אנו מודים לאוסטין פרו וג'ואאו-גילהרמה רוזה במעבדת Cvetanovic על עזרתם בפתרון בעיות ניתוחים ובחילוץ RNA ו- RTqPCR. מחקר זה ממומן על ידי מ'סבטנוביץ', R01 NS197387; | HHS מכוני בריאות לאומיים (NIH).

1. התקנה
<ol><li>לאסוף את הציוד הדרוש כולל מספריים עריפת ראש, מלקחיים קהים, מספריים ביתוש, מספריים וסקולריים, microspatula, מטריצת המוח של עכבר קשת, סכיני גילוח, 200 קצות צינור μL, צלחת פטרי זכוכית, שקופית זכוכית, ודלי קרח. הניחו את כל הציוד על כרית סופגת.</li>
	<li>מניחים צלחת פטרי, צלחת זכוכית ומטריצת מוח על קרח.</li>
	<li>בעזרת סכין גילוח בזווית אנכית, לקצץ כ 5 מ"מ את הקצה של קצה צינור 200 μL אחד. זה עושה את גודל הפתח בסוף הקצה על 1 מ"מ רוחב. זה צריך להיות מספיק כדי להכות את DCN. אבל זה יכול גם להיות מותאם לפי הצורך בהתאם לנתח. יש טיפים רבים מוכנים להחלפה קלה והתאמה.</li>
	<li>תווית 1.5 mL צינורות מיקרופוגה עם זיהוי בעלי חיים ואזור המוח הקטן (ארבעה צינורות לכל חיה).</li>
	<li>מלא מיכל קריוsafe עם חנקן נוזלי פלאש להקפיא רקמה לאחר החילוץ.</li>
</ol>2. מיצוי מוח ותח
כל הניסויים נערכו בהתאם להנחיות הוועדות לטיפול בבעלי חיים של אוניברסיטת מינסוטה.
<ol><li>המתת חסד את העכבר באמצעות חשיפה 5% CO2. לאחר הנשימה נפסק, לבצע נקע צוואר הרחם. לערוף את ראש העכבר עם מספרי עריפת ראש ולהשליך את הפגר בכלי הקיבול המתאים.</li>
	<li>לעשות חתך עם סכין גילוח לאורך קו הקשת המשיאלי של הראש מתחיל באף וממשיך כל הדרך חזרה. להפריד את העור, פרידה לכל צד של קו האמצע. השתמש בסכין הגילוח כדי לחתוך את השריר בכל צד, חיתוך מעבר לתעלות האוזן.</li>
	<li>באמצעות מספריים לנתח, לקצץ את כל אזורי חוט השדרה, עד שבו גזע המוח פוגש את המוח הקטן, זהיר לא לפגוע במוח הקטן.</li>
	<li>הכנס את אחד להבי המספריים של כלי הדם לחלל שבין גזע המוח לעמוד החוליות וחתכו לכיוון תעלת האוזן, הרימו את המספריים כדי לחתוך את העצם בצורה נקייה אך הגבילו את הנזק לרקמה.</li>
	<li>המשך לחתוך לאורך קצה הגולגולת כלפי מעלה לכיוון נורות הריח, ממשיך להרים תוך כדי חיתוך כדי להגביל את הנזק לרקמת המוח.</li>
	<li>באמצעות מלקחיים קהים, בעדינות לקלף את החלק האחורי של הגולגולת לחשוף את האזור האחורי של המוח ואת המוח הקטן.</li>
	<li>באמצעות המלקחיים הקהים לאורך קצה הגולגולת שנחתכו זה עתה, לקלף את שאר הגולגולת למעלה ומעל המוח. שלב זה צריך להסיר את רוב כובע הגולגולת, חושף את המוח.</li>
	<li>לקצץ את שאר הגולגולת עם מספריים וסקולריים ומלקחיים קהים, ניקוי רוב הגולגולת מהחלק העליון של המוח.</li>
	<li>בעזרת המיקרו-המרית, הרימו מעט את המוח והכופפו מתחת והחליקו למעלה כדי להסיר את נורות הריח מהגולגולת הנותרת ולנתק את הסיבים האופטיים. המוח צריך לצאת לחופשי בקלות בשלב זה.</li>
	<li>מניחים את המוח לתוך צלחת הפטרי היושב על קרח ולהסיר כל גולגולת שנותרה או פסולת אחרת.</li>
