Общая цель протокола заключается в создании гуманизированной модели мыши с функциональной иммунной системой человека и печенью с использованием человеческих гематопоэтических стволовых клеток и гепато сайта. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в генетической печени гуманизированных мышей. Этот метод является мощным инструментом для изучения иммунопатологии, вызванной ВИЧ, как наблюдается у людей.
Демонстрацией процесса будет Имин Сун, руководитель отдела патологии и микробиологии, а также Ваймин Ван и Эдврд Макаров, научный технолог. Для начала перенесите пуповинную кровь, собранную в гепаринизированных трубках, в стерильный ламинарный шкаф. Добавьте PBS до тех пор, пока объем не будет увеличен до 35 миллилитров.
Слой образца на вершине лимфоцитов разделения среды и центрифуги его 400 раз G и при четырех градусах по Цельсию в течение 35 минут без перерывов. Далее, тщательно удалите верхний плазменный слой и используйте передачу пипетки для передачи белого баффи пальто интерфейс на новую трубку. Повторно приостанавливать баффи пальто в 30 до 40 миллилитров ледяного буфера.
Используя пипетки, смешайте 20 микролитров клеточной подвески с 20 микролитров 0,4%трипан синий. Pipette 10 микролитров этой смеси во внешнее отверстие любой из двух камер подсчета слайда, и вставить слайд в автоматизированный счетчик ячейки для подсчета клеток. Центрифуга клетки в 300 раз G и при четырех градусах по Цельсию в течение 10 минут.
Тщательно аспирировать супернатант и добавить 300 микролитров ледяного буфера. Добавьте 100 микролитров рецепторов ФК человека, блокирующих реагент, и 100 микролитров моноклональных мышей анти-человеческих антител CD34, спряженных MicroBeads для до 100 миллионов клеток. Инкубировать в течение 30 минут при четырех градусах по Цельсию.
Добавьте 10 миллилитров ледяного буфера для мытья клеток и центрифуги его 300 раз G и четыре градуса по Цельсию в течение 10 минут. Аккуратно удалите супернатант и повторно приостановите гранулы в 500 микролитров ледяного буфера. После этого поместите положительный отбор колонки LS в магнитное активированное поле сортировки клеток и пройдите его с тремя миллилитров ледяного буфера.
Загрузите образец в колонку LS, которая может заманить MicroBeads, связанных с положительными клетками человека CD34 в образцах, и позволить ему течь под воздействием гравитации в трубку сбора. Вымойте колонку три раза с ледяным буфером и соберите элюент в той же трубке сбора. Затем окунитесь в колонку с пятью миллилитров ледяного буфера, чтобы узнать CD34 положительные клетки в новую трубку сбора.
Повторите процедуру для достижения чистоты более 90% Далее, используйте трипан синий краситель и гемоцитометр, чтобы подсчитать ускользать CD34 положительных клеток. После подсчета, центрифуга клеток на 300 раз G в течение пяти минут. Отбросьте супернатант и повторно приостановьте клетки в 125 микролитров PBS для инъекции, которая будет использоваться немедленно в трансплантации.
Чтобы проверить чистоту положительного элюента CD34, возьмите 50 микролитров подвески и инкубировать его с 10 микролитров PE конъюгированных анти-человеческих антител CD34 при четырех градусах цельсия в течение 30 минут. После этого, мыть и повторно приостановить клетки в PBS и приступить к выполнять поток цитометрии. После приобретения проанализируйте данные, изложенные в текстовом протоколе.
Во-первых, извлекать и оттаивать криоконсервированные гепатоциты, как указано в текстовом протоколе. Затем удалите биокамерку и вылейте размороженые гепатоциты в 50-миллилитровую коническую трубку, содержащую разогретую оттаивание среды. Рок трубки вручную в течение нескольких секунд, чтобы приостановить клетки.
Пеллет клетки в 100 раз G и при комнатной температуре в течение восьми минут. Вымойте гранулы клеток в PBS с 0,1%BSA и объединить их либо со свежими или оттаяли ГЦП в PBS до конечного объема 80 микролитров на мышь. Во-первых, прикрепите один конец стерильной удлинительной трубки к игле 30 калибра, а другой конец к одному миллилитровому шприцу.
