פרוטוקול זה מספק מערכת זולה ומסתגלת כדי להעריך את הדינמיקה הזמנית של רמזים פלואורוכימיים על פיורניה Colletotrichum ופתוגנים צמחיים אחרים המדביקים פריחה מונחית. התקני איסוף מי גשמים רצפה חדשניים מאפשרים למשתמש לנטר ממריצים טבעיים ותנאים המשפיעים על התפתחות פתוגן באופן כמעט בזמן אמת באתר ספציפי. התחל הליך זה עם תרבות של Fiorniae Colletotrichum ממארח נגוע באופן טבעי כמתואר בפרוטוקול הטקסט.
כאשר מושבות מתחילות להתיז, פס conidia על עוד V 8 מיץ אגר המכיל צלחת תרבות התא לייצר תרבות sporulating בצפיפות גבוהה. לאחר שבעה ימים של צמיחה, השתמש בלולאה סטרילית סטנדרטית כדי לאסוף כמות קטנה של קונדיציה מתרבות הצפיפות הגבוהה על ידי נגיעה קלה בלולאה למסה הקונידיאלית. מערבבים את זה לתוך צינור צנטריפוגה 15 מיליליטר המכיל 10 מיליליטר של מים סטריליים deionized.
וורטקס מדגם זה במשך 10 שניות. באמצעות פיפטה סטנדרטית, לצלול למעלה ולמטה פעמים רבות כדי לערבב עוד יותר את המדגם. לאחר מכן מניחים טיפה של דגימת המערבולת על ההמוציטומטר ומהערכה את ריכוזי הנבגים.
כוונן את הריכוז ל-0.1 מיליון קונדיה למיליליטר של מים מזוקקים סטריליים עם נפח סופי של חמישה מיליליטר. זה נקרא השעיית נבג והוא נעשה רק מיד לפני השימוש בכל bioassay. כדי לבצע מיצוי פרחוני על בסיס כלורופורם, נקה את כל הרכיבים עם 95% אתנול פעמיים.
לאחר מכן לנקות את הרכיבים פעמיים עם כלורופורם כדי למנוע זיהום עבור כל מיצוי. אין לנקות את הכובעים מצופים PTFE עם כלורופורם כפי שהוא יפגע בהם. לאחר הניקוי, מניחים את הרכיבים בצד להתייבש במהופך.
לשלב חלק אחד פרחים מעובדים לתשעה חלקים כלורופורם ב beaker על ידי הוספת פרחים ולאחר מכן כלורופורם. בעדינות מערבולת במשך 30 שניות ומתח דרך מסך נירוסטה לתוך המק השני. יוצקים את התמצית המבוססת על כלורופורם מהקוקר השני לתוך צינור תרבות הזכוכית ומדביקים את מכסה PTFE.
עוטפים את המכסה בפרפילם כדי למנוע אידוי. אחסן את תמצית הפרחים המבוססת על כלורופורם שנוצרת בחושך כדי להפחית את השפלת האור בארבע מעלות צלזיוס עד לשימוש ניסיוני. חזור על עקירות עם דגימות מרובות כדי לספק שכפולים.
כדי ליצור התקן איסוף עבור כל מיקום שנבחר, השתמש במתג המחובר ללחיצה על מקדחה כדי לקדוח חור בתחתית ספריי. ואז לחתוך קו ישר מהחלק העליון של החור אל הפה של ספריי. עכשיו לקדוח ארבעה חורים שיווי משקל גדול מספיק כדי להשחיל את חוט מצופה פלסטיק בפה של ספריי.
חבר קצה אחד של חוטי הפלסטיק המהותרים קצה אחד חופשי. לקדוח חור גדול מספיק כדי להשחיל את תרסיס צבע או מתאם לתוך מכסה כובע צנטריפוגה 50 מיליליטר. לאטום את הליכי המשנה של המתאם עם parafilm כדי למנוע דליפה.