	<li>באמצעות המיקרו-המרית, הניחו בעדינות את המוח במטריצה של המוח עם צד גב למעלה. קח זמן כדי לוודא שהוא מוגדר ברמה במטריצה, במיוחד כי קו האמצע נופל במרכז המטריצה. מטריצה זו מיועדת לרקמת מוח עכבר בוגרת, רקמה מבעלי חיים צעירים או חולים עשויים לנוח נמוך יותר במטריצה, אך עדיין ניתן להשיג תוצאות ניתנות לשחזור על פני דגימות.</li>
	<li>הניחו סכין גילוח אחד לאורך קו האמצע של הקשת, וודאו שהלהב דוחף עד לתחתית המטריצה(איור 1B).</li>
	<li>מניחים סכין גילוח נוסף 1 מ"מ בצד הלהב הראשון(איור 1B). מניחים עוד שני להבים במרחק של 1 מ"מ זה מזה. התוצאה הסופית צריכה להיות שלושה להבים הממוקמים בצד אחד של המוח, כולם במרחק של 1 מ"מ זה מזה. תעשה את אותו הדבר לצד השני. בסך הכל, 7 להבים יוצבו 1 מ"מ זה מזה(איור 1C).</li>
	<li>בזהירות, לתפוס את הקצוות הקדמיים והאחזוריים של סכיני הגילוח ולהרים ישר מתוך המטריצה. ניתן להשליך את הרקמה בצד החיצוני של סכיני הגילוח.</li>
	<li>לאט, להפריד סכין גילוח אחד בכל פעם מהאחרים, נזהר לא לפגוע בקטעי הרקמה.</li>
	<li>להחליק בזהירות את קטע הרקמה את סכין הגילוח על שקופית הזכוכית עם microspatula. בסך הכל יהיו שישה מקטעי מוח קשתיים(איור 1D).</li>
	<li>ב-4 המקטעים הרחבים ביותר יהיה DCN גלוי (תיבה סגולה, איור 1D). כדי לבודד את DCN, להחזיק את קצה צינור 200 μL קצוץ בניצב מעל DCN ולדחוף למטה דרך הרקמה בחוזקה, מתנדנד בכל הכיוונים כדי לנתח באופן מלא את DCN מן הרקמה שמסביב. הרם ישר למעלה כדי להסיר את ה- DCN בצורה נקייה, ואשר חזותית את נוכחות הרקמה בקצה.</li>
	<li>מניחים אצבע אחת בחלק העליון של הקצה ולדחוף למטה, גורם לרקמה להתבלט החוצה. מניחים את הקצה לתוך צינור microfuge שכותרתו נכונה ולוודא כי ניקוב רקמה ממוקם בתחתית הצינור. חזור על 2.17 עבור שלושת החלקים הנותרים, הצבת אגרופי DCN באותו צינור. מניחים את הצינור לתוך חנקן נוזלי להקפאת הבזק. ייצוג הגודל של כל אגרוף באיור 1E.</li>
	<li>חלקים שחולצו DCN זכאים לחצי הכדור במוח הקטן. תרחיק את שאר רקמת המוח סביב המוח הקטן בחלקים האלה. השתמש במלקחיים קהים והרים בעדינות את מקטעי קליפת המוח הקטן בחצי הכדור והכניס לצינור המיקרו-פוגה המתאים. קיפאון פלאש.</li>
	<li>בשני החלקים האחרונים של המלל (תיבה כחולה בהירה, איור1D),הרחיקה את רקמת המוח המקיפה רק את המוח הקטן. בעזרת סכין גילוח, לעשות חתך המפריד בין lobules הקדמיים מן lobules האחורי. החתך צריך להיות רק לאחר היווצרות של lobule 6 ולא צריך לכלול lobule 10(איור 1F).</li>
	<li>באמצעות מלקחיים קהים, בזהירות למקם את החלקים קליפת המוח הקטן הקדמי ואת החלקים קליפת המוח הקטן האחורי לתוך צינורות microfuge שלהם בהתאמה להקפיא פלאש על ידי השארת הצינורות בחנקן נוזלי במשך 5 דקות. מכאן להמשיך להפקת RNA, או יכול לאחסן את הצינורות ב -80 °C (50 °F).</li>
</ol>3. חילוץ RNA 
הערה: פרוטוקול זה שונה מפרוטוקול קולד ספרינג הארבור לחילוץ RNA עם TRIzol20. TRIzol solubilizes חומר ביולוגי, מה שמאפשר לחלץ RNA.
