פרוטוקול זה הוא משמעותי, כי הוא משתמש בשיטת הדמיה ללא כתמים במקום הדמיה מבוססת צבע על רקמת המוח האנושית שלאחר המוות, אשר מסייע לשמור על שלמות RNA. שימור RNA הוא יתרון גדול בפרוטוקול זה, כפי שהוא שימושי, לא רק ברקמת המוח האנושית שלאחר המוות, אלא גם סוגים אחרים של רקמות, עם פעילות RNase גבוהה. כדי להתחיל, להסיר את הרקמה מהמקפיא ולהחיל אותו על קרח יבש להובלה ל cryostat.
מניחים את המברשות הנקיות, הצ'אק והרקמות בהקפאה למשך 20 דקות לפחות, כדי לאפשר להם להגיע לטמפרטורה האופטימלית. עבור קריוסטאטים עם תאים כפולים וטמפרטורות מחזיקות דגימה, הגדר את טמפרטורת האובייקט למינוס 16 מעלות צלזיוס ואת טמפרטורת התא למינוס 18 מעלות צלזיוס. הגדר את עובי החלק של ההקפאה ל-14 מיקרומטר ואת עובי הקיצוץ ל-30 מיקרומטר.
לאחר מכן, לנקות את הבמה עם תערובת של אחד לאחד של Decontaminator RNase ו 70% אתנול, כדי למנוע הקפאה. להשיג להב קריוסטט חדש, חד פעמי ולנקות אותו עם decontaminator RNase. מניחים את הלהב הנקי במחזיק הלהב על הבמה.
לאחר מכן, לנקות את צלחת נגד רול עם Decontaminator RNase. חבר את הצלחת ניקה לבמה ולחכות לפחות 20 דקות עבור הלהב ואת צלחת נגד רול לרדת לטמפרטורה של קריוסטט. ראשית, לחתוך חתיכה קטנה של רקמה עבור חתך, לוודא כי החלק הוא כ 95% קליפת המוח הקטן.
מחזירים את הרקמה הנותרת לקרח יבש, או למקפיא, במינוס 80 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, התחילו לאט להוסיף OCT על גבי הצ'אק בהילוך איטי ועגול. לבנות שכבות של OTC עד שיש הר כשלושה מילימטרים גבוה מכסה את צ'אק.
כאשר OCT קפוא חלקית, אבל עדיין יש קצת נוזל במרכז, מניחים את הרקמות על גבי ההר. תן לרקמה לשבת על גבי OCT במשך 1 עד 2 דקות עד שהוא קפוא לחלוטין. לאחר מכן, להעביר את צ'אק עם OCT קפוא ורקמות לזרוע חיתוך קריוסטט.
התאימו את הרקמה כך שהיא תישטף עם להב החיתוך ותנו לרקמה לשבת בזרוע החיתוך במשך 20 דקות כדי להסתגל לטמפרטורה החדשה. הצעד הקריטי ביותר הוא לאפשר לרקמה להתאקלם בזרוע חיתוך ההקפאה כל עוד יש צורך. אם רקמות לגזרים, הדמיה של תא purkinje יהיה קשה מאוד.
אני ממליץ להשתמש בפיסות רקמה קטנות ודקה יותר, כדי לאפשר לרקמה להתאקלם מהר יותר. לאחר מכן, לאט לאט להזיז את הרקמה קרוב יותר ללהב. ברגע שהרקמות הגיעו ללהב, התחילו בתהליך הקיצוץ.
חותכים את הרקמה פעמיים עד שלוש פעמים, עד ששכבות קליפת המוח נראות לעין. לאחר מכן, מניחים ומיישרים את צלחת האנטי-רול ממש מעל להב ההקפאה. חותכים ארבעה עד שישה חלקים בעובי 14 מיקרומטר, ומצים כי חלקים חתוכים כראוי יהיו שטוחים מתחת לצלחת האנטי רול.
יישר את המקטעים החתוכים אופקית לאורך שלב ההקפאה. זווית שקופית להרים את כל חתיכות הרקמה בו זמנית. מיד לאחר חתך הרקמה, מניחים את השקופית במחזיק השקופית עם 70% אתנול על הקרח במשך שתי דקות.
העבר את השקופית למחזיק שקופית עם 95%אתנול על קרח למשך 45 שניות. לאחר מכן, מקם את השקופית במחזיק השקופית עם 100% אתנול בטמפרטורת החדר למשך שתי דקות. טובלים את השקופית שלוש פעמים במחזיק השקופית המכיל קסילן מספר אחת בטמפרטורת החדר.
