L'obiettivo generale di questo articolo è standardizzare il protocollo per l'isolamento, la caratterizzazione e la differenziazione delle cellule staminali cardiache, CSC dal cuore del topo adulto. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave, nel campo delle malattie cardiovascolari e della terapia regionale come la terapia con cellule staminali cardiache e l'insufficienza cardiaca. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è conveniente, con un aiuto elevato in un piccolo periodo di tempo.
Inizia questo esperimento preparando tutti i materiali, gli strumenti e i buffer di isolamento necessari in una condizione sterilizzata come descritto nel protocollo. Dopo aver rimosso la pelle dall'addome di un topo eutanasiato, tagliare la gabbia toracica all'interno del cappuccio sterile per aprire la cavità toracica. Esporre il cuore e quindi rimuovere il sangue vicino al cuore usando una siringa millilitro.
Per rimuovere il sangue vicino al cuore, lavare l'area circostante con PBS ghiacciato. Usando forbici chirurgiche e pinzette per sezionare il cuore, posizionarlo in una piastra di Petri di 100 millimetri contenente PBS ghiacciato da 10 millilitri. Usa le flesse curve del gambo per palpitare il cuore e rimuovere il sangue residuo all'interno del cuore.
Trasferire da quattro a cinque cuori isolati in una piastra di Petri da 100 millilitri contenente 10 millilitri di soluzione salina equilibrata del prosciutto ghiacciato. Palpare di nuovo i cuori per lavarli e rimuovere il sangue residuo all'interno del cuore. Per garantire la completa rimozione del sangue, cambiare la soluzione HBSS dopo ogni lavaggio.
Tenere ogni cuore con un paio di forcep e utilizzare una lama chirurgica per tagliare ogni cuore in pezzi da due a quattro millimetri in una piastra di Petri da 100 millimetri, contenente da cinque a sette millilitri di HBSS. Cambiare frequentemente la soluzione per garantire la completa rimozione del sangue. Infine, tritare i cuori nella soluzione HBSS.
Centrifugare i cuori tritati posti in un tubo conico da 50 millilitri a 500 volte G, a quattro gradi Celsius per cinque minuti, quindi scartare il supernatante. Aggiungere da cinque a sei millilitri, soluzione di collagenasi II allo 0,2% al pellet per digerire il tessuto. Sospendere completamente il pellet dondolando il tubo su uno shaker a 75 volte G, a 37 gradi Celsius per 45-60 minuti.
Ogni 20-30 minuti, agitare vigorosamente il tubo a mano per esaltare lalisi. Triturare la miscela di tessuti lisciviati utilizzando pipetta sierologica da cinque millilitri e una punta di pipetta millilitro per dissociare il grumo tissutale nella sospensione a singola cellula. Per interrompere la llisi enzimatica del tessuto, aggiungere da due a tre volte il mezzo di manutenzione CSC disponibile in commercio come il volume del tessuto lassato.
Passare la sospensione cellulare digerita attraverso un colino cellulare di 100 micrometri posto su un tubo conico da 50 millilitri per rimuovere eventuali pezzi di tessuto non digeriti. Per separare le cellule dalla centrifugazione gradiente di densità, aggiungere 37 gradi Celsius, soluzione prerifuricata, polisucrose e diatrizoato di sodio a un tubo conico da 50 millilitri. Quindi aggiungere delicatamente e lentamente un uguale volume di filtrato sulla soluzione, evitando qualsiasi miscelazione delle due soluzioni.
È fondamentale aggiungere lentamente il filtrato su polisucrose e soluzione di diatrizoato di sodio senza mescolare inclinando il tubo a 45 gradi e contro la parete del tubo. Non aggiungere polisucrose e soluzione di diatrizoato di sodio su filtrato. Posizionare il tubo molto lentamente in una centrifuga a benna oscillante assicurandosi di non disturbare le soluzioni.
Centrifuga a 500 volte G per 20 minuti a temperatura ambiente impostata a una velocità di accelerazione e decelerazione inferiore per evitare di mescolare le due soluzioni e per una corretta separazione delle cellule staminali cardiache. È fondamentale mettere la soluzione gradiente con molta attenzione senza disturbi nella centrifuga. Mettere l'accelerazione e la decelerazione della centrifuga deve essere alla velocità più bassa, ad esempio una o zero.
Utilizzare una pipetta di un millimetro per trasferire il mantello buffy contenente i CSC insieme a una soluzione extra dallo strato superiore a un tubo sterilizzato da 15 millilitri. Aggiungere un volume uguale di mezzo di manutenzione CSC e mescolarlo correttamente per neutralizzare la soluzione residua di polisucrose e diatrizoato di sodio. Centrifuga questa sospensione a 500 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius.
