكون الحصول على صورة متعددة الأطياف كاملة ، واستخدام برنامج غير خلط الطيفي لفتح الملفات داخل مجلد الصور متعددة الأطياف. تحت تنسيق الصورة'حدد متعدد الأطياف'تحت نموذج تنسيق'select fluorescence'and ضمن مصدر مكتبة الطيفية'select inForm'To حدد الطوابق، وحدد جميع الطوابق الستة وتحميلها، وdapi من شرائح مكتبة العينة، وانقر فوق إعداد الكل. سوف يقوم برنامج un-mixing الطيفي بالتكتشق الطيفي على جميع الصور المفتوحة باستخدام الملفات الطيفية المقدمة.
تحديد والتعليق على ملف تعريف طيفي الفلورسنت التلقائي. تأكد من التحقق من ميزة الفلورسنت التلقائية لضمان التقاطها بالكامل في قناة الفلورسنت التلقائي بعد إلغاء المزج واختبار عينات مختلفة حتى تتم إزالته بشكل مقبول. ثم تقييم نمط تلطيخ ضد البقع واحد الكروموجينية من نفس الهدف في الشرائح المتتابعة من نفس الأنسجة مع أخصائي علم الأمراض.
لتقييم شدة الفلور في كل قناة، استخدم أداة العد لمسح الصور المفتوحة. ثم، العودة إلى بروتوكول تلطيخ، وضبط تركيز TSA لمعالجة أي التهم تطبيع التي تتجاوز أو تفشل في الوصول إلى النطاق المقبول. في هذا التحليل التمثيلي أظهرت أنسجة اللوزتين cytokeratin واضحة المعالم تلطيخ داخل سطح اللوزتين ، ظهارة حرشفية دون خلفية في الأنسجة اللمفاوية مع السيتوكيراتين وPDL - 1 تلطيخ واضح في ظهارة رتيكولات من السرابات.
كانت مراكز الجرثومية الجرامية يمكن التعرف عليها بسهولة وغنية في الخلايا اللمفاوية الإيجابية كي-67. تم تحديد الضامة الموجودة داخل المراكز الجرثومية من خلال التعبير CD-68 مع بعض الضامة لوحظت أيضا خارج مركز الجراثيم. CD-8 الخلايا الليمفاوية الملطخة مع توزيع الخلايا التائية والتعبير PD-1 ملطخة بقوة الخلايا الليمفاوية الصغيرة تتجمع في محيط مركز الجرثومية، وكذلك متناثرة في جميع أنحاء المنطقة بين الخلايا.
بعد تأكيد نمط التلطيخ المتوقع في التحكم في أنسجة اللوزتين ، يمكن بعد ذلك تقييم نفس التلطخ في عينة سرطان الرئة. وينبغي أيضاً تقييم عناصر التحكم السلبية في النمط الأوزوي وضوابط الإسقاط؛ ليس فقط للكشف عن الخلفية والسيارات الفلورية، ولكن أيضاً لآثار المظلة والنزف الطيفي. إن عناصر التحكم في الإسقاط مهمة لتقييم القطع الأثرية المحتملة في التلوين بسبب طريقة الفلور المناعية متعددة الزفيرة خلال تحسين لوحة متعددة plex جديدة.
يجب أن يظهر كل عنصر تحكم في الإسقاط نفس نمط التلطخ مثل لوحة متعددة البليplex الكاملة، باستثناء الأجسام المضادة الأولية الوحيدة التي يجب إزالتها على كل عنصر تحكم محدد. التنميط المناعي مع الفلور المناعية متعددة الطيفية يسمح للطبقات من الأورام والمناطق من خلال معايير المناعة التي يمكن بعد ذلك التحقيق من قبل دراسات الجينوم متعددة على نطاق واسع، النسخ، والدراسات البروتيومية. لقد استخدمت فلوروسينومينية متعددة الضفيرة للتحقق من آليات العمل في علاج الأورام واضطرابات المناعة الذاتية التي تسمح بتحديد وتوصيف الخلايا المناعية والممرضة في قسم واحد في setu.
وينبغي اتخاذ الاحتياطات العامة عند العمل مع الأجسام المضادة ضد البروتينات البشرية، والتيراميد وdapi، ولكن لا يوجد كاشف أو مواد في هذا البروتوكول معروف أن تكون خطرة بشكل خاص.