<ol><li>מניחים את צינורות המיקרו-פוגה בקרח כדי למנוע מהרקמה להפשיר מהר מדי, יש למרוח 150 מיקרו-אל של TRIzol קר בצינור המיקרו-שפך. הומוגניזציה עם עלה מעוקר. ברגע שהרקמה הומוגנית, הזרימו את התמיסה למעלה ולמטה כדי להבטיח שלא נותרה רקמה שלמה. עוד לשבור את כל חתיכות רקמה קטנה על ידי משיכת אותו לתוך מזרק אינסולין כמה פעמים.</li>
	<li>מוסיפים עוד 350 μL של TRIzol וצינור למעלה ולמטה לערבב ביסודיות. בואו לשבת בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.</li>
	<li>הוסף 150 μL של כלורופורם לצינור לנער במרץ ולאחר מכן לתת מנוחה במשך 2-3 דקות. הכלורופורם מפריד את תמיסת הרקמה ההומוגנית לשלבים (רנ"א, DNA וחלבון).</li>
	<li>צנטריפוגה ב 12,000 x גרם, ב 15°C, במשך 10 דקות. ודא כי כל הצינורות הם באותו כיוון.</li>
	<li>בזהירות להסיר את הצינורות ולהגדיר את הטמפרטורה של הצנטריפוגה ל 4 מעלות צלזיוס. הסר רק את השלב מימי ברור לתוך צינור חדש (זה RNA), זהיר לא לשבש את interphase אטום (ה- DNA).  השלב הנמוך ביותר יהיה אדום ומכיל חלבון. הפתרון הנותר בצינורות ניתן לשמור או להשליך.</li>
	<li>הוסף 100% אלכוהול איזופרופיל ביחס 1:2 (אם הוסר 200 ul של שלב מימי, להוסיף 100 μL של אלכוהול איזופרופיל). מערבבים היטב על ידי צנרת למעלה ולמטה. בואו לנוח בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות. אלכוהול איזופרופיל מזרז את הרנ"א מחוץ לפתרון.</li>
	<li>צנטריפוגה ב 12,000 x גרם, ב 4°C, במשך 10 דקות. הקפד למקם את כל הצינורות באותו כיוון כדי להקל על לדמיין את הכדור. הכדור המתקבל יהיה RNA שחולץ.</li>
	<li>בזהירות להסיר את הצינורות, להסיר את supernatant עם צינור להיות זהיר לא לשבש את הכדור. הכדור הוא קצת כמו ג'ל ויהיה קשה לראות, אבל צריך להיות מסוגל להעריך איפה הוא מבוסס על הכיוון של הצינורות בצנטריפוגה.</li>
	<li>לאחר הסרת כל supernatant, להוסיף 500 μL של 75% אתנול, מערבולת לזמן קצר, וצנטריפוגה ב 7500 x גרם, ב 4°C, במשך 5 דקות. האתנול שוטף עוד יותר את הכדור.</li>
	<li>הסר את supernatant בזהירות, מבלי לשבש את הכדור. השאר כובעים פתוחים כדי לייבש את המדגם. זה בדרך כלל לוקח 5-10 דקות אבל יכול להשתנות בהתאם כמה אתנול נשאר על הכדור. אין להתייבש יתר על המידה.</li>
	<li>לאחר יבש, respend הכדור במים חינם DNase. הוסף 20 μL לדגימות עבור DCN, ו 30 μL עבור כל האחרים.</li>
	<li>לאחר resuspended, דגימות ניתן לאחסן ב -80 °C (80 °F) או להמשיך לבדיקות נוספות.</li>
</ol>4. תגובת שרשרת פולימראז כמותית בזמן אמת (RTqPCR)
<ol><li>לפני שלב זה יהיה צורך DNase לטפל בRNA כדי להסיר כל DNA גנומי, וליצור cDNA ניצול iScript מ BioRad. הקפד לנרמל את הריכוז של RNA לפני ביצוע cDNA. בנוסף, חשוב למטב פריימרים עבור qPCR. בצע את השיטות המתוארות כאן כדי להשלים שלב21זה . תיאור קצר של qPCR להלן.</li>
	<li>פריימרים נרכשים כולם מ-IDT. רצפים קדימה ואחורה נמצאים שניהם באותו צינור מדגם, ומאוחסנים בריכוז של פי 20. Rps18 (גן בקרה): קדימה – 5'-CCTGAGAAGTTCCAGCACAT-3' הפוך – 5'-ACACCACATGAGCATATCTCTCC-3' פרבלבומין (חלבון סידן מחייב, תאים מעכבים): קדימה – '5-ATGAGGTGAAGAAGGTGTTCC-3' Reverse – '5-AGCGTCTTTGTTTCTTTAGCAG-3' Kcng4 (תת-unit ערוץ אשלגן): Forward – 5'-CTGTCTTTTCCTGGTCAGTGA-3' הפוך – 5'-GCATTGCCTCAGACTGTCAGCAG-3' אלדולאז C (זברין II, המתבטא באופן דיפרנציאלי על פני קליפת המוח הקטן): קדימה – 5'-אגאגאקאאאגאטאטאטג-3' הפוך – 5'-TCAGTAGGCATGGTTGGTTGGC-3'</li>
	<li>תנאי qPCR היו כדלקמן. תקופת טרום דגירה, 5 דקות, ב 95 מעלות צלזיוס. תקופת הגברה, 50 מחזורים: 10 דקות ב 95°C, 10 דקות ב 62°C, ו 10 דקות ב 72°C. תקופת עקומת ההיתוך, 5 שניות ב-95°C, דקה אחת ב-65°C, וקצב הרמפה ל-0.07°C/שניה עד טמפרטורת היעד של 97°C. לאחר מכן תקופת קירור במשך 10 דקות עד 40 מעלות צלזיוס.  כל תגובות qPCR בוצעו במשולש וביטוי גנים נותח באמצעות 2- ΔΔCt עם Rps18 כפקד טעינה כדי לנרמל ביטוי גנים. תמצית מוחית בתפזורת שימשה כהפניה.