El objetivo general de este artículo, es estandarizar el protocolo para el aislamiento, caracterización y diferenciación de células madre cardíacas, CSC del corazón de ratón adulto. Este método puede ayudar a responder preguntas clave, en el campo de las enfermedades cardiovasculares y la terapia regional como, terapia con células madre cardíacas e insuficiencia cardíaca. La principal ventaja de esta técnica es que es rentable, con una alta ayuda en un pequeño período de tiempo.
Comience este experimento preparando todos los materiales, instrumentos y búferes de aislamiento necesarios en una condición esterilizada como se describe en el protocolo. Después de extraer la piel del abdomen de un ratón eutanizado, corte la caja torácica dentro de la capucha estéril para abrir la cavidad torácica. Exponga el corazón y luego retire la sangre cerca del corazón con una jeringa de un mililitro.
Para eliminar cualquier sangre cerca del corazón, lave el área circundante con PBS helado. Usando tijeras quirúrgicas y pinzas para diseccionar el corazón, colóquelo en un plato de Petri de 100 milímetros que contenga 10 mililitros de hielo frío PBS. Usa fórceps de vástago curvo para palpitar el corazón y eliminar la sangre residual dentro del corazón.
Transfiera de cuatro a cinco corazones aislados a un plato de Petri de 100 mililitros que contenga 10 mililitros de solución de sal equilibrada de Jamón helada. Palpúpa los corazones de nuevo para lavarlos y eliminar cualquier sangre residual dentro del corazón. Para garantizar la extracción completa de la sangre, cambie la solución de HBSS después de cada lavado.
Sostenga cada corazón con un par de fórceps y use una cuchilla quirúrgica para cortar cada corazón en trozos de dos a cuatro milímetros en un plato petri de 100 milímetros, que contiene de cinco a siete mililitros de HBSS. Cambie con frecuencia la solución para garantizar la extracción completa de sangre. Por último, picar los corazones en la solución HBSS.
Centrifugar los corazones picados colocados en un tubo cónico de 50 mililitros a 500 veces G, a cuatro grados centígrados durante cinco minutos, y luego desechar el sobrenadante. Añadir de cinco a seis mililitros, 0,2%Solución de collagenasa II al pellet para digerir el tejido. Vuelva a suspender el pellet a fondo meciendo el tubo en una coctelera a 75 veces G, a 37 grados Celsius durante 45 a 60 minutos.
Cada 20 a 30 minutos, agita el tubo vigorosamente a mano para mejorar la lisis. Triturar la mezcla de tejido de lesed utilizando cinco mililitros de pipeta serológica, y una punta de pipeta de un mililitro para disociar el bulto tisular en la suspensión de una sola célula. Para detener la lelisis enzimática del tejido, agregue de dos a tres veces más medio de mantenimiento CSC disponible comercialmente que el volumen del tejido lesed.
Pasar la suspensión celular digerida a través de un colador celular de 100 micrómetros colocado en un tubo cónico de 50 mililitros para eliminar cualquier pieza de tejido no digerido. Para separar las células a la centrifugación de gradiente de densidad, agregue 37 grados Celsius, precalentado, polisurosa y diatrizoato de sodio a un tubo cónico de 50 mililitros. A continuación, añadir suavemente y lentamente un volumen igual de filtrado sobre la solución, evitando cualquier mezcla de las dos soluciones.
Es fundamental añadir filtrado sobre la polisurosa y la solución de diatrizoato sódico lentamente sin mezclarlo inclinando el tubo a 45 grados y contra la pared del tubo. No agregue solución de polisurosa y diatrizoato sódico sobre filtrado. Coloque el tubo muy lentamente en una centrífuga de cubo oscilante asegurándose de no molestar las soluciones.
Centrifugar a 500 veces G durante 20 minutos a temperatura ambiente fijado a una menor velocidad de aceleración y desaceleración para evitar mezclar las dos soluciones, y para la separación adecuada de las células madre cardíacas. Es fundamental poner la solución de gradiente con mucho cuidado sin perturbaciones en la centrífuga. Ponga la aceleración y desaceleración de la centrífuga debe estar a la velocidad más baja, como uno o cero.
Utilice una pipeta de un milímetro para transferir la capa buffy que contiene los CSC junto con una solución adicional de la capa superior a un tubo esterilizado de 15 mililitros. Agregue un volumen igual de medio de mantenimiento CSC y mezcle adecuadamente para neutralizar la solución residual de polisurosa y diatrizoato sódico. Centrifugar esta suspensión a 500 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.