צרף את זה הן את כובע הצנטריפוגה ואת החלק מושחל של מרסס. ואז לחבר את צינור צנטריפוגה 50 מילימטר. צור ארבעה התקני איסוף לכל מיקום דגימה.
פרוס מכשירים במקומות נבחרים על ידי כיפוף כוסות מרסס כך שיתאימו לגבעולים. כוון את הצד החתך של המרסס כלפי מעלה באמצעות חוטי הפלסטיק הצבועים המחוברים לגזעולים אחרים. זה מבטיח מים חולפים על הפרחים נתפס.
כדי לאסוף מי גשמים מפרחי חמוציות, תחילה לנקב חום שמונה חורים שונים סביב הפה של המשפך באמצעות בדיקה מתכת. הכנס קשרים טוויסט לארבעה חורים. חבר את הקצוות האחרים למיקום הנגדי של החור הזה ויוצר תבנית חצייה מסודרת.
עוטפים את המשפך בקיטור בפרפילם ומניחים בצד. לקדוח חור גדול מספיק כדי להכניס את המשפך במורד הגבעול לתוך כובע צנטריפוגה 50 מיליליטר עם קצת צעד. הכנס את המשפך המוכן לתוך מכסה הצנטריפוגה.
לאחר גשמים או השקיה תקורה, להסיר ולהחליף את החלק התחתון של הצינור צנטריפוגה. צינורות איסוף מי גשמים יש לשנות במהירות לאחר הרטבת אירועים כפי שהם נוטים השפלה מזהמים טבעיים מגויסים נגר כגון חיידקים ופטריות אחרות. מניחים שתי שכבות של דיסקי נייר בתוך מנות תרבות להשרות עם שני מיליליטר של מים מזוקקים סטריליים.
לאחר מכן, מערבבים כמויות שוות של מים מזוקקים סטריליים ותמצית פרחונית על בסיס מים בשני צינורות מיקרוצנטריפוגה מיליליטר. לאחר מכן להוסיף נפח שווה של ההשעיה נבג מוכן שני צינורות מיקרוצנטריפוגה מיליליטר. ההכנה המתקבלת נקראת תערובת טיפול מיקווי.
לשליטה, להשמיט את חלק תמצית הפרחים ולהחליף עם מים מזוקקים סטריליים כדי לשמור על ריכוזים conidial עקבי. עכשיו מניחים כיסויי זכוכית מנוקים מראש על גבי מגבות נייר ספוג בתוך צלחת תרבות התא. מניחים טיפה 40 microliter של תערובת טיפול מים על מרכז כיסוי.
חזור על זה לטיפולים הרצויים כולל הפקד. ואז לסגור את צלחת תרבות התא. לאחר שכל הטיפולים והשכפולים חולקו, מניחים את כל הכלים המשוכפלים של תרבות התאים במיכל פלסטיק אטום ומטמיקים ב-25 מעלות צלזיוס בחושך.
בנקודות זמן שנקבעו מראש, להוסיף 10 microliters של fixative טיפות לעצור את הצמיחה ושמירה למחצה על ההר. לאחר תיקון נוסף, בזהירות להפוך את coverslips הצבת כל אחד מהם טיפה בצד למטה על שקופית מיקרוסקופ זכוכית כדי להקל על בדיקה מיקרוסקופית. כאשר כל הכיסויים נמצאים על מגלשות מיקרוסקופ זכוכית, להשאיר אותם להתיישב יבש חלקית מכסה המנוע זרימה במשך 20 דקות.
לספור את כל conidia נוכח על coverslip כולל conidia העיקרי, conidia נבט, ו conidia המשני שזה עתה נוצר, כמו גם אספרסיה. עבודה בהגדלה פי 400 או פי 200 בהיקף של 3.808 מילימטרים רבועים. במכסה המנוע של זרימה למינארית, הוסיפו שני כמויות שוות של מים מזוקקים סטריליים ונפח אחד של השעיית נבג לצינור מיקרוצנטריפוגה שני מיליליטר.
