Dieses Protokoll ist von Bedeutung, da es eine fleckenfreie Visualisierungsmethode anstelle einer farbbasierten Visualisierung auf post-mortem menschlichem Gehirngewebe verwendet, die dazu beiträgt, die Integrität der RNA zu erhalten. Die Konservierung von RNA ist ein großer Vorteil in diesem Protokoll, da es nützlich ist, nicht nur im post-mortem menschlichen Gehirngewebe, sondern auch in anderen Gewebetypen, mit hoher RNase-Aktivität. Um zu beginnen, entfernen Sie das Gewebe aus dem Gefrierschrank und legen Sie es auf Trockeneis für den Transport zum Kryostat.
Legen Sie die sauberen Bürsten, das Futter und das Gewebe mindestens 20 Minuten in den Kryostat, damit sie die optimale Temperatur erreichen können. Für Kryostate mit zwei Kammern und Probenhaltetemperaturen stellen Sie die Objekttemperatur auf minus 16 Grad Celsius und die Kammertemperatur auf minus 18 Grad Celsius ein. Stellen Sie die Schnittdicke des Kryostats auf 14 Mikrometer und die Trimmdicke auf 30 Mikrometer ein.
Als nächstes reinigen Sie die Stufe mit einer Eins-zu-eins-Mischung aus RNase-Dekontaminator und 70%Ethanol, um das Einfrieren zu verhindern. Besorgen Sie sich eine neue Einweg-Kryostatklinge und reinigen Sie sie mit dem RNase-Dekontaminator. Legen Sie die gereinigte Klinge in den Klingenhalter auf die Bühne.
Reinigen Sie dann die Anti-Roll-Platte mit dem RNase-Dekontaminator. Befestigen Sie die gereinigte Platte an der Bühne und warten Sie mindestens 20 Minuten, bis die Klinge und die Anti-Roll-Platte auf die Temperatur des Kryostats herunterkommen. Schneiden Sie zunächst ein kleines Stück Gewebe für die Schnitte, um sicherzustellen, dass der Abschnitt etwa 95% Kleinhirnkortex ist.
Das restliche Gewebe entweder in Trockeneis oder in einen Gefrierschrank bei minus 80 Grad Celsius zurückgeben. Als nächstes beginnen Sie langsam OCT auf dem Futter mit einer langsamen, kreisförmigen Bewegung hinzufügen. Bauen Sie Schichten von OTC auf, bis eine etwa drei Millimeter hohe Halterung das Futter bedeckt.
Wenn das OCT teilweise eingefroren ist, aber noch etwas Flüssigkeit in der Mitte hat, legen Sie das Gewebe auf die Halterung. Lassen Sie das Gewebe ein bis zwei Minuten auf dem OCT sitzen, bis es vollständig eingefroren ist. Dann das Futter mit dem gefrorenen OCT und Gewebe in den Kryostatschneidarm übertragen.
Stellen Sie das Gewebe so ein, dass es mit der Schneidklinge bündig ist, und lassen Sie das Gewebe 20 Minuten im Schneidarm sitzen, um sich an die neue Temperatur anzupassen. Der kritischste Schritt besteht darin, das Gewebe so lange wie nötig im Kryostat-Schneidarm zu akklimatisieren. Wenn Gewebe zerkleinert wird, wird die Visualisierung von Purkinje-Zellen sehr schwierig sein.
Ich empfehle die Verwendung kleinerer, dünnerer Gewebestücke, damit sich das Gewebe schneller akklimatisieren kann. Danach bewegen Sie das Gewebe langsam näher an die Klinge. Sobald das Gewebe die Klinge erreicht hat, beginnen Sie den Trimmprozess.
Schneiden Sie das Gewebe zwei- bis dreimal, bis die Kortexschichten sichtbar sind. Als nächstes platzieren und richten Sie die Anti-Roll-Platte direkt über der Kryostatklinge aus. Schneiden Sie vier bis sechs Abschnitte, die 14 Mikrometer dick sind, und beachten Sie, dass richtig geschnittene Abschnitte unter der Anti-Roll-Platte flach sein werden.
Richten Sie die Schnittabschnitte horizontal über die Kryostatstufe aus. Winkeln Sie eine Folie, um alle Gewebeteile gleichzeitig aufzunehmen. Unmittelbar nach dem Teilen des Gewebes die Rutsche mit 70% Ethanol zwei Minuten lang in den Schiebehalter legen.
Übertragen Sie die Rutsche 45 Sekunden lang auf einen Schiebehalter mit 95% Ethanol auf Eis. Als nächstes legen Sie die Rutsche in den Schiebehalter mit 100% Ethanol bei Raumtemperatur für zwei Minuten. Tauchen Sie die Rutsche dreimal in den Diahalter mit Xylol Nummer eins bei Raumtemperatur.
