Этот протокол имеет важное значение, поскольку оптимизация разработки и передача мультиплексных протоколов иммунофлуоресценции является сложной и сложной задачей. Для многих лабораторий провести ногой оптимизированный протокол имеет неоценимое значение. Многоспектральный иммунофлуоресценция позволяет нам оценить как расположение, так и идентичность нескольких типов клеток в опухоли и вокруг нее.
Это мощное сочетание информации в исследованиях иммунной онкологии. Наиболее убедительным использованием для мультиплексного иммунофторесценции является иммунная онкология. Но способность обследовать несколько типов иммунных клеток в сету может быть использована во всех аутоиммунная и воспалительная терапия.
Зная расположение и фенотип иммуно-клеток в и вокруг твердых клеток, как прогностические и предсказуемые ответы на опухоль специфической иммунотерапии. Оптимизация и проверка протокола являются ключевыми шагами, которые не следует торопить. Новые разработчики должны ознакомиться с новыми видами артефактов, связанных с многоспектральной визуализацией.
Чтобы найти базовый многослойный протокол, загрузит его на автоматизированный окрашиватель. Фильтр для all'instead preferred'on экран протокола. Перед внесением изменений сохраните исходный протокол и нажмите на вкладку протоколов, а также нажмите правой кнопкой Opal 6 Multiplex, чтобы выбрать копию.
Измените имя на 7 Multiplex Protocol 1'in в новом окне и выберите вкладку, связанную с правильным устройством. Матч протокола в дополнительной таблице S1'и нажмите добавить реагент, чтобы добавить десять минут пароксидии ингибирования шаг, выбрав ингибитор пероксидазы в качестве реагента. Подтвердите, что блокирующие шаги используют ингибитор протеиновой киназы, блокирующий буфер, что каждый первичный анти-тело относится к соответствующему реагенту, что вторичные шаги против тела используют полимер пероксидазы хрена и что спектральный дапи, обеспеченный многоспектральным набором автоматизации, используется.
Убедитесь, что протокол содержит ингибитор пероксидазы, а затем шесть последовательных окрашивания проходит каждый, содержащий шаг блокирования белка, основной анти-тела, вторичного анти-тела, тайрамид пол, а затем антиген поиска для удаления анти-тела. Чтобы добавить элементы управления падением, скопируйте 7 Multiplex Protocol 1'name и измените его на 7 Multiplex Protocol 1 CD68 Drop. Измените анти-тело РЕагент CD68 на Mouse IgG и сохраните протокол.
Затем создайте еще шесть новых протоколов, по одному для каждого управления падением и один для полного управления изо-типа таким же образом. Сделайте протокол управления падением для каждой цели так же, как я показал вам здесь. Чтобы подготовить набор обнаружения исследований, заполните 30 миллилитров открытый контейнер, отмеченный для 1X три-буфера солевого раствора с 1X три-буфера солевого раствора, и поместите контейнер в положение, самое далекое от ручки в Multiplex Research Kit 1.
Наклейте этикетку на два 30 миллилитров открытых контейнеров мули-спектрального блока и многоспектральной вторичной, и заполнить mutli-спектральный блок контейнера с 30 миллилитров блокирования буфера антител разбомбов из многоспектрального окрашивания Kit. Заполните многоспектральный вторичный контейнер с 30 миллилитров анти-мышь анти-хабиоз вторичного полимера антитела из многоспектрального окрашивания Kit и добавить 600 микролитров разбавления антител к каждому из десяти 7 миллилитров открытых контейнеров. Затем добавьте концентрированное первичное антитело к соответствующим трубкам в объемах, указанных в таблице, и перемешайте нежным пипетки.
Добавьте 3 миллилитров двойной дистиллированной воды, плюс 12 капель спектрального дапи в один 7-миллилитровый открытый контейнер и 3 миллилитров пероксидазы в второй 7-миллилитровый открытый контейнер. Повторно приостанавливайте каждый лиафтальизованный пол с 75 микролитров диметилового сульфоксида и смешивайте с помощью пипетки. Затем храните запасы сигнала Tyramide при 4 градусах по Цельсию до готовности.
При подготовке отдельных TSA пол разбавления. Зарегистрируйте все реагенты на авто-пятно, затем поместите каждый контейнер в стойку реагентов и загрузите все реагенты на автоматизированный окрашиватель. Пятно обнаружит наличие и подтвердит объем каждого реагента.