Заполните шприц с подвеской объединили HEPs и HSPCs. Fit шприц в паз повторяющихся дозатора и настроить дозатор для дозирования 10 микролитров в каждом прессе. Бритье каждой мыши, как указано в текстовом протоколе и скраб левой стороне тела каждой мыши с 10%povidone йода следуют 70%изопропил алкоголя.
Используя ножницы типа Vannas, сделайте небольшой разрез в коже, мышцах и брюшной полости слева от брюшной стенки, чтобы войти в брюшную полость примерно на 5 миллиметров ниже нижнего края грудной клетки. Найдите селезенку и используйте миппы, чтобы слегка вытащить ее в операционную зону для легкого доступа и вставить 30 калибровочных игл в нижний полюс селезенки. Затем разблокировать поршень дозатора пипетки и обойтись 10 микролитров объема в то время, с ограничением от 60 до 80 микролитров на селезенку.
Убирайте иглу медленно и клип селезенки с лигатирование клипы с помощью перевязки applier. Затем используйте хлопчатобумажные аппликаторы, смоченные стерильным PBS, чтобы подтолкнуть селезенку обратно в полость тела. Используйте прерванный узор шва, чтобы закрыть мышечный слой брюшной стенки.
Выполнить закрытие кожи с прерванной шов шаблон с использованием неаспасаемых швов. Перенесите все необходимые материалы на назначенный объект Уровня биобезопасности Two Plus. Носите личное защитное оборудование, включая одноразовую крышку все платья, бахилы, маску для лица и двойные перчатки, в том числе вырезать устойчивые перчатки, во все времена во время работы с вирусом.
Выберите мышей с восстановлением более 15% положительных клеток человека CD45 и с наличием человеческого альбумин в сыворотке крови для ВИЧ-1 инфекции. Интраперитонально вводят мышам от 1000 до 10 000 тканей культуры инфекционных доз 50 ВИЧ-1 ADA в объеме от 100 до 200 микролитров на мышь. После усыпания мышей, акциз печени с каждой мыши, как указано в текстовом протоколе.
Соберите и исправить печени в 4%paraformaldehyde ночь. Создание двойной гуманизированной модели мыши с человеческой печенью и иммунными клетками можно легко контролировать на каждом шагу с помощью очень простой цитометрии потока и потока, соответственно. Цитометрия потока регулярно проводится для оценки развития функциональной иммунной системы и для того, чтобы увидеть влияние ВИЧ-инфекции на иммунные клетки.
У двух гуманизированных мышей развитие функциональных иммунных клеток может варьироваться от 15 до 90% лимфоцитов. Для оценки engraftment человеческих гепатоцитов, ЭЛИЗА для человека конкретных уровней альбумин выполняется ежемесячно на сыворотке мыши. Мыши, притязаемые как ГСП, так и HEPs, показывают уровни альбулина, специфичные для человека, варья от примерно семи микрограмм на миллилитр до 377 микрограмм на миллилитр в течение одного месяца, продолжая расти с течением времени наблюдения.
Влияние ВИЧ-инфекции на иммунные клетки человека в крови двух гуманизированных мышей контролируется цитометрией потока и на HEPs в печени человеком-специфическим альбумином ELIZA. К пяти неделям ВИЧ-1 вызывает снижение уровня альбумин человека в сыворотке крови и истощение человека CK18 положительных гепатоцитов в печени разделов двойной гуманизированных мышей. Более низкое соотношение CD4 к CD8 обычно наблюдается в крови и печени ВИЧ-инфицированных мышей, по сравнению с уровнями, отмеченными в той же мыши перед инфекцией.
Кровь должна быть слоистых тщательно на верхней части лимфоцитов разделения среды для изоляции баффи пальто. Для операции осторожно удерживайте селезенку и вставьте иглу в нижний полюс селезенки. После изоляции гематопоэтических стволовых клеток, очень важно проверить чистоту CD34 положительных гематопоэтических стволовых клеток, чтобы избежать CD3 положительных клеток и острых инъекций гепатоцитов от различных доноров.
Как гуманизированных мышей показать физиологический аспект иммунной системы человека и печени, развитых мышей могут быть использованы для изучения физиопатогенеза ВИЧ и физических инфекций и цирроза печени.