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Herculano-Houzel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glia/neuron+ratio:+How+it+varies+uniformly+across+brain+structures+and+species+and+what+that+means+for+brain+physiology+and+evolution.">The glia/neuron ratio: How it varies uniformly across brain structures and species and what that means for brain physiology and evolution.</a> Glia. 62 (9), 1377-1391 (2014).</li><li>Schmahmann, J. D., Caplan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cognition,+enotion,+and+the+cerebellum.">Cognition, enotion, and the cerebellum.</a> Brain. 129 (2), 290-292 (2006).</li><li>Badura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+cognitive+and+social+development+require+posterior+cerebellar+activity.">Normal cognitive and social development require posterior cerebellar activity.</a> eLife. 7, 36401 (2018).</li><li>Diedrichsen, J., King, M., Hernandez-Castillo, C., Sereno, M., Ivry, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+Transform+or+Multiple+Functionality?+Understanding+the+Contribution+of+the+Human+Cerebellum+across+Task+Domains.">Universal Transform or Multiple Functionality? Understanding the Contribution of the Human Cerebellum across Task Domains.</a> Neuron. 102 (5), 918-928 (2019).</li><li>Strick, P. L., Dum, R. P., Fiez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellum+and+Nonmotor+Function.">Cerebellum and Nonmotor Function.</a> Annual Review of Neuroscience. 32 (1), 413-434 (2009).</li><li>King, M., Hernandez-castillo, C. R., Poldrack, R. A., Ivry, R. B., Diedrichsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+boundaries+in+the+human+cerebellum+revealed+by+a+multi-domain+task+battery.">Functional boundaries in the human cerebellum revealed by a multi-domain task battery.</a> Nature Neuroscience. 22, 1371-1378 (2019).</li><li>Buckner, R. L., Krienen, F. M., Castellanos, A., Diaz, J. C., Yeo, B. T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+organization+of+the+human+cerebellum+estimated+by+intrinsic+functional+connectivity.">The organization of the human cerebellum estimated by intrinsic functional connectivity.</a> Journal of neurophysiology. 106 (5), 2322-2345 (2011).</li><li>Schmahmann, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+movement+to+thought:+Anatomic+substrates+of+the+cerebellar+contribution+to+cognitive+processing.">From movement to thought: Anatomic substrates of the cerebellar contribution to cognitive processing.</a> Human Brain Mapping. 4 (3), 174-198 (1996).</li><li>Kelly, R. M., Strick, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+Loops+with+Motor+Cortex+and+Prefrontal+Cortex+of+a+Nonhuman+Primate.">Cerebellar Loops with Motor Cortex and Prefrontal Cortex of a Nonhuman Primate.</a> The Journal of Neuroscience. 23 (23), 8432-8444 (2003).</li><li>Stoodley, C. J., Macmore, J. P., Makris, N., Sherman, J. C., Schmahmann, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Location+of+lesion+determines+motor+vs.+cognitive+consequences+in+patients+with+cerebellar+stroke.">Clinical Location of lesion determines motor vs. cognitive consequences in patients with cerebellar stroke.</a> NeuroImage: Clinical. 12, 765-775 (2016).</li><li>Guo, C. C., Tan, R., Hodges, J. R., Hu, X., Sami, S., Hornberger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Network-selective+vulnerability+of+the+human+cerebellum+to+Alzheimer's+disease+and+frontotemporal+dementia.">Network-selective vulnerability of the human cerebellum to Alzheimer's disease and frontotemporal dementia.</a> Brain. 139 (5), (2016).</li><li>Bocchetta, M., Cardoso, M. J., Cash, D. M., Ourselin, S., Warren, J. D., Rohrer, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+regional+cerebellar+atrophy+in+genetic+frontotemporal+dementia.">Patterns of regional cerebellar atrophy in genetic frontotemporal dementia.