Bu makalenin genel amacı, kalp kök hücrelerinin, CSC'lerin Yetişkin Fare Kalbi'nden izolasyon, karakterizasyon ve farklılaşması için protokolü standartlaştırmaktır. Bu yöntem, kardiyovasküler hastalık ve bölgesel tedavi alanında, kardiyak kök hücre tedavisi ve kalp yetmezliği gibi önemli soruların cevaplanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, küçük bir süre içinde yüksek yardım ile, maliyet etkin olmasıdır.
Protokolde açıklandığı gibi gerekli tüm malzemeleri, aletleri ve izolasyon tamponlarını sterilize edilmiş bir durumda hazırlayarak bu deneye başlayın. Ötenazi li bir farenin karnından deri çıkardıktan sonra, göğüs boşluğu açmak için steril başlık içinde göğüs kafesi kesti. Kalbi açığa çıkarın ve sonra bir mililitreşon şırınga kullanarak kalbin yakınındaki kanı çıkarın.
Kalp yakınındaki herhangi bir kan kaldırmak için, buz gibi PBS ile çevredeki alanı yıkayın. Kalbi incelemek için cerrahi makas ve cımbız kullanarak, 10 mililitre buz gibi PBS içeren 100 milimetrelik Petri kabına yerleştirin. Kalbi palpitate için kavisli sap forseps kullanın, ve kalp içinde kalan kan kaldırmak.
10 mililitre buz gibi soğuk Ham'ın Dengeli Tuz Çözeltisi içeren 100 mililitrelik Petri kabına 4-5 izole kalp aktarın. Onları yıkamak ve kalp içinde kalan kan kaldırmak için tekrar kalpleri palpate. Kanın tamamen çıkarılmasını sağlamak için, her yıkamadan sonra HBSS çözeltisini değiştirin.
Her kalbi bir çift forceps ile tutun ve her kalbi 100 milimetrelik Petri kabında iki ila dört milimetrelik parçalara kesmek için bir cerrahi bıçak kullanın, beş ila yedi mililitre HBSS içeren. Sık sık tam kan alma sağlamak için çözüm değiştirin. Son olarak, HBSS çözümünde kalpleri kıyma.
500 kez G'de 50 mililitrelik konik bir tüpe yerleştirilen kıyılmış kalpleri beş dakika boyunca dört santigrat derecede santrifüj edin ve sonra süpernatantı atın. Doku sindirmek için pelet beş ila altı mililitre, 0.2% Kollajenaz II çözeltisi ekleyin. 45 ila 60 dakika boyunca 37 santigrat derece, 75 kez G bir shaker üzerinde tüp sallayarak iyice pelet yeniden askıya.
Her 20-30 dakikada bir, lysis geliştirmek için elle şiddetle tüp sallayın. Beş mililitre serolojik pipet ve tek hücreli süspansiyon içine doku yumru ayırmak için bir mililitre pipet ucu kullanarak lysed doku karışımı triturate. Dokunun enzimatik lysis durdurmak için, iki ila üç kat daha fazla ticari csc bakım ortamı lysed doku hacmi olarak ekleyin.
Sindirilmemiş doku parçalarını çıkarmak için 50 mililitrelik konik bir tüpe yerleştirilen 100 mikrometrelik hücresüzden sindirilmiş hücre süspansiyonu geçirin. Yoğunluk gradyan santrifüj hücreleri ayırmak için, 50 mililitrekonik tüp için 37 derece santigrat, önceden ısıtılmış, poliskopoz ve sodyum diarizoat çözeltisi ekleyin. Daha sonra yavaşça ve yavaşça çözelti üzerinde eşit hacimli filtrat ekleyin, iki çözeltinin herhangi bir karışımını önleyerek.
Bu 45 derece ve tüp duvarına doğru tüp tilting tarafından karıştırma olmadan yavaş yavaş poliskroz ve sodyum diatrizoat çözeltisi üzerinde filtrat eklemek için önemlidir. Filtrat üzerine polikroz ve sodyum diarizoat çözeltisi eklemeyin. Tüpü çok yavaş bir salıncak kovasantrisine yerleştirin ve çözeltileri rahatsız etmemeye özen gösteriyor.
İki çözeltinin karıştırılmasını önlemek ve kardiyak kök hücrelerin düzgün bir şekilde ayrılmasını önlemek için oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 500 kez G'de santrifüj edin. Degrade çözeltisini santrifüjde rahatsızlık olmadan çok dikkatli bir şekilde koymak çok önemlidir. Santrifüjün ivmeve yavaşlamasını bir veya sıfır gibi en düşük hızda koyun.
CSC'leri içeren buffy coat'u üst tabakadan 15 mililitrelik sterilize edilmiş bir tüpe ekstra solüsyonla birlikte aktarmak için bir milimetrelik pipet kullanın. Eşit hacimli CSC bakım ortamı ekleyin ve artık polisukroz ve sodyum diarizoat çözeltisini nötralize etmek için düzgün bir şekilde karıştırın. Bu süspansiyonu 500 kez G'de dört santigrat derecede beş dakika santrifüj edin.