После загрузки всех реагентов активируйте протокол для работать всю ночь. В конце процедуры окрашивания смонтировать образцы с крышкой скользит и загрузить образцы в многоспектральной платформы изображений сканер для сканирования. Когда все образцы были отсканированы, изображения будут отформатированы как qptiff файлы.
Откройте соответствующую программу анализа qptiff и нажмите слайд нагрузки, чтобы открыть пять фильтров весь слайд сканирования слайда интереса. Войдите в систему и используйте инструмент марки для выбора пяти областей для многоспектральной визуализации. Под Выберите для:выберите Acquisition'under Размер в полях:выберите 1x1 и под разрешением поля выберите 0.5 микрометров 20x.
На основе этого цитокератина окрашивания выбрать несколько регионов как с цитокератин положительной опухолевой ткани, и цитокератин отрицательной стромальной ткани, которые будут изображены из общего сканирования. Когда все многоспектральные изображения будут выбраны, переключитесь на программное обеспечение Vectra и измените задачу с scan'to multi spectral imaging'for each slide. Затем щелкните сканирование для выполнения многоспектральной коллекции изображений.
Когда многоспектральное изображение будет завершено, используйте спектральное программное обеспечение для не смешивания, чтобы открыть файлы в многоспектральной папке изображения. Под изображением format'select multi-spectral'Under образец format'select флуоресценции'И под спектральной библиотеки Source'select inForm'To выбрать полы, выбрать и загрузить все шесть этажей, и дапи из образца библиотеки слайды, и нажмите подготовить все. Спектральное программное обеспечение для не смешивания будет выполнять спектральное несмешание на всех открытых изображениях с использованием предоставленных спектральных профилей.
Определите и аннотировать автоматически флуоресцентный спектральный профиль. Обязательно проверьте функцию автоматического флуоресцентного лампы, чтобы убедиться, что она полностью захвачена в автофлуоресцентном канале после не-смешивания и проверить различные образцы, пока она не будет удалена приемлемо. Затем оцените рисунок окрашивания против хромогенных одиночных пятен одной и той же цели в последовательных слайдах той же ткани с патологоанатомом.
Для оценки интенсивности флуоресценции каждого канала используйте инструмент подсчета для съемки открытых изображений. Затем вернитесь к протоколу окрашивания и отрегулируйте концентрацию TSA для устранения любых нормализованных подсчетов, превышающих или не достигающих приемлемого диапазона. В этом репрезентативном анализе миндалин ткани продемонстрировали четко определенные цитокератин окрашивания в поверхности миндалин, плоскоклеточный эпителий без фона в лимфоидной ткани с цитокератином и PDL-1 окрашивания очевидно в ретикулированный эпителий склепов.
Фолликулярные зародышевые центры были легко узнаваемы и богаты положительными лимфоцитами Ки-67. Макрофаги, присутствующие в зародышевых центрах, были идентифицированы по их выражению CD-68 с некоторыми макрофагами, также наблюдаемыми за пределами зародышевой центра. CD-8 окрашенных лимфоцитов с распределением Т-клеток и PD-1 выражение сильно окрашенных малых лимфоцитов, сгруппированных на периферии зародышевой центр, а также разбросаны по всей межфолликулярной области.
После ожидаемого окрашивания картина была подтверждена в миндалин ткани контроля, то же окрашивание может быть оценена в образце рака легких. Следует также оценить отрицательный контроль и контроль падения изотипа; не только для обнаружения фона и аутофлуоресценции, но и для зонтичных эффектов и спектральных кровотечений. Контроль капли имеет важное значение для оценки потенциальных артефактов в окрашивании из-за многоплексного метода иммунофторесценции во время оптимизации новой многоплексной панели.
Каждый контроль капли должен показать тот же шаблон окрашивания, что и полная многоплексная панель, за исключением одного первичного антитела, которое должно быть удалено на каждом конкретном элементе управления. Иммунопрофилирование с многоспектральным иммунофлюоресценцией позволяет расслоение опухолей и регионов по иммунным критериям, которые затем могут быть исследованы путем массового мультиплекса геномных, транскриптомных и протеомных исследований. Я использовал мультиплексный иммунофторесценции для исследования механизмов действия в онкологии и аутоиммуных расстройств, что позволяет для выявления и характеристики иммунных и патогенных клеток в одном разделе в сету.
Общие меры предосторожности следует принимать при работе с анти-тела против человеческих белков, тирамид и дапи, но ни один реагент или материал в этом протоколе, как известно, особенно опасны.