</a> NeuroImage: Clinical. 11, 287-290 (2016).</li><li>Sillitoe, R. V., Fu, Y., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellum.">Cerebellum.</a> The Mouse Nervous System. , 360-397 (2012).</li><li>Nguyen-Minh, V. T., Tran-Anh, K., Luo, Y., Sugihara, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+Excitability+and+Parallel+Fiber+Synaptic+Properties+of+Zebrin-Positive+and+-Negative+Purkinje+Cells+in+Lobule+VIII+of+the+Mouse+Cerebellar+Slice.">Electrophysiological Excitability and Parallel Fiber Synaptic Properties of Zebrin-Positive and -Negative Purkinje Cells in Lobule VIII of the Mouse Cerebellar Slice.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 513 (2019).</li><li>Manto, M., Oulad Ben Taib, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+nuclei:+Key+Roles+for+Strategically+Located+Structures.">Cerebellar nuclei: Key Roles for Strategically Located Structures.</a> The Cerebellum. 9 (1), 17-21 (2010).</li><li>Driessen, T. M., Lee, P. J., Lim, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathway+analysis+towards+understanding+tissue+vulnerability+in+spinocerebellar+ataxia+type+1.">Molecular pathway analysis towards understanding tissue vulnerability in spinocerebellar ataxia type 1.</a> eLife. , (2018).</li><li>Grabert, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+brain+region+-+dependent+diversity+and+selective+regional+sensitivities+to+aging.">Microglial brain region - dependent diversity and selective regional sensitivities to aging.</a> Nat Neurosci. 19 (3), 504 (2016).</li><li>Ingram, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+Transcriptome+Profiles+of+ATXN1+Transgenic+Mice+Reveal+SCA1+Disease+Progression+and+Protection+Pathways.">Cerebellar Transcriptome Profiles of ATXN1 Transgenic Mice Reveal SCA1 Disease Progression and Protection Pathways.</a> Neuron. 89 (6), 1194-1207 (2016).</li><li>Cendelin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> From mice to men : lessons from mutant ataxic mice. , 1-21 (2014).</li><li>Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+RNA+Using+TRIzol+(TRI+Reagent).">Purification of RNA Using TRIzol (TRI Reagent).</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (6), (2010).</li><li>Kim, J. H., Lukowicz, A., Qu, W., Johnson, A., Cvetanovic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astroglia+contribute+to+the+pathogenesis+of+spinocerebellar+ataxia+Type+1+(SCA1)+in+a+biphasic,+stage-of-disease+specific+manner.">Astroglia contribute to the pathogenesis of spinocerebellar ataxia Type 1 (SCA1) in a biphasic, stage-of-disease specific manner.</a> Glia. 66 (9), 1972-1987 (2018).</li><li>Chopra, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+Capicua+expression+drives+regional+Purkinje+neuron+vulnerability+through+ion+channel+gene+dysregulation+in+spinocerebellar+ataxia+type+1.">Altered Capicua expression drives regional Purkinje neuron vulnerability through ion channel gene dysregulation in spinocerebellar ataxia type 1.</a> Human Molecular Genetics. , (2020).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

השיטה המתוארת כאן מאפשרת להעריך את ביטוי הגנים הבסיסיים ואת המנגנונים המולקולריים בארבעה אזורי מוח הקטן נפרדים – גרעיני המוח הקטן העמוקים (DCN), קליפת המוח הקדמית של ורמיס (CCaV), קליפת המוח המוח האחורית של הוורמיס (CCPV), ואת קליפת המוח הקטן של חצי הכדור (CCH). היכולת להעריך אזורים אלה בנפרד תרחיב את הידע שלנו על ההטרוגניות של אזורים מוחיים ספציפיים ואולי לשפוך אור על תרומתם להתנהגויות שונות.
