Protokolün genel amacı, insan hematopoetik kök hücreleri ve hepato sitesi kullanarak fonksiyonel insan bağışıklık sistemi ve karaciğer ile insanlaşmış bir fare modeli oluşturmaktır. Bu yöntem genetik karaciğer insanlaşmış farelerde anahtar sorulara cevap yardımcı olabilir. Bu yöntem, insanlarda gözlenen HIV'in neden olduğu immünpatolojiyi incelemek için güçlü bir araç sağlar.
Sürecin yanı sıra patoloji ve mikrobiyoloji bölümünden bir danışman olan Yimin Sun ve araştırma teknoloğu Edwrd Makarov tarafından gösterilecek. Başlamak için, heparinized tüpler toplanan göbek kordon kanı steril laminar akış kabine aktarın. Hacmi 35 mililitreye yükseltilene kadar PBS ekleyin.
Katman lenfosit ayırma orta üstüne örnek ve santrifüj 400 kez G ve hiçbir mola ile 35 dakika boyunca dört derece santigrat. Daha sonra, üst plazma tabakasını dikkatlice çıkarın ve beyaz buffy coat arayüzünü yeni bir tüpe aktarmak için bir transfer pipeti kullanın. 30 ila 40 mililitre buz gibi soğuk tampon da buffy ceket yeniden askıya.
Bir pipet kullanarak, hücre süspansiyonunun 20 mikrolitresini %0,4 trypan mavisi 20 mikrolitre ile birleştirin. Pipet 10 mikrolitre bu karışımın bir sayma slayt iki odacık larından birinin dış açılması içine, ve hücreleri saymak için otomatik bir hücre sayacı içine slayt ekleyin. Hücreleri 300 kez G'de ve 4 santigrat derecede 10 dakika santrifüj edin.
Dikkatle supernatant aspire ve buz soğuk tampon 300 mikrolitre ekleyin. 100 milyon hücreye kadar konjuge mikroboncuklar için 100 mikrolitre insan FC reseptör bloke reaktif ve monoklonal fare anti-insan CD34 antikor 100 milyon hücre için mikroboncuklar konjuge 100 mikrolitre ekleyin. 4 santigrat derecede 30 dakika kuluçkaya yat.
Hücreleri yıkamak için 10 mililitre buz gibi tampon ekleyin ve 10 dakika boyunca 300 kez G ve dört santigrat derece santrifüj. Dikkatle supernatant çıkarın ve buz gibi soğuk tampon 500 mikrolitre pelet yeniden askıya. Bundan sonra, manyetik aktif hücre sıralama alanına pozitif bir seçim LS sütun yerleştirin ve buz soğuk tampon üç mililitre ile geçmek.
Numuneyi, numunelerde insan CD34 pozitif hücrelerine bağlı MikroBoncukları tuzağa düşürebilen ve yerçekiminin etkisi altında toplama tüpüne akmasını sağlayan LS sütununa yükleyin. Sütunu buz gibi tamponla üç kez yıkayın ve elüent'i aynı toplama tüpünde toplayın. Daha sonra, cd34 pozitif hücreleri yeni bir toplama tüpüne dönüştürmek için beş mililitre buz gibi soğuk tampon içeren sütunu daldırın.
%90'ın üzerinde bir saflık elde etmek için prosedürü tekrarlayın Sonraki, elde edilen CD34 pozitif hücreleri saymak için trypan mavi boya ve hemositometre kullanın. Saydıktan sonra hücreleri 300 kez G'de beş dakika santrifüj edin. Transplantasyonda hemen kullanılacak bir enjeksiyon için 125 mikrolitre PBS'deki hücreleri atın ve yeniden askıya alın.
CD34 pozitif eluent saflığını kontrol etmek için, süspansiyon 50 mikrolitre almak ve 30 dakika boyunca dört derece santigrat de PE konjuge anti-insan CD34 antikor 10 mikrolitre ile kuluçka. Bundan sonra, yıkama ve PBS hücreleri yeniden askıya ve akış sitometri gerçekleştirmek için devam edin. Edinmeden sonra, metin protokolünde özetlenen verileri analiz edin.
İlk olarak, metin protokolünde belirtildiği gibi cryopreserved hepatositleri alın ve eritin. Sonra, biyo kap çıkarın ve ısıtılmış eritme orta içeren 50 mililitrelik konik tüp içine çözülmüş hepatositler dökün. Hücreleri askıya almak için tüpü birkaç saniye elle sallayın.
100 kez G ve sekiz dakika oda sıcaklığında hücreleri pelet. PBS'deki peletli hücreleri %0,1 BSA ile yıkayın ve pbs'de taze veya çözülmüş HSPC'lerle fare başına 80 mikrolitrelik son bir hacimle birleştirin. İlk olarak, steril uzatma tüpünün bir ucunu 30 gauge iğneye, diğer ucunu da bir mililitreşşile şırıngaya takın.
