프로토콜의 전반적인 목표는 인간 조혈 줄기 세포 및 헤파토 부위를 사용하여 기능적 인간 면역 체계및 간을 가진 인간화된 마우스 모델을 생성하는 것입니다. 이 방법은 유전 간 인간화 마우스에 있는 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 이 방법은 사람들에서 관찰된 바와 같이 HIV에 기인한 면역 병리학을 공부하는 강력한 공구를 제공합니다.
이 과정을 시연하는 것은 병리학 및 미생물학 부서의 감독자인 이명선(Yimin Sun)과 연구 기술자인 바이핀 왕과 에드워드 마카로프(Edwrd Makarov)가 할 것입니다. 시작하려면, 멸균 라미나르 흐름 캐비닛에 분리 된 튜브에서 수집 된 탯줄 혈액을 전송합니다. 볼륨이 35 밀리리터로 증가할 때까지 PBS를 추가합니다.
림프구 분리 매체와 원심분리기 위에 샘플을 400배, 섭씨 4도에서 35분간 나누어 드실 수 있습니다. 다음으로, 조심스럽게 상단 플라즈마 층을 제거하고 새로운 튜브에 흰색 버피 코트 인터페이스를 전송하는 전송 파이펫을 사용합니다. 얼음 차가운 버퍼의 30 ~40 밀리리터에 버피 코트를 다시 중단합니다.
파이펫을 사용하여 셀 서스펜션의 마이크로리터 20개에 0.4%의 마이크로리터 20개를 결합합니다. 파이펫 10 마이크로리터는 카운팅 슬라이드의 두 챔버 중 하나의 외부 개구부로, 셀을 계산하기 위해 자동화 된 셀 카운터에 슬라이드를 삽입합니다. 세포를 300배, 섭씨 4도에서 10분 동안 원심분리합니다.
조심스럽게 슈퍼 나티를 흡인하고 얼음 차가운 버퍼 의 300 마이크로 리터를 추가합니다. 인간 FC 수용체 차단 시약 100마이크로리터와 최대 1억 개의 세포에 대한 단일 클론 마우스 항인간 CD34 항체 컨쥬게이드 MicroBeads100 마이크로리터를 추가합니다. 섭씨 4도에서 30분 동안 배양하세요.
10 밀리리터의 얼음 차가운 버퍼를 추가하여 세포를 씻고 원심분리기는 300배, 섭씨 4도를 10분 동안 세척합니다. 상체를 조심스럽게 제거하고 얼음 차가운 버퍼 의 500 마이크로 리터에서 펠릿을 다시 중단합니다. 그런 다음, 자기 활성화 셀 선별 필드에 양수 선택 LS 컬럼을 배치하고 얼음 냉기 버퍼의 세 밀리리터로 통과한다.
샘플에서 인간 CD34 양성 세포에 바인딩된 MicroBeads를 트랩할 수 있는 LS 컬럼에 샘플을 적재하고 중력의 영향으로 수집 튜브로 흘러들어갈 수 있습니다. 얼음 차가운 버퍼로 컬럼을 세 번 씻고 동일한 수집 튜브에서 용액을 수집합니다. 그런 다음 CD34 양수 세포를 새로운 수집 튜브로 암시하기 위해 얼음 냉부 버퍼 5 밀리리터로 컬럼을 급락시합니다.
90% 이상의 순도를 달성하기 위해 절차를 반복하고, 트라이판 블루 염료와 혈안이계를 사용하여 경각증 CD34 양성 세포를 계산합니다. 계산 후, 원심 분리는 5 분 동안 300 배 G에서 세포를 분리합니다. 상체를 버리고 이식시 즉시 사용할 주사를 위해 PBS의 125 마이크로리터에서 세포를 다시 중단한다.
CD34 양성 용출물의 순도를 확인하려면 서스펜션의 50 마이크로리터를 복용하여 PE 컨쥬게이드 항인간 CD34 항체 10 마이크로리터로 30분 동안 섭씨 4도에 배양하십시오. 그 후, PBS에서 세포를 세척 및 다시 중단하고 유동 세포 측정을 진행한다. 수집 후 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 데이터를 분석합니다.
먼저 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 냉동 보존 된 간구를 검색하고 해동합니다. 그런 다음, 바이오 캡을 제거하고 해동 된 간구를 50 밀리리터 원판 튜브에 부어 따뜻하게 해동 매체를 함유한다. 세포를 일시 중단하기 위해 몇 초 동안 손으로 튜브를 흔들어.
100 배 G와 8 분 동안 실온에서 세포를 펠렛. PBS에서 펠릿 세포를 0.1%BSA로 세척하고 PBS에 신선하거나 해동된 HSPC를 마우스당 80 마이크로리터로 최종 부피로 풀을 짜십시오. 먼저 멸균 연장 튜브의 한쪽 끝을 30 게이지 바늘에 부착하고 다른 쪽 끝을 1 밀리리터 주사기에 부착합니다.
