המטרה הכוללת של הפרוטוקול היא ליצור מודל עכבר אנושי עם מערכת חיסונית אנושית תפקודית וכבד באמצעות תאי גזע hematopoietic אנושי ואתר hepato. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בכבד גנטי עכברים אנושיים. שיטה זו מספקת כלי רב עוצמה לחקר אימונופתולוגיה הנגרמת על ידי HIV כפי שנצפה אצל אנשים.
הדגמת התהליך תהיה על ידי ימין סאן, מפקח מהמחלקה לפתולוגיה ומיקרוביולוגיה, יחד עם ואמין וואנג ו אדוורד מקרוב, טכנולוג מחקר. כדי להתחיל, להעביר דם חבל הטבור שנאסף צינורות heparinized לארון זרימה למינאר סטרילי. הוסף PBS עד שהנפח יגדל ל- 35 מיליליטר.
שכבת המדגם על גבי מדיום הפרדת לימפוציטים צנטריפוגה זה 400 פעמים G וב ארבע מעלות צלזיוס במשך 35 דקות ללא הפסקות. לאחר מכן, להסיר בזהירות את שכבת הפלזמה העליונה ולהשתמש פיפטה העברה להעביר את ממשק מעיל באפי לבן לצינור חדש. להשעות מחדש את המעיל באפי ב 30 עד 40 מיליליטר של חיץ קר כקרח.
באמצעות פיפטה, לשלב 20 microliters של ההשעיה התא עם 20 microliters של 0.4% trypan כחול. Pipette 10 microliters של תערובת זו לתוך הפתח החיצוני של אחד משני התאים של שקופית ספירה, ולהוסיף את השקופית לתוך מונה תא אוטומטי לספור את התאים. צנטריפוגה התאים ב 300 פעמים G ו בארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
בזהירות שאפו את העל-טבעי והוסיפו 300 מיקרוליטרים של חיץ קר כקרח. הוסף 100 microliters של קולטן FC אנושי חוסם reagent ו 100 microliters של עכבר חד שבטי נגד אדם CD34 נוגדנים הוסיף MicroBeads עבור עד 100 מיליון תאים. דגירה במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס.
מוסיפים 10 מיליליטר של חיץ קר כקרח כדי לשטוף את התאים וצנטריפוגה זה 300 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. בזהירות להסיר את supernatant ולהשעות מחדש את גלולה ב 500 microliters של חיץ קר קרח. לאחר מכן, מקם עמודת LS בחירה חיובית בשדה מיון התאים המופעלים מגנטית והעביר אותה באמצעות שלושה מיליליטר של חיץ קר כקרח.
טען את הדגימה לתוך עמודת LS שיכולה ללכוד MicroBeads מאוגד לתאים חיוביים CD34 אנושי בדגימות, ולאפשר לו לזרום תחת השפעת כוח הכבידה לתוך צינור האיסוף. לשטוף את העמוד שלוש פעמים עם חיץ קר כקרח ולאסוף את eluent באותו צינור איסוף. לאחר מכן, לצלול את העמודה עם חמישה מיליליטר של חיץ קר קרח כדי ל מרמז על CD34 תאים חיוביים לתוך צינור אוסף חדש.
חזור על ההליך כדי להשיג טוהר של מעל 90%Next, השתמש בצבע כחול trypan ו hemocytometer לספור את התאים החיוביים CD34 חמק. לאחר הספירה, צנטריפוגה התאים ב 300 פעמים G במשך חמש דקות. השלך את העל-טבעי והשהה מחדש את התאים ב-125 מיקרוליטרים של PBS להזרקה שתשמש באופן מיידי בהשתלה.
כדי לבדוק את הטוהר של ה-CD34 חיובי eluent, לקחת 50 microliters של ההשעיה דגירה אותו עם 10 microliters של PE גדוש נוגדן CD34 אנטי אנושי בארבע מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. לאחר מכן, לשטוף מחדש להשעות את התאים PBS ולהמשיך לבצע ציטומטריה זרימה. לאחר הרכישה, נתח את הנתונים כמפורט בפרוטוקול הטקסט.
ראשית, לאחזר ולהפשיר את hepatocytes cryopreserved כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, להסיר את הכובע הביולוגי ויוצקים את hepatocytes מופשר לתוך צינור חרוט 50 מיליליטר המכיל מדיום הפשרה מחומם. רוק הצינור ביד במשך כמה שניות כדי להשעות את התאים.
גלולה התאים ב 100 פעמים G ובטמפרטורת החדר במשך שמונה דקות. שטפו את התאים המופרעים ב-PBS עם 0.1%BSA ואספו אותם עם HSPCs טריים או מופשרים ב-PBS לנפח סופי של 80 מיקרוליטרים לעכבר. ראשית, לצרף קצה אחד של צינור הארכה סטרילית למחט 30 מד ואת הקצה השני למזרק מיליליטר אחד.
