מערכת שפופרת HUVEC להערכת השפעת מוצרים טבעיים על אנגיוגנזה

Assay היווצרות צינור הוא מבחן במבחנה ללמוד את המנגנונים המולקולריים שבבסיס מספר צעדים שמובילים להיווצרות של כלי דם חדשים. חקירה זו מאפשרת לזהות תרכובות ואיתות מפלים הקשורים אנגיוגנזה. עם בדיקה אחת, אנו מסוגלים להראות כי תרכובת טבעית כמו RGWE מפחיתה את היכולת של תאים אנדותל ליצור מבנה דמוי צינור, אינם משפיעים על הכדאיות של התא, כי השפעה זו תלויה בהפעלת מסלול MEK / ERK. חשוב לבצע את הבדיקה עם המספר הנכון של תאים. למעשה, מעט מדי או תאים רבים מדי לא יכלו לאפשר היווצרות נכונה של צינורות. מסיבה זו, מומלץ לבצע בדיקה ראשונית כדי לגלות את המספר הנכון של התאים. לוקה אולגה פסטורמינו, דוקטורנטית במעבדה שלי, תראה את הנהלים. ראשית, לאסוף עלי רוטה graveolens במהלך חודשי האביב והקיץ. שים 250 גרם של עלים קצוצים בבקבוק חרוט, ולהוסיף ליטר אחד של מים מזוקקים, להרתיח, ולסנן, כמתואר בכתב היד. למחרת, להשתמש lyophilizer כדי lyophilize תמצית עלה. לאחר קבלת האבקה, שוקלים אותה ומחלקים אותה לאליקוטים. תרבות HUVECs במדיום צמיחת תא אנדותל, על פי פרוטוקול הטקסט. כאשר התאים מגיעים ל- 80%confluency, מעבר התאים ביחס של אחד עד שלושה. השתמש בתאים המתקבלים בין מעבר 2 למעבר חמש. לאחר HUVECs מעבר להגיע 70%confluency, לבצע חציית אותם עם מיקרוגרם אחד של הווקטור המכיל את הגן של עניין.לשלב מיקרוגרם אחד של DNA עם שלושה microliters של Lipofectamine מדולל 2000.Then, להסיר את המדיום מן HUVECs, ולהחליף אותו עם מיליליטר אחד של מדיום שלם טרי. מוסיפים את פתרון ההצטלפות לתאים, ו דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס, וחמישה אחוזים פחמן דו חמצני. שלוש שעות לאחר טרנסווט, מוסיפים שבעה מיליליטר של מדיום שלם טרי, ו דגירה התאים במשך 24 עד 48 שעות נוספות. מיד לפני הכנת המרתף, הניחו צלחת מצוננת מראש של 96 בארות על קרח, והוסיפו 50 מיקרוליטרים של מטריצה קרה לכל באר. בעוד הצלחת דגירה, לשטוף את HUVECs עם מיליליטר אחד של פתרון PBS / EDTA. לאחר מכן, להוסיף מיליליטר אחד של פתרון טריפסין-EDTA לתאים, ו דגירה במשך חמש דקות ב 37 מעלות צלזיוס.לאסוף את המדיום המכיל את התאים התלויים, לקצור את התאים באמצעות צנטריפוגה. לאחר מכן, בצע שימוש חוזר בתאים במיליליטר אחד של PBS. העבר 0.2 מיליליטר של ההשעיה התא ל 0.5 מיליליטר של PBS עם פתרון כחול trypan. לאחר החזקת ההשעיה בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות, לספור את התאים B