על ידי חתך של רקמת המוח המלאה באופן קשתי ניתן לדמיין ולזהות בקלות את ארבעת האזורים האלה של המוח הקטן, המאפשר ניתוח מהיר. למיטב ידיעת המחבר זהו התיאור הראשון של ניתוח אזורי מלא במוח הקטן לניתוח מולקולרי. במאמר שפורסם לאחרונה, החוקרים השתמשו בניתוח בתפזורת של העייפות החלק התחתון של המוח הקטן ואת האונה של המוח הקטן לניתוחמולקולרי 22. עם זאת, בשיטה המתוארת הם לא יוכלו גם לנתח את DCN. ניסיונות לבודד אגרופים DCN באמצעות ויברטום לחתוך פרוסות בעובי 300um בדרך כלל נתקלים בשלוש בעיות קריטיות. ראשית, בשל הבדלים קלים בהרכבה של המוח ואת הזווית שבה הרקמה נחתכת, זה לא קל לבודד באופן רב את אותם אזורים על פני בעלי חיים. שנית, הרכבה וחתיכה לוקחים זמן, מה שמגדיל את הסיכויים לפגיעה ברנ"א והפחתת האיכות של דגימת RNA עבור יישומים במורד הזרם. לבסוף, אגרופים מפרוסות בעובי 300um מייצרות תפוקה נמוכה של RNA.
הנתונים המוצגים כאן מצביעים על כך שניתן להשתמש בטכניקה זו כדי להעריך ביטוי גנים יחסי על פני אזורים מוחיים. אלדולאזה C הוא מאוד upregulated ב CCpV. Kcng4 הוא upregulated מאוד DCN ו CCaV, ו parvalbumin מתבטא באופן שווה יחסית בכל האזורים במוח הקטן. בעוד אלה הם רק שלושה גנים, תוצאות אלה מראות כי שיטת ניתוח זו יכולה לשמש כדי לזהות את החתימות המולקולריות הבסיסיות של אזורים נפרדים אלה.
יש כמה דברים קריטיים לשים לב לכל אורך הפרוטוקול הזה. מיקום המוח במטריצה הוא צעד חשוב. במקרים מסוימים, המוח לא יכול להיות מוגדר ברמה מושלמת במטריצה או בדיוק על קו האמצע. זה יתבהר כאשר מסתכלים על כל אחד מקטעי הקשת. לדוגמה, אם לחתוך בדיוק בקו האמצע, החלקים המוח הקטן המהונדס ביותר ייראה כמעט זהה ואין להם DCN גלוי. מכיוון שציוני דרך אלה ניתנים לזיהוי באמצעות עין, ניתן לפתור כמה חלקים נחשבים לחלקים ורמליים או לחצי הכדור, וניתן לשלב אותם יחד באותו צינור מיקרו-פוגה. צעד קריטי נוסף הוא החילוץ של DCN. במקרים מסוימים, מדכא אצבע לחלק העליון של קצה צינור 200 μl הוא לא מספיק לחץ כדי לחלץ את אגרוף הרקמה. אם זה המקרה, יהיה צורך לגרוף את האגרוף עם מלקחיים באף מחט ולהניח את האגרוף בצינור הנכון. השלב הקריטי הבא של פרוטוקול זה הוא חילוץ RNA. בעוד אמצעי האחסון המפורטים עברו אופטימיזציה לחילוץ RNA מקסימלי, ייתכן שיהיה צורך גם להתאים את כמויות הפתרון בפרוטוקול החילוץ של הרנ"א כך שיתאימו לצרכים האישיים של המעבדה. כי יש רקמה קטנה לעבוד עם, יש סיכוי גבוה יותר של זיהום פנול במוצר ה- RNA הסופי. זה יכול להיות מנוהל על ידי התאמת כמות TRIzol המשמש הומוגניזציה הרקמה ולהבטיח כי הרקמה הומוגנית מעורבב ביסודיות.
המגבלות של פרוטוקול זה הן כי בעוד DCN מחולקים לשלושה גרעינים נפרדים (לרוחב, interposed, וממצעי) קשה לדמיין ולפרוע כל אחד מאלה מתוך מקטעים 1 מ"מ, שלא לדבר על יש מספיק רקמה שממנה ניתן לחלץ RNA. יחד עם מגבלה זו, מחצית DCN המהודל ביותר מופיע vermis; עם זאת, עם ניתוח זה קשה לדמיין ולנתח באופן רב. כפי שהפרוטוקול הוא כרגע, החצי השני של DCN המהודל ואת DCN הנותרים הם נותחו. יש גם עשרה אופות מלל בודדות ושמונה lobules בחצי הכדור, אבל לנתח כל אחד מאלה בנפרד ובאופן רבייה יהיה קשה ולהוביל תשואות ריכוז RNA נמוכות מאוד. בעוד שיטה זו מאפשרת להתעמק באופן ספציפי יותר באזורים של המוח הקטן, היא עדיין משלבת אזורים אנטומיים נפרדים לקבוצות אשר יכול להיות מיסוך שינויים ייחודיים על רמת lobules בודדים או יחידות sub-lobule.
