Bu yöntem fotosentez araştırma alanında bazı anahtar soruları cevaplamak için yararlıdır gibi putatif thylakoid kompleksleri fizyolojik enerjik bağlı bileşenleri ile gerçek kompleksleri? Burada açıklanan yeşil jel ve TCSPC protokolünün en büyük avantajı hızlı ve sağlam olmasıdır. Numuneler tek bir günde kolayca işlenebilir ve analiz edilebilir, bu da depolama ve stabilite sorunlarını daha az sorun haline getirir.
TCSPC burada incelediğimiz fotosentetik sistemlere ışık atabilse de, sıvılarda, hücrelerde floresan moleküler hareket çalışmaları veya monomoleküler tabakalar ve iyonik sıvılar gibi yeni yapısal motifler gibi kimyasaldan fiziksel ve biyolojike kadar diğer sistemlere de uygulanabilir. Bu yordamı başlatmak için, metin protokolünde belirtildiği gibi gerekli stok çözümleri ve yeşil mini jeller hazırlayın. Sonra biraz buz alın ve ışıkları karartın.
Bir cam Dounce homogenizer kullanarak, tamamen TMK tampon yaklaşık bir ila iki mililitre ıspanak yaprakları homojenize. Basit bir filtreleme aygıtı oluşturmak için hassas bir görev silme yitirmesini ikiye bölün ve çeyreklere katlayın. Bir şırıngadan pistonu çıkarın ve katlanmış görev silmeyi şırınganın altına paketle.
Pipet yaprak görev silme filtresinin ortasına homojenate, sonra filtre ile homojen geçmek ve 1.5 mililitrelik centrifuge tüp içinde toplamak için piston kullanın. Homojeni 5, 000 g ve 4 santigrat derecede 10 dakika boyunca sentrifün leyin ve thylakoid membranlar da dahil olmak üzere çözünmez malzemeyi peletleyin. Supernatant atın ve TMK tampon bir mililitre pelet resuspend.
Her örnekten klorofil çıkarmak için, 50 mikrolitrelik bir aliquot alın ve 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Metanol 950 mikrolitre ekleyin, tüp kapağı, ve birkaç kez ters çevirerek karıştırın. Çökelmiş proteinleri peletlemek için 10,000 g'de 10 dakika santrifüj.
Klorofil konsantrasyonu ölçümlerini kılavuz olarak kullanarak, her tüp aynı toplam miktarda klorofil içerene kadar her numuneden gerektiği gibi bir miktar çıkarın ve atın. Thylakoid membranları yeniden peletlemek için 10 dakika boyunca 5, 000 g santrifüj. Peleti bozmadan tüm supernatant'ı çıkarmaya dikkat edin ve süpernatant'ı çıkarın.
İlk olarak, TMK bir aliquot eritme 30%gliserol deterjan çözeltisi. Karıştırmak ve buz üzerinde çözüm tutmak için birkaç kez ters. Peleti eritmek ve mililitre başına bir miligram son klorofil konsantrasyonu ile sonuçlanan deterjan çözeltisinin uygun bir hacim ekleyin.
Pipet, numunede köpürmekten kaçınmaya dikkat ederken tekrar tekrar yukarı ve aşağı. Daha sonra, thylakoid örnekleri nin soğumasını sağlamak için numuneyi buz üzerinde tutun. Çözünmezlik tamamlandıktan sonra, çözünmez malzemepelet için 10 dakika boyunca 10, 000 g ve dört derece santigrat derece örnek santrifüj, net sonuçlanan, koyu yeşil supernatant.
Bundan sonra, daha önce hazırlanmış 1.5 milimetrelik yerli jelin her kuyunun üzerine doğrudan 15 mikrolitre çözünürthylakoid süpernatant yükleyin. 1X çalışan tampon kullanarak, 100 volt yerli yeşil jel çalıştırmaya başlar. Dirençli ısıtmayı azaltmak için çalışma süresince tüm jel tankını ıslak buza yerleştirin.
Jel çalışma bittiğinde, elektroforez hücresinden çıkarın ve distile su ile jel plakaları çalışan tampon durulayın. Jel üst plaka çıkarın ve sonra distile su ile jel durulayın. Hala alt cam plaka üzerinde olan jeli buz üzerine yerleştirin;jel kullanılmadığında, üzerini plastik sargı ile kapatın ve kurumasını önlemek için karanlıkta tutun.