Deseche el sobrenadante. Repita el lavado de los CSC con DMEM Solution incompleto al menos dos veces. Centrifugar a 500 veces G durante cinco minutos a cuatro grados Celsius para deshacerse de cualquier solución residual de polisurosa y diatrizoato sódico.
Después de retirar el sobrenadante, resuspender el pellet que contiene CSC purificado en un medio de mantenimiento CSC de mililitro, y luego contar las células. Siembra las CSC en una placa de cultivo de seis pozos recubierta con una solución de gelatina de 0,02% que contiene 0,5% de fibronectina, y añade dos mililitros de medio de mantenimiento completo. Crecer las células a 37 grados celsius en 5%CO2.
Cuando el cultivo CSC alcance la confluencia, transfiera las células a una nueva placa recubierta de gelatina y fibronectina como se describe en el protocolo de texto. Cultivo estos CSC P0 transferidos en medio de mantenimiento completo CSC a 37 grados Celsius en una incubadora de 5%CO2 hasta que confluen. Repita la transferencia de celdas a una nueva placa para crear CSC P1 que se pueden utilizar para experimentos posteriores.
Para mantener la referencia cultural CSC en su etapa inicial, sembrar las celdas más como se describe en el protocolo de texto. Para caracterizar las células cultivadas, coloque la placa que contiene CSC en el objetivo de un microscopio fluorescente. Utilice diez veces la ampliación para enfocar las células.
Para observar las celdas, utilice la apertura de contraste de fase y aumente la ampliación a 20 veces cambiando la lente objetivo y, a continuación, imagine las CSC. Después de realizar la inmunosuchación, coloque la placa de cultivo bajo el microscopio de fluorescencia. Enfoque las células en diferentes aumentos, y observe las células bajo contraste de fase y diferentes filtros de excitación, y guarde las imágenes.
Para la diferenciación celular, haga crecer los CSC en una placa de seis pozos con dos mililitros de 37 grados Celsius, medio de mantenimiento CSC precalentado. Cuando las células alcancen el 80 al 95% de confluencia, reemplace el medio de mantenimiento por dos mililitros, 37 grados Celsius, medio de diferenciación de cardiomiocitos precalientados. Incubar a 37 grados centígrados, en un 5% de CO2 durante un máximo de dos a tres semanas.
Cambie el medio de diferenciación cada dos o tres días. Durante el cambio medio, observe la morfología celular bajo un microscopio para asegurar las buenas condiciones de cultivo. Después de 12 días, imagine las células para ver los marcadores de diferenciación siguiendo un protocolo de inmunomancha estándar.
De dos a tres días cultivadas, las CSC cultivadas muestran una morfología en forma de husillo cuando se observan bajo un microscopio de contraste de fase. Después de siete días de cultura, muestran un cambio en la morfología que se vuelve alargada. Después de la inmunomancha para marcadores de pluripotencia, los CSC muestran expresiones de OCT4, SOX2 y Nanog.
Además, las CSC proliferan en el medio de cultivo y expresan el marcador de proliferación Ki67. Para caracterizar el origen cardíaco de las CSC, se examinó la expresión de marcadores cardíacos y las células mostraron ser positivas para los marcadores cardíacos Sca-1, NKX2.5 y GATA4. Después de cultivar en medio de diferenciación de cardiomiocitos durante 12 días, las CSC diferenciadas muestran la expresión de los marcadores de cardiomiocitos ACTININ, y TROPONIN-I.
Al intentar este procedimiento, es importante recordar no permitir la mezcla de la solución de gradiente y el filtrado. También es importante ajustar la aceleración y la desaceleración a la velocidad más baja. Quien los contamine, se recomienda realizar todo el proceso de aislamiento celular dentro de un gabinete de bioseguridad.
Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la separación basada en cuentas magnéticas o los métodos de clasificación de células basados en citométicos de flujo para responder preguntas adicionales como, ¿qué tan clara es la población homogénea de células madre cardíacas? El radio de grieta en una célula madre cardíaca es un marcador grande, y hay diferencias hacia los cardiomiocitos. Después de su desarrollo, esta técnica allanará el camino para los investigadores en el campo de la enfermedad cardiovascular que a menudo alto rendimiento de células madre cardíacas del corazón del ratón que podría ser importante para la terapia regenerativa en la insuficiencia cardíaca isquémica.
No olvide que trabajar con cuchilla quirúrgica, lejía y DMSO puede ser peligroso, y las precauciones como el uso de equipos de protección de personal, EPI, siempre deben tomarse durante la realización de este procedimiento.