Scartare il supernatante. Ripetere il lavaggio dei CSC con soluzione DMEM incompleta almeno per due volte. Centrifuga a 500 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius per sbarazzarsi di qualsiasi soluzione residua di polisucrose e diatrizoato di sodio.
Dopo aver rimosso il supernatante, rimescolare il pellet contenente CSC purificati in un mezzo di manutenzione CSC millilitro, quindi contare le cellule. Sezionare i CSC in una piastra di coltura a sei pozzi rivestita con una soluzione di gelatina allo 0,02% contenente lo 0,5% di fibronectina e aggiungere due millilitri di mezzo di manutenzione completo. Far crescere le cellule a 37 gradi Celsius in 5%CO2.
Quando la coltura CSC raggiunge la confluenza, trasferire le cellule in una nuova piastra rivestita di gelatina e fibronectina come descritto nel protocollo di testo. Coltura questi CSC P0 trasferiti in un mezzo di manutenzione CSC completo a 37 gradi Celsius in un incubatore di CO2 al 5% fino a confluenza. Ripetere il trasferimento della cella su una nuova piastra per creare CSC P1 che possono essere utilizzati per ulteriori esperimenti.
Per mantenere le impostazioni cultura CSC nella fase iniziale, seminare ulteriormente le celle come descritto nel protocollo di testo. Per caratterizzare le cellule coltivate, posizionare la piastra contenente CSC sull'obiettivo di un microscopio fluorescente. Utilizzare dieci volte l'ingrandimento per mettere a fuoco le celle.
Per osservare le celle, usate l'apertura a contrasto di fase e aumentate l'ingrandimento a 20 volte modificando l'obiettivo, quindi immaginiamo i CSC. Dopo aver eseguito l'immunostaining, posizionare la piastra di coltura al microscopio a fluorescenza. Mettere a fuoco le celle con ingrandimenti diversi e osservare le celle in contrasto di fase e diversi filtri di eccitazione e salvare le immagini.
Per la differenziazione cellulare, far crescere i CSC in una piastra a sei porsi con due millilitri di 37 gradi Celsius, mezzo di manutenzione CSC pre-riscaldato. Quando le cellule raggiungono l'80-95% di confluenza, sostituire il mezzo di manutenzione con due millilitri, 37 gradi Celsius, mezzo di differenziazione dei cardiomiociti pre-riscaldato. Incubare a 37 gradi Celsius, in una CO2 del 5% per un massimo di due o tre settimane.
Cambiare il mezzo di differenziazione ogni due o tre giorni. Durante il cambiamento medio, osservare la morfologia cellulare al microscopio per garantire le buone condizioni di coltura. Dopo 12 giorni, immagini le cellule per marcatori di differenziazione seguendo un protocollo standard di immunosottenzione.
I CSC coltivati da due a tre giorni mostrano una morfologia a forma di mandrino quando osservati al microscopio a contrasto di fase. Dopo sette giorni di cultura, mostrano un cambiamento nella morfologia che si allunga. Dopo l'immunosottenzione per marcatori di pluripotenza, i CSC mostrano espressioni di OCT4, SOX2 e Nanog.
Inoltre, i CSC proliferano nel mezzo di coltura ed esprimono il marcatore di proliferazione Ki67. Per caratterizzare l'origine cardiaca dei CSC, è stata esaminata l'espressione dei marcatori cardiaci e le cellule si sono dimostrate positive per i marcatori cardiaci Sca-1, NKX2.5 e GATA4. Dopo aver coltivato nel mezzo di differenziazione dei cardiomiociti per 12 giorni, i CSC differenziati mostrano l'espressione dei marcatori di cardiomiociti ACTININ e TROPONIN-I.
Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di non consentire la miscelazione della soluzione gradiente e del filtrato. È anche importante impostare l'accelerazione e la decelerazione alla velocità più bassa. Chiunque li contamini, si consiglia di eseguire tutti i processi di isolamento cellulare all'interno di un armadio di biosicurezza.
Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la separazione a base di perline magnetiche o i metodi di smistamento delle cellule a base citometica a flusso al fine di rispondere a domande aggiuntive quali, quanto è chiara la popolazione omogenea di cellule staminali cardiache? Il raggio di crack in una cellula staminale cardiaca è un grande marcatore, e ci sono differenze verso i cardiomiociti. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica aprirà la strada ai ricercatori nel campo delle malattie cardiovascolari che spesso hanno un alto rendimento di cellule staminali cardiache dal cuore del topo che potrebbe essere importante per la terapia rigenerativa in insufficienza cardiaca ischemica.
Non dimenticare che lavorare con lama chirurgica, candeggina e DMSO può essere pericoloso e precauzioni come l'uso di dispositivi di protezione del personale, DPI, devono sempre essere prese durante l'esecuzione di questa procedura.
