שיטה זו שימושית למענה על שאלות מפתח מסוימות בתחום מחקר הפוטוסינתזה כגון קומפלקסים תילקואידיים פיזיולוגיים אמיתיים עם רכיבים המחוברים אנרגטית? היתרון העיקרי של הג'ל הירוק ופרוטוקול TCSPC המתוארים כאן הוא שהוא מהיר וחזק. ניתן לעבד ולנתח דגימות בקלות ביום אחד, מה שהופך את בעיות האחסון והיציבות לפחות מדאיגות.
למרות TCSPC יכול לספק תובנה לתוך מערכות פוטוסינתטיות שלמדנו כאן, זה יכול להיות מיושם גם על מערכות אחרות החל כימי דרך פיזית וביולוגית כגון מחקרים של תנועה מולקולרית פלואורסצנטית בנוזלים, תאים, או מוטיבים חדשניים מבניים כגון שכבות monomolecular ונוזלים יוניים. כדי להתחיל בהליך זה, הכן את פתרונות המלאי הדרושים ואת מיני ג'לים ירוקים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, להשיג קצת קרח לעמעם את האורות.
באמצעות homogenizer Dounce זכוכית, הומוגניזציה לחלוטין את עלי תרד בערך אחד עד שני מיליליטר של חיץ TMK. כדי ליצור התקן סינון פשוט, גזור מחיקת משימה עדינה לשניים וקפל אותה לרבעים. הסר את הבוכנה ממזרק, ולאחר מכן לארוז את המשימה מקופלת לנגב לתוך החלק התחתון של המזרק.
פיפטה הומוגנט עלה למרכז מסנן לנגב את המשימה, ולאחר מכן להשתמש בוכנה כדי להעביר את homogenate דרך המסנן ולאסוף אותו בצינור צנטריפוגה 1.5 מיליליטר. צנטריפוגה הומוגנית ב 5, 000 גרם וארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות כדי גלולה את החומר מסיס, כולל קרום thylakoid. השלך את העל-טבעי וזרוק מחדש את גלולת הכדור במיליליטר אחד של מאגר TMK.
כדי לחלץ כלורופיל מכל דגימה, יש ליטול אליקוט 50 מיקרוליטר ולהעבירו לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר. מוסיפים 950 מיקרוליטרים של מתנול, מכסים את הצינור ומערבבים על ידי היפוךו מספר פעמים. צנטריפוגה ב 10, 000 גרם במשך 10 דקות כדי גלולה חלבונים זירז.
באמצעות מדידות ריכוז כלורופיל כמדריך, להסיר ולהשליך קצת נפח מכל מדגם לפי הצורך עד כל צינור מכיל את אותה כמות כוללת של כלורופיל. צנטריפוגה ב 5, 000 גרם במשך 10 דקות כדי להפוך מחדש את קרום thylakoid. הסר והשליך את העל-טבעי, הקפד להסיר את כל העל-טבעי מבלי להפריע לכדור.
ראשית, להפשיר aliquot של TMK 30% פתרון דטרגנט גליצרול. הפוך מספר פעמים כדי לערבב ולשמור את הפתרון על קרח. הוסף נפח מתאים של פתרון חומר הניקוי כדי להמיס את גלולה וכתוצאה מכך ריכוז כלורופיל סופי של מיליגרם אחד למיליליטר.
פיפטה למעלה ולמטה שוב ושוב תוך הקפדה להימנע קצף בדגימה. לאחר מכן, לשמור את הדגימה על הקרח כדי לאפשר דגימות thylakoid להתבודד. לאחר השלמת המסיסה, צנטריפוגה המדגם ב 10, 000 גרם וארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות כדי גלולה החומר מסיס, וכתוצאה מכך ברור, ירוק כהה על טבעי.
לאחר מכן, לטעון 15 microliters של עלנט נטנט תילקואיד מנוזל ישירות על כל באר של ג'ל מקומי מוכן בעבר 1.5 מילימטר. באמצעות חיץ ריצה 1X, להתחיל להפעיל את הג'ל הירוק המקורי ב 100 וולט. מניחים את מיכל הג'ל כולו על קרח רטוב למשך הריצה כדי למתן חימום התנגדותי.
כאשר הג'ל סיים לרוץ, הסר אותו מתא האלקטרופורזה ושטוף את המאגר הזורם מצלחות הג'ל במים מזוקקים. מוציאים את הצלחת העליונה מהג'ל ואז שוטפים את הג'ל במים מזוקקים. מניחים את הג'ל, שעדיין נמצא על צלחת הזכוכית התחתונה, על קרח;כאשר הג'ל אינו בשימוש, מכסים אותו בניילון נצמד ולשמור אותו בחושך כדי למנוע ממנו להתייבש.