Şırıngayı havuzlu HEP'lerin ve HSP'lerin süspansiyonuyla doldurun. Şırıngayı tekrarlayan dağıtım pipetinin çentikine tonuyla töben edin ve dağıtıcıyı her prese 10 mikrolitre dağıtacak şekilde ayarlayın. Metin protokolünde belirtildiği gibi her faretıraş ve% 10 povison iyot ile her farenin vücudunun sol tarafında ovmak% 70 izopropil alkol izledi.
Vannas tipi makas kullanarak, göğüs kafesinin alt kenarının yaklaşık 5 milimetre altında periton boşluğuna girmek için periton duvarının solunda deri, kas ve periton küçük bir kesi yapmak. Dalağını bulun ve kolay erişim için çalışma alanına hafifçe çekmek için forseps kullanın ve 30 gauge iğneyi dalak alt kutbuna takın. Daha sonra, dağıtım pipetinin pistonunun kilidini açın ve dalak başına 60 ila 80 mikrolitre lik bir sınırla bir seferde hacmin 10 mikrolitresini dağıtın.
İğneyi yavaşça geri çekin ve bir ligasyon aplier kullanarak dalağını bağlama klipleri ile kırpın. Daha sonra, dalak geri vücut boşluğuna itmek için steril PBS ile ıslak pamuk uçlu aplikatörler kullanın. Karın duvarının kas tabakasını kapatmak için kesilmiş bir dikiş deseni kullanın.
Emilemeyen dikişler kullanarak kesilen dikiş deseni ile cilt kapanmasını gerçekleştirin. Gerekli tüm malzemeleri belirlenmiş bir Biyogüvenlik Seviye İki Plus tesisine aktarın. Virüsle çalışırken her zaman tek kullanımlık bir kapak, tüm gece elbisesi, ayakkabı kapakları, yüz maskesi ve kesmeye dayanıklı eldivenler de dahil olmak üzere çift eldiven içeren kişisel koruma ekipmanları giyin.
İnsan CD45 pozitif hücrelerinin %15'inden fazlasının yeniden yapılandırılmasına ve HIV-1 enfeksiyonu için serumda insan albumini bulunan fareleri seçin. İntraperitoneally fare başına 100 ila 200 mikrolitre hacminde 50 HIV-1 ADA 50 HIV-1 ADA enfeksiyöz dozlarda 1, 000-10, 000 doku kültürü enfeksiyöz doz ile fareler enjekte. Fareler ötenazi sonra, metin protokolünde belirtildiği gibi her fareden karaciğer ilerler.
Toplamak ve% 4 paraformaldehit gecede karaciğer düzeltmek. İnsan karaciğeri ve bağışıklık hücreleri ile çift insanlı fare modelinin kurulması, sırasıyla çok basit ELIZA ve akış sitometrisi ile her adımda kolayca izlenebilir. Akış sitometrisi fonksiyonel bir bağışıklık sisteminin gelişimini değerlendirmek ve HIV enfeksiyonunun bağışıklık hücreleri üzerindeki etkisini görmek için düzenli olarak yapılır.
Çift insanlaşmış farelerde, fonksiyonel bağışıklık hücrelerinin gelişimi lenfosit kapısının% 15 ila% 90 arasında değişebilir. İnsan hepatositlerinin engreftasyonunun değerlendirilmesi için, insana özgü albumin düzeyleri için ELIZA aylık olarak fare serumuna yapılır. Hem HSP'ler hem de HEP'ler ile engrafted fareler bir ay mililitre başına 377 mikrogram yaklaşık yedi mikrogram arasında değişen insana özgü albumin düzeyleri göstermek, gözlem süresi içinde büyümeye devam.
HIV enfeksiyonunun insan bağışıklık hücreleri üzerindeki etkisi çift insanlaşmış farelerin kanında akış sitometrisi ve karaciğerdeki HEP'ler üzerinde insana özgü albumin ELIZA tarafından izlenmektedir. Beş hafta içinde, HIV-1 serumda insan albumin düzeylerinde azalmaya neden olur ve çift insanlaşmış farelerin karaciğer bölümlerinde insan CK18 pozitif hepatositlerin tükenmesi vardır. CD4'ün CD8'e oranının daha düşük olduğu tipik olarak HIV ile enfekte olmuş farelerin kan ve karaciğerinde, enfeksiyon öncesi aynı farede belirtilen seviyelere göre görülür.
Kan buffy kat izolasyonları için lenfosit ayırma ortamı üstüne dikkatle katmanlı olmalıdır. Ameliyat için dalağı hafifçe tutun ve iğneyi dalağının alt kutbuna yerleştirin. Hematopoetik kök hücrelerin izolasyonundan sonra, CD3 pozitif hücrelerden ve farklı donörden akut hepatosit enjeksiyonlarından kaçınmak için CD34 pozitif hematopoetik kök hücrelerin saflığını kontrol etmek çok önemlidir.
İnsanlaşmış fareler insan bağışıklık sistemi ve karaciğer fizyolojik yönünü göstermek gibi, gelişmiş fareler HIV ve fiziksel enfeksiyonlar ve siroz fizyopatogenez irdelemek için kullanılabilir.