הניחו את תערובת הטיפול המים הזו בצד לביואסאיס של תמצית פרחים המבוססת על כלורופורם. במכסה המנוע של האדים, מניחים תא ואן T על מכסה זכוכית בתוך צלחת תרבות תאי הפלסטיק המוכנה. מחלקים 33 מיקרוליטרים של תמצית פרחונית מבוססת כלורופורם רצויה למרכז התא ומאפשרים להתייבש.
אל תיגע בקירות התא. לטיפול הבקרה, להוסיף כלורופורם בתולה. לאחר שהתמצית הפרחונית המבוססת על כלורופורם התייבשה, מחלקים 99 מיקרוליטרים של תערובת הטיפול המים המוכנה עם פיפטה סטנדרטית למרכז תא ואן טי.
לאחר מכן סגור את כל מנות תרבות התאים ודגירה. בנקודות זמן שנקבעו מראש, להוסיף 15 microliters של תיקון לתא ואן T ולתת לו לשבת לפחות חמש דקות כדי להבטיח כתמים פטרייתיים נאותים. לאחר מכן, הסר בזהירות את תא ואן טי.
בצע שלבים של היפוך נקודת כריכה ורכישת נתונים כבעבר. לאחר הערכה מיקרוסקופית של C.fiorniae ב 24 שעות לאחר חיסון, השוואה של conidia בנוכחות מים מזוקקים סטריליים לעומת תמצית פרחונית על בסיס מים מגלה עלייה דרמטית קונידיציה משנית היווצרות אפרסוריום. עם זאת, קונידיציה משנית לא היה ברור כמו בעת השוואת בקרת מים מזוקקים כלורופורם bioassay לתמציות מבוססות כלורופורם.
במקום זאת, הצמיחה C.fiorniae עברה לכיוון היווצרות appressorial. בבדיקה זו, בקרת מים מזוקקת סטרילית ועקירות פרחוניות מבוססות חמוציות על בסיס כלורופורם נבדקו ויזואלית באפס, שש, 12 ו-24 שעות לאחר החיסון. היווצרות אפפרסוריום החלה בשש שעות בתמצית הפרחים המבוססת על כלורופורם וגדלה בהתמדה לאורך נקודות הזמן הבאות.
תוצאה זו תומכת בממצא כי פרחים להפחית את הזמן הדרוש כדי ליצור מבני זיהום. ניהול מחלות עבור פטריות נרקבות פירות לעתים קרובות כרוך יישומים קוטל פטריות זמן פריחה. כאן, חמוציות כלורופורם מבוסס תמציות מתוך שלבי צמיחה מרובים של חמוציות הוערכו חזותית עבור שעווה משטח יעיל על C.fiorniae ב 24 שעות לאחר חיסון.
השחלות נאספו בחודש יוני, פירות לא בוגרים שנאספו בחודש יולי, וב אוגוסט, פירות שנקטפו שנאספו באוקטובר, ושליטה במים מזוקקים סטריליים נבדקו להיווצרות appressorial. תמציות מבוססות כלורופורם השחלות היו בעוצמה הגדולה ביותר של היווצרות appressorial המציין את החשיבות של פריחה מחזור החיים של C.fiorniae. הפתוגן הוא המרכיב החשוב ביותר בפרוטוקול זה.
פטריות יש להעביר מדיה טריים באופן שגרתי כדי לשמור על עקביות בין ניסויים. כל עבודה עם כלורופורם חייבת להתבצע במכסה המנוע של האדים מטעמי בטיחות. זה כולל הכנת חומרים וכלי זכוכית, הליכי מיצוי, ו מוליכות של bioassay מבוסס כלורופורם.
שילובים של נקודות זמן, פתוגנים, אוספי מי גשמים פרחוניים, או עקירות מארח יכול להיות מנוצל כדי להעריך אינטראקציות מארח-פתוגן שונים. מכשירי איסוף מי הגשמים והביואסות הנלוות להם יאפשרו לאחרים לעבוד עם ממריצים מארחים מגויסים במהלך אירועי גשם במערכות נתיבים רבות.
