Questo metodo è utile per rispondere ad alcune domande chiave nel campo della ricerca sulla fotosintesi come i complessi tilakoidi putativi complessi fisiologicamente reali con componenti energeticamente connessi? Il vantaggio principale del gel verde e del protocollo TCSPC descritto qui è che è veloce e robusto. I campioni possono essere facilmente elaborati e analizzati in un solo giorno, rendendo meno preoccupanti i problemi di archiviazione e stabilità.
Sebbene il TCSPC possa fornire informazioni sui sistemi fotosintetici che abbiamo studiato qui, può anche essere applicato ad altri sistemi che vanno dalla chimica alla fisica e biologica come studi di moto molecolare fluorescente in liquidi, cellule o motivi nuovi-strutturali come strati monomolecolari e liquidi ionici. Per iniziare questa procedura, preparare le soluzioni stock necessarie e i mini gel verdi come delineato nel protocollo di testo. Quindi, ottenere un po 'di ghiaccio e fioca le luci.
Utilizzando un omogeneizzatore Dounce in vetro, omogeneizzare completamente le foglie di spinaci in circa uno o due millilitri di tampone TMK. Per creare un semplice dispositivo di filtraggio, tagliare a metà una delicata cancellazione delle attività e piegarla in quarti. Rimuovere lo stantuffo da una siringa, quindi imballare la pulitura dell'attività piegata nella parte inferiore della siringa.
Pipettare l'omogeneo foglia al centro del filtro task-wipe, quindi utilizzare lo stantuffo per passare l'omogeneo attraverso il filtro e raccoglierlo in un tubo di centrifuga da 1,5 millilitri. Centrifugare l'omogeneato a 5.000 g e quattro gradi Celsius per 10 minuti per pellettizzare il materiale insolubile, comprese le membrane tilacoidi. Scartare il supernatante e rimescolare il pellet in un millilitro di tampone TMK.
Per estrarre la clorofilla da ciascun campione, prendere un'aliquota di 50 microlitri e trasferirla in un tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri. Aggiungere 950 microlitri di metanolo, limitare il tubo e mescolare inverterlo più volte. Centrifuga a 10.000 g per 10 minuti per pellettare le proteine precipitate.
Utilizzando le misurazioni della concentrazione di clorofilla come guida, rimuovere e scartare un po 'di volume da ciascun campione, se necessario, fino a quando ogni tubo non contiene la stessa quantità totale di clorofilla. Centrifugare a 5.000 g per 10 minuti per ri-pellettare le membrane tilacoidi. Rimuovere e scartare il supernatante, facendo attenzione a rimuovere tutto il supernatante senza disturbare il pellet.
In primo luogo, scongelare un'aliquota di soluzione detergente TMK 30%glicerolo. Invertire più volte per mescolare e mantenere la soluzione sul ghiaccio. Aggiungere un volume appropriato della soluzione detergente per sciogliere il pellet e provocare una concentrazione finale di clorofilla di un milligrammo per millilitro.
Pipetta su e giù ripetutamente mentre si fa attenzione a evitare schiuma nel campione. Quindi, tenere il campione sul ghiaccio per consentire ai campioni di thylakoid di solubilizzare. Al termine della solubilizzazione, centrifugare il campione a 10.000 g e quattro gradi Celsius per 10 minuti per pellettizzare il materiale insolubile, risultando in un supernatante verde scuro chiaro.
Successivamente, caricare 15 microlitri di supernatante tilakoide solubilizzato direttamente su ogni pozzo di un gel nativo da 1,5 millimetri precedentemente preparato. Utilizzando 1X running buffer, iniziare a eseguire il gel verde nativo a 100 volt. Posizionare l'intero serbatoio del gel sul ghiaccio bagnato per tutta la durata della corsa per mitigare il riscaldamento resistivo.
