この方法は、エネルギー的に接続された成分を有する生理学的に実際の複合体であるような光合成研究の分野で特定の重要な質問に答える上で有用である?ここで説明するグリーンゲルとTCSPCプロトコルの主な利点は、それが迅速かつ堅牢であるということです。サンプルは1日で簡単に処理および分析できるため、ストレージや安定性の問題が少なくなります。
TCSPCは、ここで研究してきた光合成システムに関する洞察を提供することができますが、液体、細胞、または単分子層やイオン液体などの新しい構造モチーフにおける蛍光分子運動の研究など、化学的および生物学的に至るまで、他のシステムにも応用できます。この手順を開始するには、テキスト プロトコルで説明されているように、必要なストック ソリューションと緑のミニゲルを準備します。次に、いくつかの氷を取得し、ライトを暗くします。
ガラスDounceホモジナイザーを使用して、ほうれん草の葉をTMKバッファーの約1〜2ミリリットルで完全に均質化する。簡単なフィルタリングデバイスを作成するには、繊細なタスクワイプを半分にカットし、四分の一に折りたたみます。シリンジからプランジャーを取り出し、折りたたんだタスクをシリンジの底に詰め込みます。
葉をタスクワイプフィルターの中央にホモゲネートし、プランジャーを使用してフィルターを通してホモゲネートを通過させ、1.5ミリリットルの遠心分離管に集める。ホモゲネートを5,000gおよび摂氏4度で遠心分離し、チラコイド膜を含む不溶性物質をペレットに10分間与える。上清を捨て、TMKバッファーの1ミリリットルでペレットを再懸濁します。
各サンプルからクロロフィルを抽出するには、50マイクロリットルのアリコートを取り出し、1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブに移します。メタノールを950マイクロリットル加え、チューブをキャップし、数回反転して混ぜます。遠心分離機を10,000gで10分間ペレットし、沈殿したタンパク質をペレット化した。
クロロフィル濃度測定を参考に、各チューブに同じ総量のクロロフィルが含まれるまで、必要に応じて各サンプルから体積を除去して廃棄します。5,000gで10分間遠心分離機を用い、チラコイド膜を再ペレット化する。上清を取り除き、ペレットを邪魔することなく上清をすべて除去するように注意してください。
まず、TMK 30%グリセロール洗剤溶液のアリコートを解凍する。数回反転して溶液を氷の上に入れ、保ちます。適切な量の洗剤溶液を加えてペレットを溶解し、1ミリリットル当たり1ミリグラムの最終的なクロロフィル濃度を得る。
ピペットはサンプル中の泡立ちを避けるように注意しながら繰り返し上下します。その後、チラコイドサンプルが可溶化できるようにサンプルを氷の上に保管します。可溶化が完了した後、不溶性物質をペレット化するために10,000gおよび摂氏4度で遠心分離し、透明で濃緑色の上清をもたらす。
この後、可溶化したチラコイド上清の15マイクロリットルを、以前に調製した1.5ミリメートルの天然ゲルの各ウェルに直接ロードします。1Xランニングバッファを使用して、100ボルトでネイティブグリーンゲルの実行を開始します。ランの間、ゲルタンク全体を湿った氷の上に置き、抵抗加熱を軽減します。
ゲルの作動が終了したら、電気泳動セルから取り出し、蒸留水でゲルプレートのランニングバッファをすすきます。ゲルから上板を取り出し、蒸留水でゲルをすすきます。底ガラス板に残っているゲルを氷の上に置き、ゲルが使用されていない場合はラップで覆い、乾燥を防ぐために暗闇の中に保管します。
次に、TCSPC 分析を進める準備ができたら、鋭いメスまたはカミソリの刃を使用して、対象の各バンドを切除します。切除バンドに汚染バンド材料が含まれていることを確認します。分析される各複合体について、蛍光分光計を使用して、600~800ナノメートルの間に室温蛍光スペクトルを作ります。
スライドの両端にマスキングテープを置き、それを数回折りたたんでスペーサーを作成し、間のスペースを圧縮せずにスライドをしっかりと一緒に保持し、2つのガラス顕微鏡スライドの間にゲルスライスを挟みます。ガラススライドの端にあるゲルスライスに少量の水を加え、信号散乱を低減する滑らかなインターフェースを作成します。次に、ビームがプレートの開いた端を通ってゲルスライスに当たるように、ゲルサンドイッチをビームパスにクランプします。
各複合体について、蛍光発光スペクトル全体で一定間隔で10,000の合計データポイントを収集します。特定の複合のデータを分析するには、まず収集されたすべての波長について各減衰曲線のピーク高さを正規化し、次に、テキストプロトコルで概説されているように、各減衰曲線を複合体の定常状態蛍光スペクトルに合わせてテールします。グリーンゲル電気泳動の代表的な結果は、透明で鋭い緑色のバンドが多数見えるほうれん草のチラコイドの分析に理想的な結果の一例を提供する。
Lanes 2および3は、非勾配5%アクリルアミドゲル上の単純なチラコイド単離および電気泳動からより典型的な結果を提示する。レーン4、5、および6は、チラコイドサンプルの可溶化下の程度の増加による悪い結果の例を提供し、レーン7は、ほうれん草の代わりにシロイヌズナ症のチラシイドを使用したときに達成できる結果を示している。TCSPC データのデータカーブが同じ時間レジスタに設定された後、それらは同じピーク高さに正規化することができ、データの最初の分析として曲線を比較することができます。
異なる複合体のピーク正規化減衰曲線を、指定された波長で互いに重ね合わせて、複合体間の挙動の違いを視覚化することができます。減衰曲線に一致するテールは、減衰関連スペクトルの構築を可能にします。ここで見られるように、LHCIIの崩壊関連スペクトルは動的特徴の欠如のために顕著であり、LHCII蛍光スペクトルの形状は時間の経過とともに減衰する信号と同じままである。
蛍光スペクトルの崩壊も遅れ、最大蛍光に達するために100ピコ秒を必要とする。これは、蛍光が減衰するにつれて、複合体内のエネルギーがエネルギーによって異なる顔料の間で伝達されないことを示唆している。減衰関連スペクトルはバンド 5 の複合体のために構築されます。
LHCIIと比較すると、バンド5の蛍光ははるかに急速に減衰し、わずか30ピコ秒で最大強度に達し、500ピコ秒後の初期強度の20%未満に減衰します。この手順を試みる間、TCSPCデータの解釈は、例えば、2 DSDS-PAGEおよびウェスタンブロッティングまたは質量分析によって、研究中の複合体の成分を識別する追加の生化学的情報に依存することを覚えておくことが重要です。
