この記事の全体的な目標は、心臓幹細胞の分離、特性評価、および分化のためのプロトコルを標準化することです, 大人マウス心臓からのCSC.この方法は、心血管疾患および心臓幹細胞療法および心不全などの地域療法の分野における主要な質問に答えるのに役立つ。この技術の主な利点は、それが時間の小さな期間で高い援助と、費用対効果が高いということです。
プロトコルに記載されているように、滅菌状態で必要なすべての材料、器具、および分離バッファーを準備することによって、この実験を開始します。安楽死させたマウスの腹部から皮膚を取り除いた後、胸腔を開くために滅菌フードの内側の胸部を切る。心臓を露出し、1ミリリットルの注射器を使用して心臓の近くの血液を除去します。
心臓の近くで血液を除去するには、氷冷PBSで周囲を洗います。手術用ハサミとピンセットを使用して心臓を解剖し、10ミリリットルの氷冷PBSを含む100ミリメートルのペトリ皿に入れます。湾曲したシャンク鉗子を使用して心臓を触診し、心臓の中の残留血液を取り除きます。
氷冷ハムのバランス塩溶液の10ミリリットルを含む100ミリリットルのペトリ皿に4〜5つの孤立した心臓を転送します。それらを洗浄し、心臓の中に残っている血液を除去するために再び心臓を触診します。血液を完全に除去するには、洗浄後HBSS溶液を交換してください。
各心臓を鉗子で保持し、外科用ブレードを使用して、HBSSの5〜7ミリリットルを含む100ミリメートルペトリ皿の2〜4ミリメートルの部分に各心臓を切断します。多くの場合、完全な脱退を確実にするためにソリューションを変更します。最後に、HBSSソリューションの心臓を軽視します。
500倍Gの50ミリリットル円錐管に入れた細心を5分間摂氏4度で遠心し、上清を捨てる。5~6ミリリットル、0.2%コラゲターゼII溶液をペレットに加え、組織を消化します。75倍G、摂氏37度で45〜60分間シェーカーでチューブを揺らすことによって、ペレットを完全に再懸濁させます。
20~30分ごとに、チューブを手で激しく振り、ライシスを高めます。5ミリリットルの血清ピペットを使用して、1ミリリットルのピペットチップを使用して、単一細胞懸濁液中に組織塊を解化するために、リセド組織混合物をトリチュレートする。組織の酵素的リシスを停止するには、市販のCSC維持培地を、その組織の体積の2〜3倍加える。
消化した細胞懸濁液を50ミリリットルの円錐チューブに置いた100マイクロメートルの細胞ストレーナーを通して、未消化の組織片を取り除きます。細胞を密度勾配遠心分離に分離するには、摂氏37度、あらかじめ温め、ポリスクロース、ジアトリゾートナトリウム溶液を50ミリリットル円錐形チューブに加えます。その後、穏やかにゆっくりと溶液の上に濾液の等量を追加し、2つの溶液の混合を避けます。
ポリスクロースとナトリウムジアトリゾエート溶液の上に濾液を加えて、チューブを45度で、チューブの壁に対して傾けることなくゆっくりと添加することが重要です。濾液の上にポリスクロースとナトリウム珪藻酸溶液を追加しないでください。スイングバケット遠心分離機にチューブをゆっくりと置き、溶液を乱さないようにします。
2つの溶液を混合することを避けるために、そして心臓幹細胞の適切な分離のために、より低い加速および減速速度で設定された室温で20分間Gの500倍の500倍の遠心分離。遠心分離機に乱れることなく、勾配溶液を非常に慎重に置くことが重要です。遠心分離機の加速と減速は、1または0などの最低速度でなければなりません。
1ミリメートルのピペットを使用して、CSCを含むバフィーコートを上層から15ミリリットルの滅菌チューブに余分な溶液と一緒に移します。等量のCSC維持培地を加え、適切に混合して残留ポリスクロースと珪藻酸ナトリウム溶液を中和します。この懸濁液を500倍Gで摂氏4度で5分間遠心する。