Quando il gel ha finito di funzionare, rimuoverlo dalla cella di elettroforesi e risciacquare il tampone di corsa dalle piastre di gel con acqua distillata. Rimuovere la piastra superiore dal gel e quindi risciacquare il gel con acqua distillata. Posizionare il gel, che è ancora sulla piastra di vetro inferiore, sul ghiaccio;
Successivamente, utilizzare un bisturi affilato o una lama di rasoio per asportare ogni banda di interesse quando si è pronti a procedere con l'analisi TCSPC. Assicurarsi che la fascia asportata non contenga materiale a banda contaminante. Per ogni complesso analizzato, utilizzare uno spettrometro fluorescente per creare uno spettro fluorescente a temperatura ambiente compreso tra 600 e 800 nanometri.
Posizionare il nastro adesivo su entrambe le estremità delle diapositive e piegarlo più volte per creare distanziale, che consentirà di tenere saldamente insieme le diapositive senza comprimere lo spazio tra, quindi inserire la fetta di gel tra due diapositive di microscopia in vetro. Aggiungere una piccola quantità di acqua alla fetta di gel sul bordo delle diapositive di vetro per creare un'interfaccia fluida che riduca la dispersione del segnale. Successivamente, bloccare il sandwich di gel nel percorso del fascio in modo che il fascio colpisca la fetta di gel attraverso il bordo aperto delle piastre.
Per ogni complesso, raccogliere 10.000 punti dati totali a intervalli regolari attraverso lo spettro di emissione di fluorescenza. Per analizzare i dati per un dato complesso, prima normalizza l'altezza di picco di ogni curva di decadimento per tutte le lunghezze d'onda raccolte, quindi la coda corrisponde a ogni curva di decadimento allo spettro di fluorescenza dello stato stazionario del complesso come delineato nel protocollo di testo. Risultati rappresentativi per l'elettroforesi del gel verde forniscono un esempio di risultato ideale per l'analisi dei thylakoidi spinaci, dove sono visibili un certo numero di bande verdi chiare e affilate.
Le corsie 2 e 3 presentano risultati più tipici del semplice isolamento dei tilacoidi e dell'elettroforesi su un gel di acrilammide non gradiente del 5%. Le corsie 4, 5 e 6 forniscono un esempio di scarsi risultati dovuti all'aumento dei gradi di sotto solubilizzazione del campione di thylakoid, mentre la corsia 7 dimostra i risultati che si possono ottenere quando vengono utilizzati thylakoidi arabidopsis al posto degli spinaci. Dopo che le curve di dati dei dati TCSPC sono state impostate sullo stesso registro di tempo, possono essere normalizzate alla stessa altezza di picco, il che consente di confrontare le curve come prima analisi dei dati.
Le curve di decadimento normalizzate a picco da diversi complessi possono quindi essere sovrapposte l'una all'altra ad una data lunghezza d'onda, permettendo di visualizzare le differenze di comportamento tra i complessi. La coda che corrisponde alle curve di decadimento consente la costruzione di spettri associati al decadimento. Come visto qui, gli spettri associati al decadimento per il LHCII sono notevoli per la mancanza di caratteristiche dinamiche e la forma dello spettro di fluorescenza LHCII rimane la stessa del decadimento del segnale nel tempo.
Anche il decadimento dello spettro di fluorescenza è ritardato, richiedendo 100 picosecondi per raggiungere la massima fluorescenza. Ciò suggerisce che l'energia non viene trasferita tra pigmenti energeticamente distinti all'interno del complesso man mano che la fluorescenza decade. Gli spettri associati al decadimento vengono quindi costruiti per il complesso della Banda 5.
Rispetto al LHCII, la fluorescenza della Banda 5 decade molto più rapidamente, raggiungendo l'intensità massima in soli 30 picosecondi e quindi decadendo a meno del 20% dell'intensità iniziale dopo 500 picosecondi. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che l'interpretazione dei dati TCSPC si baserà su ulteriori informazioni biochimiche che identificano i componenti dei complessi in esame, ad esempio da 2 DSDS-PAGE e Western Blotting o spettrometria di massa.