למלא את המזרק עם ההשעיה של HEPs בריכה ו HSPCs. להתאים את המזרק ב חריץ של פיפטה מחלק חוזרת ולהתאים את המתקן כדי לוותר על 10 microliters בכל עיתונות. לגלח כל עכבר כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט ולשפשף את הצד השמאלי של הגוף של כל עכבר עם 10%povidone יוד ואחריו 70% אלכוהול isopropyl.
באמצעות מספריים מסוג Vannas, לעשות חתך קטן בעור, שריר ו peritoneum בצד שמאל של הקיר הצפי להיכנס לחלל הצפי כ 5 מילימטרים מתחת לקצה התחתון של כלוב הצלעות. אתר את הטחול ולהשתמש מדפים כדי למשוך אותו מעט לאזור ההפעלה לגישה קלה ולהכניס את מחט 30 מד לתוך הקוטב התחתון של הטחול. לאחר מכן, לפתוח את הבוכנה של פיפטה מחלק ולחלק 10 microliters של נפח בכל פעם, עם מגבלה של 60 עד 80 microliters לכל טחול.
לסגת את המחט לאט ולגזור את הטחול עם קליפים קשירה באמצעות קשירה applier. לאחר מכן, השתמשו במוליך כותנה רטוב עם PBS סטרילי כדי לדחוף את הטחול בחזרה לחלל הגוף. השתמש בתבנית תפר מופרעת כדי לסגור את שכבת השריר של דופן הבטן.
השג סגירת עור עם תבנית תפר מופרעת באמצעות תפרים שאינם ניתנים לספיגה. העבר את כל החומרים הדרושים למתקן ייעודי של Biosafety רמה 2 פלוס. ללבוש ציוד הגנה אישי כולל כיסוי חד פעמי כל השמלה, כיסויי נעליים, מסכת פנים וכפפות כפולות, כולל כפפות עמידות לחתוך, בכל עת תוך כדי עבודה עם הנגיף.
בחר עכברים עם ארגון מחדש של יותר מ 15% של תאים חיוביים CD45 אנושי עם נוכחות של אלבומין אנושי בסרום עבור זיהום HIV-1. תוך-אפית להזריק את העכברים עם 1, 000 כדי 10, 000 רקמות תרבות מינונים זיהומיות של 50 HIV-1 ADA בנפח של 100 כדי 200 microliters לכל עכבר. לאחר המתת חום העכברים, יש למלמל את הכבד מכל עכבר כמתואר בפרוטוקול הטקסט.
לאסוף ולתקן את הכבדים ב 4% paraformaldehyde לילה. הקמת מודל עכבר אנושי כפול עם כבד אנושי ותאי מערכת החיסון ניתן לפקח בקלות בכל שלב עם ELIZA פשוט מאוד cytometry זרימה, בהתאמה. ציטומטריית זרימה מבוצעת באופן קבוע כדי להעריך את התפתחות המערכת החיסונית תפקודית ולראות את ההשפעה של הידבקות ב- HIV על תאי החיסון.
בעכברים אנושיים כפולים, ההתפתחות של תאים חיסוניים תפקודיים יכולה לנוע בין 15 ל -90% משער הלימפוציטים. להערכת חריטה של hepatocytes אנושי, ELIZA עבור רמות אלבומין ספציפי לאדם מבוצע מדי חודש על סרום העכבר. עכברים חרובים הן HSPCs ו HEPs להראות רמות אלבומין ספציפיות לאדם החל בערך שבעה מיקרוגרם למיליליטר ל 377 מיקרוגרם למיליליטר בחודש אחד, ממשיך לגדול לאורך זמן התצפית.
ההשפעה של הידבקות ב- HIV על תאים חיסוניים אנושיים בדם של עכברים אנושיים כפולים מנוטרת על ידי ציטומטריית זרימה ועל HEPs בכבד על ידי אלבומין ספציפי לאדם ELIZA. על ידי חמישה שבועות, HIV-1 גורם לירידה ברמות אלבומין אנושי בסרום ויש דלדול של hepatocytes CK18 אנושי חיובי בחלקי הכבד של עכברים אנושיים כפולים. נמוך יותר של יחס של CD4 ל CD8 הוא ציין בדרך כלל בדם ובכבד של עכברים נגועים ב- HIV, בהשוואה לרמות שצוינו באותו עכבר לפני ההדבקה.
דם צריך להיות שכבתי בזהירות על גבי מדיום הפרדת לימפוציטים עבור בידודים של מעיל באפי. לניתוח, להחזיק את הטחול בעדינות ולהכניס את המחט בקוטב התחתון של הטחול. בעקבות הבידוד של תאי גזע hematopoietic, זה חיוני כדי לבדוק את הטוהר של CD34 תאי גזע hematopoietic חיובי, כדי למנוע CD3 תאים חיוביים זריקות חריפות של hepatocyte מתורם אחר.
כמו העכברים האנושיים מראים היבט פיזיולוגי של המערכת החיסונית האנושית והכבד, העכברים המפותחים יכולים להיות מנוצלים כדי לחקור פיזיותרפיה של HIV וזיהומים פיזיים שחמת הכבד.