Legen Sie dann die Rutsche fünf Minuten lang bei Raumtemperatur in den Diahalter mit Xylol zwei. Halten Sie die Rutschen in einer sauberen Dunstabzugshaube hoch und lassen Sie sie mindestens 30 Minuten an der Luft trocknen. Wenn Sie die Dias lagern, legen Sie sie jeweils in ein separates 50-Milliliter-Rohr und legen Sie die Rohre bei minus 80 Grad Celsius für bis zu sieben Tage in einen Gefrierschrank.
Verwenden Sie zunächst den RNase-Dekontaminator, um die Mikroskopstufe und den Kappensammelarm zu reinigen. Mit handschuhen legen Sie das Dia auf das Mikroskop und eine 500 Mikroliter opake Kappe im Sammelarm. Richten Sie bei geringer Vergrößerung die undurchsichtige Kappe über das Kleinhirngewebe aus, um zu versichern, dass die Kappe den gesamten Bereich bedeckt, der im Augenstück visualisiert wird.
Verwenden Sie ein fünfmal- bis zehnfaches Objektiv, um die Kleinhirnschichten zu visualisieren. Platzieren Sie den Cursor über dem Abschnitt, in dem sich molekulare Schicht und Granual Zellschicht schneiden. Wechseln Sie zu einer 40-fachen Vergrößerung und visualisieren Sie die Purkinje-Zellen.
Beginnen Sie dann, sie einzufangen. Um die RNA-Sammlung nach der Mikrodissektion zu beginnen, fügen Sie 50 Mikroliter Zelllysepuffer zur opaken Kappe mit nach oben gerichteter Kappe hinzu. Schließen Sie die Röhre vorsichtig über die Kappe, und fahren Sie mit der Sammlung fort, wie im Textprotokoll beschrieben.
In diesem Protokoll wird frisches, gefrorenes, post-mortem, menschliches Hirngewebe für die UV-LasererfassungMikrosektion vorbereitet. Nach der Kryostat-Sektion in der zugeteilten Zeichnungszeit sind die zellulären Schichten des Kleinhirns mit fünf- und zehnfachen Objektiven gut sichtbar. Wie hier gesehen, führt die richtige Xylol-Inkubation dazu, dass das Gewebe dunkler wird und die zellulären Schichten besser abgrenzt als Ethanol allein.
Beim Schneiden am Laseraufnahmemikroskop wird die 40-fache Objektivlinse benötigt, um sicherzustellen, dass nur Purkinje-Zellen und nicht das umgebende Gewebe erfasst werden. Wie hier zu sehen, erzeugt die richtige Inkubation in Xylol ein qualitativ hochwertiges morphologisch intaktes Bild im Vergleich zur Ethanolfixierung allein. Die Deckschlupkfähigkeit einer opaken Kappe wird dann getestet, während andere Protokolle eine flüssigkeitsgefüllte Kappe verwenden, diese Kappen können die Gewebevisualisierung reduzieren und dazu führen, dass das resultierende Bild unter dem Mikroskop granular und schillernd ist.
Die Visualisierung durch eine undurchsichtige Kappe führt jedoch zu einem geglätteten Gewebebild, das weicher und schärfer ist. Repräsentative Bilder von verbrauchenden Purkinje-Zellen bei geringer Leistung und bei hoher Leistung zeigen eine präzise Entfernung nur des Purkinje-Zellkörpers. Danach wird eine hochwertige Rnase für die nachfolgende RNA-Sequenzierung erhalten.
Sechs repräsentative Proben wurden einer RNA-Extraktion unterzogen und in 14 Mikroliter Rnase-freiem Wasser resuspendiert, und alle sechs Proben produzierten hochwertige RNA mit RNA-Integritätszahlen von bis zu acht. Das Wichtigste, was man sich merken sollte, ist, dass Gewebequalität alles ist. Auch Schneiden und Schieben Platzierung wird dieses Protokoll machen oder brechen.
Nach diesem Verfahren könnte jede Methode, die RNA oder DNA untersucht, durchgeführt werden, insbesondere wir untersuchen unsere RNA auf Differentialgenexpression, aber auch andere Fragen zur Genregulation könnten untersucht werden. Diese Methode könnte auf jeden Gewebetyp angewendet werden, der eine spezifische abgegrenzte Morphologie hat, die nicht die Verwendung von Antigen- oder farbstoffspezifischen Reagenzien zur Identifizierung von von Von interesseen Zellen erfordert. Wir hoffen, dass diese Technik uns helfen wird, die Genetik von essentiellen Zittern und anderen Krankheiten zu verstehen, die einen Zittern-Phänotyp haben.
Die gefährlichste Chemikalie, die in diesem Protokoll verwendet wird, ist Xylol. Es sollte ordnungsgemäß in einer Dunstabzugshaube behandelt, ordnungsgemäß entsorgt werden, und Rutschen sollten ausreichend trocknen dürfen, bis sie in einem offenen Raum verwendet werden. Darüber hinaus sollten bei der Arbeit mit menschlichen Proben biogefährliche Abfallentsorgung und Sicherheit genutzt werden.