לסיכום, שיטה זו מאפשרת לחקור בו זמנית הבדלים מולקולריים אזוריים ארבעה אזורים ספציפיים של המוח הקטן. על ידי הערכת המוח הקטן באופן ספציפי לאזור זה, ניתן להקניט בנפרד מנגנונים מולקולריים הבסיסיים וביטוי גנים המאפיינים אזורים אלה. זה יקדם את הבנתנו את התפקיד כי אזורי המוח הקטן המובהקים לשחק בהתנהגויות שונות ולאפשר עבודה עתידית להתמקד במיוחד באזור המוח הקטן אחד ולחקור את תפקידה במחלה או טיפול היעד.

המוח הקטן מכיל יותר ממחצית הנוירונים במוח, מבחינה היסטורית המכונה מרכז שליטה ואיזון מוטורי במוח1. לאחרונה, מחקרים הראו כי המוח הקטן ממלא תפקיד מפתח בפונקציות שונות אחרות, כולל קוגניציה, עיבוד תגמול, ולהשפיעעל 2,3,4,5.
המוח הקטן יש אנטומיה המתוארת היטב: אזור קליפת המוח מורכב גרגר, Purkinje, ושכבות מולקולריות. תאי גרגר יוצרים את שכבת תא הגרגר ושולחים קלט באמצעות סיבים מקבילים לדנדריטים של תאי Purkinje של השכבה המולקולרית אשר מקבלים גם קלט מסיבי טיפוס שמקורם בזית נחות. תאי Purkinje לשלוח תחזיות מעכבות לתאים גרעיני המוח הקטן העמוק (DCN), אשר משמש את הפלט העיקרי מן המוח הקטן. הפלט של מעגל המוח הקטן הזה מווסת עוד יותר על ידי הפעילות של interneurons מעכב בקליפת המוח הקטן, כולל Golgi, stellate, ותאי סל4. יחידה תפקודית מוחית זו מופצת בכל האונים של קליפת המוח הקטן. למרות מעגלים אחידים יחסית זה על פני המוח הקטן, עדויות מספרות דימות מוחי אנושי ומחקרים סבלניים מצביעים על הטרוגניות תפקודית של המוח הקטן6,7.
קליפת המוח הקטן יכולה להיות מחולקת לשני אזורים עיקריים: ורמיס המוגדר על קו האמצע, וחצי הכדור לרוחב. ניתן לחלק את הוורמוי עוד יותר לאופות הקדמיות והאחוריות. אזורים נפרדים אלה של המוח הקטן היו מעורבים בתרומה להתנהגויות שונות. דפוסי פעילות מעוררי משימות או נטולי משימות סיבכו את העובדה שאזורים הקדמיים של הוורמיס תורמים יותר לתפקוד המוטורי בעוד שהרמיס האחורי תורם יותר לקוגניציה6,7. ורמיס מקושר גם עם השפעה ורגשות, בעוד חצי הכדור המוחי לתרום מנהל, חזותי-מרחבי, שפה, ופונקציות mnemonic אחרים8. בנוסף, מחקרים אנטומיים סיפקו ראיות לכך שאזורי המוח הקטן הייחודיים מבחינה תפקודית מחוברים לאזורים קליפתיים שונים9. מיפוי תסמיני נגע גילה כי חולים עם שבץ המשפיעים על lobules הקדמי (מתרחב לתוך lobule VI) היו ביצועים ירודים יותר על משימות מוטוריות עדינות, בעוד חולים עם נזק לאזורי האונה האחורית וחצי הכדורים הראו ליקויים קוגניטיביים בהיעדר תסמונת מוטורית מוחית10. לבסוף, פתולוגיה מוחית אזורית במחלה מצביעה על כך שאזורי המוח הקטן הייחודיים מבחינה תפקודית רגישים גם הם באופן שונה למחלה11,12.