Supernatant atın. CSC'lerin eksik DMEM Solüsyonu ile yıkanması en az iki kez tekrarlayın. Herhangi bir kalıntı polisukroz ve sodyum diarizoat çözeltisi kurtulmak için dört santigrat derece beş dakika için 500 kez G santrifüj.
Supernatant çıkardıktan sonra, bir mililitre CSC bakım ortamı saflaştırılmış CSCiçeren pelet resuspend ve sonra hücreleri saymak. Tohum CSCs altı iyi kültür plaka 0.02% 0.5 fibronektin içeren jelatin çözeltisi ile kaplı ve tam bakım ortamı iki mililitre ekleyin. Hücreleri %5 CO2'de 37 derecede büyütün.
CSC kültürü biraraya geldiğinde, metin protokolünde açıklandığı gibi hücreleri yeni bir jelatin ve fibronektin kaplı plakaya aktarın. Kültür bu konfluent kadar% 5 CO2 inkübatör 37 santigrat derece tam CSC bakım ortamı P0 CSCs transfer. Daha fazla deney için kullanılabilecek P1 CSC'leri yapmak için hücre transferini yeni bir plakaya tekrarlayın.
CSC kültürünü ilk aşamasında korumak için, hücreleri metin protokolünde açıklandığı şekilde daha fazla tohumlayın. Kültürlü hücreleri karakterize etmek için, bir floresan mikroskop amacı plaka içeren CSC yerleştirin. Hücreleri odaklamak için on kat büyütme kullanın.
Hücreleri gözlemlemek için faz kontrastlı diyafram açıklığını kullanın ve objektif lensi değiştirerek büyütmeyi 20 katına yükseltin ve csc'leri görüntüleyin. İmmünoboyama yapıldıktan sonra, floresan mikroskobun altına kültür plakasını yerleştirin. Hücreleri farklı büyütmelere odakla ve faz kontrastı ve farklı uyarma filtreleri altındaki hücreleri gözlemleyin ve görüntüleri kaydedin.
Hücre farklılaşması için, CSC'leri 37 santigrat derece, önceden ısıtılmış CSC bakım ortamı na sahip altı kuyulu bir tabakta büyütün. Hücreler %80 ila %95 biraraya geldiğinde, bakım ortamını iki mililitre, 37 santigrat derece, önceden ısıtılmış kardiyomiyosit farklılaşma ortamıyla değiştirin. 37 santigrat derecede kuluçka, 2-3 hafta kadar %5 CO2 ile.
Her 2-3 günde bir farklılaşma ortamını değiştirin. Orta değişim sırasında, iyi kültür koşulları sağlamak için bir mikroskop altında hücre morfolojisi gözlemleyin. 12 gün sonra, standart bir immünboyama protokolü ne göre farklılaşma belirteçleri için hücreleri görüntüleyin.
İki ila üç gün kültürlü CSCs bir faz kontrast mikroskop altında gözlendiğinde bir mil şeklinde morfoloji seve. Yedi günlük kültürden sonra morfolojide bir değişimin uzamış olduğunu gösteriyorlar. Pluripotency belirteçleri için immünboyama sonra, CSCs OCT4 ifadeleri gösterir, SOX2, ve Nanog.
Ayrıca, CSC'ler kültür ortamında çoğalır ve ki67'de çoğalma işaretini ifade eder. KSK'ların kardiyak kökenini karakterize etmek için kardiyak belirteçlerin ekspresyonu incelendi ve sca-1, NKX2.5 ve GATA4 kardiyak belirteçleri için pozitif olduğu görüldü. Kardiyomiyosit farklılaşma ortamında 12 gün kalım sağlanmadan sonra, diferansiyel CSC'ler kardiyomiyosit belirteçlerinin ACTINin ve TROPONIN-I'nin ekspresyonunu göstermektedir.
Bu yordamı çalışırken, degrade çözeltisi ve filtrat karıştırma izin vermemek önemlidir. Hızlanma ve yavaşlamayı en düşük hızda ayarlamak da önemlidir. Onları kim kirletir, bir biyogüvenlik kabiniçinde tüm hücre izolasyon işlemi gerçekleştirmek için tavsiye edilir.
Bu prosedürü takiben, kardiyak kök hücrelerin homojen popülasyonu ne kadar açık olduğu gibi ek soruları cevaplamak için manyetik boncuk bazlı ayırma veya akış sitometik hücre ayrıştırma yöntemleri gibi diğer yöntemler de yapılabilir? Kardiyak kök hücredeki çatlak yarıçapı büyük belirteçlerdir ve kardiyomiyositlere karşı farklılıklar vardır. Bu teknik gelişiminden sonra, bu teknik, iskemik kalp yetmezliğirejeneratif tedavi için önemli olabilir fare kalp kalp kök hücrelerinin genellikle yüksek verim kardiyovasküler hastalık alanında araştırmacılar için önünü açacaktır.
Cerrahi bıçak, çamaşır suyu ve DMSO ile çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken Personel Koruyucu Ekipman, PPE gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.