Daha sonra, TCSPC analizine devam etmeye hazır olduğunuzda her bir ilgi grubunu çıkarmak için keskin bir neşter veya jilet kullanın. Excised bant hiçbir kirletici bant malzeme içerdiğinden emin olun. Analiz edilen her kompleks için, 600 ile 800 nanometre arasında bir oda sıcaklığında floresan spektrum yapmak için bir floresan spektrometre kullanın.
Slaytların her iki ucuna da maskeleme bandı yerleştirin ve slaytların arasındaki boşluğu sıkıştırmadan sıkıca bir arada tutulmasını sağlayacak boşluk oluşturmak için birkaç kez katlayın, ardından jel dilimini iki cam mikroskopi slaytı arasına sıkıştırın. Sinyal saçılımını azaltacak pürüzsüz bir arayüz oluşturmak için cam slaytların kenarındaki jel dilimine az miktarda su ekleyin. Daha sonra, kiriş plakaların açık kenarından jel dilim vurur böylece Kiriş yolda jel sandviç kelepçe.
Her kompleks için, floresan emisyon spektrumu boyunca düzenli aralıklarla 10.000 toplam veri noktası toplayın. Belirli bir kompleksin verilerini analiz etmek için, önce toplanan tüm dalga boyları için her bozunma eğrisinin en yüksek yüksekliğini normalleştirin, ardından kuyruk her bozunma eğrisini metin protokolünde belirtildiği gibi kompleksin sabit durum floresan spektrumuyla eşleştirin. Yeşil jel elektroforez için temsili sonuçlar ıspanak thylakoids analizi için ideal bir sonuç bir örnek sağlar, net bir dizi nerede, keskin yeşil bantlar görünür.
Lanes 2 ve 3 olmayan bir gradyan% 5 akrilamid jel basit thylakoid izolasyon ve elektroforez daha tipik sonuçlar mevcut. Lanes 4, 5, ve 6 thylakoid örnek isibilizasyon altında artan dereceler nedeniyle kötü sonuçlar bir örnek sağlar, lane 7 Arabidopsis thylakoids ıspanak yerine kullanıldığında elde edilebilir sonuçları gösterir. TCSPC verilerinin veri eğrileri aynı zaman kaydına ayarlandıktan sonra, eğrilerin verilerin ilk analizi olarak karşılaştırılmasına olanak tanıyan aynı tepe yüksekliğe normalleştirilebilir.
Farklı komplekslerden gelen tepe normalleştirilmiş bozunma eğrileri daha sonra belirli bir dalga boyunda birbirleriyle kaplanabilir, böylece kompleksler arasındaki davranış farklılıkları görselleştirilebilir. Çürüme eğrileri eşleşen kuyruk çürüme ile ilişkili spektrumların inşaat sağlar. Burada görüldüğü gibi, LHCII için çürüme ile ilişkili spektrum dinamik özelliklerin eksikliği için dikkat çekicidir ve LHCII floresan spektrumunun şekli zaman içinde sinyal bozunur aynı kalır.
Floresan spektrumunun çürümesi de gecikti ve maksimum floresana ulaşmak için 100 pikosaniye gerekiyor. Bu, floresan çürüğü olarak enerji karmaşık içinde enerjik farklı pigmentler arasında transfer olmadığını göstermektedir. Çürüme ile ilişkili spektrum daha sonra Band 5 kompleksi için inşa edilmiştir.
LHCII ile karşılaştırıldığında, Band 5'ten gelen floresan çok daha hızlı bir şekilde çürür, sadece 30 pikosaniyede maksimum yoğunluğa ulaşır ve 500 pikosaniyeden sonra başlangıç yoğunluğunun %20'sinden azına kadar çürür. Bu yordamı denerken, TCSPC verilerinin yorumlanmasının, örneğin 2 DSDS-PAGE ve Batı Blotlama veya kütle spektrometresi ile, incelenen komplekslerin bileşenlerini tanımlayan ek biyokimyasal bilgilere dayanacağını unutmamak gerekir.