上清を捨てます。少なくとも2回、不完全なDMEM溶液でCSCの洗浄を繰り返します。500倍Gで500倍の摂氏4度で5分間遠心分離機を使用して、残留ポリスクロースおよびナトリウムジアトリゾート溶液を取り除く。
上清を除去した後、精製したCSCを含むペレットを1ミリリットルCSC維持培地に再懸濁し、次いで細胞をカウントする。CSCを0.5%フィブロネクチンを含む0.02%ゼラチン溶液でコーティングした6ウェル培養プレートに播種し、完全な維持培地を2ミリリットル加えます。5%CO2で摂氏37度で細胞を成長させます。
CSC培養が合流性に達したら、テキストプロトコルに記載されているように、新しいゼラチンおよびフィブロネクチンコーティングプレートに細胞を移す。これらを培養して、コンフルエントになるまで5%CO2インキュベーターで37°Cの完全なCSC維持培地でP0 CSCsを培養した。新しいプレートへのセル転送を繰り返し、さらなる実験に使用できるP1 CSCを作成します。
CSC 培養を初期段階で維持するには、テキスト プロトコルに記述されているように、さらにセルをシードします。培養細胞を特徴付けるには、CSC含有プレートを蛍光顕微鏡の目的に置きます。細胞に焦点を合わせるには、10倍の倍率を使用します。
細胞を観察するには、位相差開口を使用し、対物レンズを交換して倍率を20倍に増やしてから、CSCを画像化します。免疫染色を行った後、培養プレートを蛍光顕微鏡下に置く。異なる倍率で細胞を焦点を合わせ、位相コントラストと異なる励起フィルタの下で細胞を観察し、画像を保存します。
細胞分化のために、37°Cの2ミリリットル、事前に温めたCSC維持媒体を備えた6ウェルプレートでCSCを成長させます。細胞が80〜95%の合流度に達したら、維持培地を2ミリリットル、摂氏37度、あらかじめ温めた心筋細胞分化培地に交換してください。摂氏37度で、最大2〜3週間5%CO2でインキュベートします。
分化培地を2~3日ごとに変更します。培地変化の間、細胞形態を顕微鏡で観察し、良好な培養条件を確保する。12日後、標準的な免疫染色プロトコルに従って分化マーカーの細胞を画像化します。
培養CSCは、2〜3日間、位相対照顕微鏡で観察した場合に紡錘形の形態を示す。7日間の文化の後、彼らは形態の変化が細長くなることを示す。多能性のマーカーに対する免疫染色後、CSCはOCT4、SOX2、およびNanogの表現を示す。
さらに、CSCは培養培地中で増殖し、増殖マーカーKi67を発現する。CSCの心臓起源を特徴付けるために、心臓マーカーの発現を調べ、心臓マーカーSca-1、NKX2.5、およびGATA4について陽性であることが細胞に示された。心筋細胞分化培地で12日間培養した後、分化CSCは、アクチニン、およびトロポニン-Iの心筋細胞マーカーの発現を示す。
この手順を試みる際には、勾配溶液と濾液の混合を許可しないように注意することが重要です。加速度と減速を最低速度に設定することも重要です。それらを汚染する人は誰でも、バイオセーフティキャビネット内のすべての細胞分離プロセスを実行することをお勧めします。
この手順に従って、磁気ビーズベースの分離やフローサイトメティック細胞のソート方法のような他の方法は、心臓幹細胞の均質な集団がどのくらい明確であるかなどの追加の質問に答えるために行うことができます。心臓幹細胞のクラック半径は大きなマーカーであり、心筋細胞に対する違いがあります。開発後、この技術は、虚血性心不全の再生療法に重要であり得るマウス心臓からの心臓幹細胞の高収量が多い心血管疾患の分野の研究者のための道を開くだろう。
外科用ブレード、漂白剤、DMSOを使用することは危険であり、この手順を実行している間は、常に人事保護具、PPEを使用するなどの予防措置を取るべきであることを忘れないでください。