לאחר מכן, השתמש אזמל חד או סכין גילוח כדי excise כל רצועה של עניין כאשר מוכן להמשיך עם ניתוח TCSPC. ודא כי הלהקה excised אינו מכיל חומר רצועה מזהם. עבור כל קומפלקס להיות מנותח, להשתמש ספקטרומטר פלואורסצנטי כדי להפוך ספקטרום פלואורסצנטי בטמפרטורת החדר בין 600 ל 800 ננומטר.
מניחים סרט מיסוך על כל קצה של השקופיות ומקפלים אותו על פני כמה פעמים כדי ליצור רווחים, אשר יאפשר את המחוונים להיות מוחזקים יחד בחוזקה מבלי לדחוס את הרווח בין, ולאחר מכן כריך את פרוסת הג'ל בין שתי שקופיות מיקרוסקופ זכוכית. מוסיפים כמות קטנה של מים לפרוסת הג'ל בקצה מגלשות הזכוכית כדי ליצור ממשק חלק שיפחית את פיזור האותות. לאחר מכן, מהדקים את כריך הג'ל בנתיב הקרן כך שהקרן פוגעת בפרוסת הג'ל דרך הקצה הפתוח של הצלחות.
עבור כל קומפלקס, לאסוף 10,000 נקודות נתונים הכולל במרווחי זמן קבועים על פני ספקטרום פליטת הפלואורסצנטיות. כדי לנתח את הנתונים עבור קומפלקס נתון, תחילה לנרמל את גובה השיא של כל עקומת ריקבון עבור כל אורכי הגל שנאספו, ולאחר מכן זנב להתאים כל עקומת ריקבון לספקטרום פלואורסצנטי מצב יציב של המורכבות כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. תוצאות מייצגות עבור אלקטרופורזה ג'ל ירוק מספק דוגמה של תוצאה אידיאלית לניתוח של thylakoids תרד, שבו מספר ברור, להקות ירוקות חדות גלויים.
נתיבים 2 ו-3 מציגים תוצאות אופייניות יותר מבידוד תילאקואידי פשוט ואלקטרופורזה על ג'ל אקרילמיד שאינו שיפוע 5%. נתיבים 4, 5 ו-6 מספקים דוגמה לתוצאות גרועות עקב הגדלה של דרגות של מסיסות תחת מסיסות של דגימת התילקואידים, בעוד נתיב 7 מדגים את התוצאות שניתן להשיג כאשר נעשה שימוש בבילאקואידים של Arabidopsis במקום תרד. לאחר עקומות הנתונים של נתוני TCSPC נקבעו לאותה קופת זמן, ניתן לנרמל אותם לאותו גובה שיא, המאפשר להשוות את העקומות כניתוח ראשון של הנתונים.
עקומות ריקבון מנורמלות שיא ממתחמים שונים ניתן לאחר מכן להיות מכוסה אחד עם השני באורך גל נתון, המאפשר את ההבדלים בהתנהגות בין המתחמים להיות חזותיים. זנב התואם את עקומות הריקבון מאפשר בניית ספקטרום הקשור לריקבון. כפי שניתן לראות כאן, הספקטרום הקשור לריקבון עבור LHCII בולט בהיעדר תכונות דינמיות וצורת ספקטרום הפלואורסצנטיות LHCII נשארת זהה לאות נרקב לאורך זמן.
הריקבון של ספקטרום הפלואורסצנטיות מתעכב גם הוא, ודורש 100 פיקוז-שניות כדי להגיע לפיואורסצנטיות מקסימלית. הדבר מצביע על כך שהאנרגיה אינה מועברת בין פיגמנטים מובחנים אנרגטית בתוך המתחם כאשר הפלואורסצנטיות נרקבת. הספקטרום הקשור לריקבון נבנה לאחר מכן עבור מתחם הלהקה 5.
בהשוואה ל- LHCII, הפלואורסצנטיות של Band 5 נרקבת הרבה יותר מהר, ומגיעה לעוצמה מקסימלית רק ב -30 פיקוסקנדים ולאחר מכן נרקבת לפחות מ -20% מהעוצמה הראשונית לאחר 500 פיקוסקנדים. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור כי פרשנות של נתוני TCSPC יסתמך על מידע ביוכימי נוסף המזהה את מרכיבי המתחמים תחת מחקר, למשל, על ידי 2 DSDS-PAGE ו- Blotting מערבי או ספקטרומטריית מסה.