주사기를 풀링된 HEP 및 HSPC의 서스펜션으로 채우면 주사기를 반복적인 분배 파이펫의 노치에 맞추고 디스펜서를 조정하여 각 프레스에 10개의 마이크로리터를 분배합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 각 마우스를 면도하고 각 마우스의 왼쪽을 10%의 포비도요드로 스크럽하고 70%의 이소프로필 알코올을 사용하였다.
Vannas 유형 가위를 사용하여 복막 벽 왼쪽의 피부, 근육 및 복막에 작은 절개를 하여 늑골 케이지의 아래 가장자리 아래 약 5mm 의 복막 구멍에 들어갑니다. 비장을 찾아 서 봉위를 사용하여 작동 영역으로 약간 당겨 쉽게 접근하고 30 게이지 바늘을 비장의 하부 기둥에 삽입합니다. 다음으로, 디스펜싱 파이펫의 플런저를 잠금 해제하고 비장 당 60 ~80 마이크로 리터의 제한으로 한 번에 10 마이크로 리터를 분배합니다.
바늘을 천천히 철회하고 계합 심플리어를 사용하여 리깅 클립으로 비장을 잘라냅니다. 그런 다음 멸균 PBS로 젖은 면 팁 어플리케이터를 사용하여 비장을 다시 체공으로 밀어 넣습니다. 중단된 봉합사 패턴을 사용하여 복벽의 근육 층을 닫습니다.
흡수할 수 없는 봉합사를 사용하여 중단된 봉합사 패턴으로 피부 클로저작업을 수행합니다. 필요한 모든 재료를 지정된 생물 안전 레벨 2 플러스 시설로 이전합니다. 바이러스를 사용하여 항상 절단 저항 장갑을 포함하여 일회용 커버, 신발 커버, 얼굴 마스크 및 더블 장갑을 포함한 개인 보호 장비를 착용하십시오.
인간 CD45 양성 세포의 15% 이상의 재구성을 가진 마우스를 선택하고 HIV-1 감염을 위한 혈청에서 인간 알부민의 존재와 함께 선택하십시오. 마우스당 100~200마이크로리터의 부피로 1, 000~10, 000개의 조직 배양 전염성 투여량을 마우스에 주입한다. 마우스를 안락사한 후 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 각 마우스에서 간을 절제합니다.
수집 하 고 하룻밤 4%의 파라포름알데히드에 간을 수정합니다. 인간 간 및 면역 세포를 가진 이중 인간화 마우스 모형의 설립은 각각 아주 간단한 ELIZA 및 유동 세포질로 각 단계에서 쉽게 감시될 수 있습니다. 유동 세포측정은 기능성 면역 계통의 발달을 평가하고 면역 세포에 HIV 감염의 효력을 보기 위하여 정기적으로 수행됩니다.
이중 인간화 마우스에서 기능성 면역 세포의 개발은 림프구 게이트의 15 ~90 %까지 다양할 수 있습니다. 인간 간세포의 이식평가를 위해, 인간특유의 알부민 수준에 대한 ELIZA는 마우스 혈청에서 매월 수행된다. HSPC와 HEP를 이식한 마우스는 밀리리터당 약 7마이크로그램에서 한 달 동안 밀리리터당 377 마이크로그램에 이르는 인간 전용 알부민 수치를 보여주며 관찰 기간 동안 계속 성장하고 있습니다.
이중 인간화된 마우스의 혈액에 있는 인간 적인 면역 세포에 HIV 감염의 효력은 인간 특정 알부민 ELIZA에 의하여 간유 세포측정및 HEPs에 의해 감시됩니다. 5 주까지, HIV-1혈청에 있는 인간 적인 알부민 수준에 있는 감소를 일으키는 원인이 되고 이중 인간화한 마우스의 간 단면도에 있는 인간 CK18 양성 간구의 고갈이 있습니다. CD4에서 CD8에 대한 비율의 낮은 전형적으로 HIV 감염 마우스의 혈액과 간에서 관찰되며, 감염 전에 동일한 마우스에 표시된 수준에 비해.
혈액은 버피 코트의 격리를 위해 림프구 분리 매체 위에 신중하게 겹쳐야합니다. 수술의 경우 비장을 부드럽게 잡고 비장의 하부 극에 바늘을 삽입하십시오. 조혈 줄기 세포의 격리에 따라, CD34 양성 조혈 줄기 세포의 순도를 검사하는 것이 중요합니다 CD3 양성 세포와 다른 기증자로부터 간세포의 급성 주사.
인간화된 마우스가 인간 면역 계통과 간의 생리적 측면을 보여주기 때문에, 개발된 마우스는 HIV와 물리적 감염 및 간경변증의 생리병발생을 연구하기 위하여 이용될 수 있었습니다.