לאחר מכן, מקם את השקופית במחזיק השקופית עם קסילן 2 בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. לעמוד את השקופיות למעלה ברדס אדים נקי ולתת להם אוויר יבש לפחות 30 דקות. אם מאחסנים את השקופיות, מניחים כל אחד לתוך צינור נפרד 50 מיליליטר ומ מניחים את הצינורות לתוך מקפיא במינוס 80 מעלות צלזיוס עד שבעה ימים.
ראשית, השתמשו במפרק RNase לניקוי שלב המיקרוסקופ וזרוע איסוף הכובעים. עם ידיים כפפות, מניחים את המגלשה על המיקרוסקופ וכובע אטום 500 מיקרוליטר בזרוע האיסוף. בהגדלה נמוכה, ליישר את הכובע אטום על הרקמה המוחית, לסמוך על כך הכובע מכסה את האזור כולו כי הוא דמיינו את פיסת העין.
השתמש במטרה חמש פעמים עד 10 פעמים כדי לדמיין את השכבות המוח הקטן. מקם את הסמן מעל המקטע שבו שכבה מולקולרית ושכבת תא גרנית מצטלבים. עבור להגדלה של פי 40 והדמי את תאי הפורקיניה.
לאחר מכן, להתחיל ללכוד אותם. כדי להתחיל באיסוף RNA לאחר המיקרו-דיסקטמנט, הוסף 50 מיקרוליטרים של מאגר תותבת התא למכסה אטום כשהכובע פונה כלפי מעלה. סגור בזהירות את הצינור מעל המכסה והמשך עם האוסף כמפורט בפרוטוקול הטקסט.
בפרוטוקול זה, טרי, קפוא, לאחר המוות, רקמת המוח האנושית מוכנה למיקרו-דיסקטקט לכידת לייזר UV. לאחר הניתוק של cryostat בזמן הציור המוקצב, השכבות התאיות של המוח הקטן נראות בקלות עם חמש פעמים ו 10 פעמים עדשות אובייקטיביות. כפי שניתן לראות כאן, דגירה קסילן נכונה גורמת לרקמה להיות כהה יותר ומתואם טוב יותר שכבות הסלולר מאשר אתנול לבד.
בעת חיתוך במיקרוסקופ לכידת לייזר, העדשה אובייקטיבית 40 פעמים נדרש כדי להבטיח לכידת רק תאים purkinje ולא הרקמה שמסביב. כפי שניתן לראות כאן, הדגירה הנכונה בקסילן מייצרת תמונה איכותית ללא פגע מורפולוגית בהשוואה ל קיבוע אתנול בלבד. יכולת החלקת הכיסוי של כובע אטום נבדקת לאחר מכן בעוד פרוטוקולים אחרים משתמשים בכובע מלא בנוזלים, כובעים אלה יכולים להפחית את הדמיית הרקמות ולגרום לתמונה המתקבלת להיות גרגירית וססגונית מתחת למיקרוסקופ.
עם זאת, הדמיה באמצעות כובע אטום גורמת למראה הרקמה החלקה כי הוא רך וחד יותר בצורה. תמונות מייצגות של תאי purkinje excised בהפקת כוח נמוך ובעוצמה גבוהה להראות הסרה מדויקת של רק את גוף התא purkinje. לאחר מכן, Rnase באיכות גבוהה מתקבל עבור רצף RNA הבאים.
שש דגימות מייצגות עברו מיצוי RNA ונוסו מחדש ב-14 מיקרוליטרים של מים נטולי Rnase וכל שש הדגימות ייצרו רנ"א באיכות גבוהה עם מספרי תקינות RNA השווים או גדולים משמונה. הדבר החשוב ביותר לזכור הוא כי איכות הרקמות היא הכל. אפילו חיתוך ומיקום שקופית יעשו או ישברו פרוטוקול זה.
בעקבות הליך זה, ניתן לבצע כל שיטה החוקרת RNA או DNA, במיוחד אנו בודקים את ה- RNA שלנו לביטוי גנים דיפרנציאלי, אך שאלות אחרות לגבי ויסות גנים יכולות להיחקר גם כן. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על כל סוג רקמה שיש לו מורפולוגיה ספציפית קווית שאינה דורשת שימוש באנטיגן או בריאגנטים ספציפיים לצבוע לזיהוי תאים מעניינים. אנו מקווים כי טכניקה זו תעזור לנו להבין את הגנטיקה של רעד חיוני ומחלות אחרות שיש להם פנוטיפ רעד.
הכימיקל המסוכן ביותר המשמש בפרוטוקול זה הוא קסילן. זה צריך להיות מטופל כראוי ברדס אדים, להיפטר כראוי, שקופיות צריך להיות מותר להתייבש כראוי עד לשימוש בשטח פתוח. בנוסף, בעת עבודה עם דגימות אנושיות, ניהול פסולת biohazardous, ובטיחות יש לנצל.