בעוד הרבה פחות נחקר, ראיות ראשוניות מדגים חתימות ביטוי גנים ברורים על פני אזורים קליפת המוח הקטן. ביטוי התא Purkinje של Zebrin II מראה דפוס ספציפי לאזור vermis, כך שיש יותר תאים חיוביים Zebrin II ב lobules האחוריים ופחות ב lobules הקדמי13. זה גם מתואם עם תפקוד פיזיולוגי ייחודי אזורי כמו תאי Purkinje שלילי זברין II להציג תדירות גבוהה יותר של ירי טוניק מאשר תאי Purkinje כי הם זברין II חיובי14.
בנוסף קליפת המוח הקטן, המוח הקטן כולל גרעיני המוח הקטן העמוק (DCN) המשמשים את הפלט העיקרי עבור המוח הקטן. הגרעינים מורכבים מהמידל (MN), משולבים (IN) וגרעיני לרוחב (LN). הדמיה פונקציונלית ומחקרי מטופלים הראו כי DCN גם להשתתף בהתנהגויות שונות15, אבל מעט מאוד מחקרים לבחון שינוי ביטוי גנים ב- DCN.
ההתקדמות בטכניקות מולקולריות אפשרה להעריך ביטוי גנים אזורי במוח וחשפו הטרוגניות על פני ובתוך אזורי מוח שונים הן במצבים פיזיולוגיים והן במצבי מחלה16. מחקרים כאלה מסבכים כי המוח הקטן שונה מאזורי מוח אחרים. לדוגמה, היחס בין נוירונים לתאי גליה הפוך במוח הקטן בהשוואה לאזורי מוח אחרים1. אפילו בתנאים פיזיולוגיים רגילים, הביטוי של גנים פרו-דליקים הוא upregulated במוח הקטן לעומת אזורי המוחהאחרים 17. טכניקות מולקולריות היו גם מאוד שימושי בזיהוי המסלולים התורמים פתוגנזה של מחלות מוחיות. לדוגמה, רצף RNA של כל תמציות המוח הקטן זיהה גנים שהשתנו במודל עכבר מהונדס ספציפי לתא Purkinje של spinocerebellar אטקסיה סוג 1 (SCA1) בהשוואה לבקרות סוג הבר שלהם. ראיות כאלה חשפו מסלולים מולקולריים מרכזיים שבבסיס פתוגנזה בתאי פורקיניה במוח הקטן ועזרו לזהות מטרות טיפוליות פוטנציאליות18. עם זאת, מחקרים אחרונים מראים כי ישנם הבדלים בפגיעות למחלות ברחבי אזורי המוח הקטן11,12,19. זה יכול להצביע על כך שיש שינויים מרכזיים המתרחשים באזורים מוחיים נפרדים, אשר עשוי להיות רעול פנים או מבלי שיבחינו עם תמציות מוחין שלם. לכן, יש צורך לפתח טכניקות המאפשרות לחוקרים לבחון פרופילים מולקולריים באזורים מוחיים שונים.
הטכניקה המוצעת כאן מתארת שיטה ניתנת לשחזור לנתח ארבעה אזורים נפרדים של המוח הקטן של העכבר על מנת לבודד RNA מאזורים אלה ולחקור הבדלים אזוריים בביטוי גנים. השרטוט של המוח הקטן של העכבר באיור 1A מדגיש את הוורמיס בכחול, ואת ההמיספרות בצהוב. באופן ספציפי, טכניקה זו מאפשרת לבודד ארבעה אזורים: גרעיני המוח הקטן העמוק (DCN) (תיבות מנוקדות באדום באיור 1A),קליפת המוח הקטן של ורמיס הקדמי (CCaV) (כחול כהה באיור 1A), קליפת המוח המוח של ורמיס האחורי (CCpV) (כחול בהיר באיור 1A),וקליפת המוח הקטן של האונה הקדמית (CCH) (צהוב באיור 1A). על ידי הערכת ביטוי גנים של אזורים אלה בנפרד, ניתן יהיה לחקור מנגנונים מולקולריים שבביסת פונקציות נפרדות של אזורים שונים אלה, כמו גם הבדלים פוטנציאליים בפגיעותם במחלות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >1.5 Microcentrifuge tubes</td>
			<td >ThermoScietific</td>
			<td >3456</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100% Isopropyl Alcohol</td>
			<td >VWR Life sciences</td>
			<td >1106C361</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >200 ul Pipet tips</td>
			<td >GeneMate</td>
			<td >P-1237-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Adult Mouse Brain Matrix Sagittal</td>
			<td >Kent Scientific Corporation</td>
			<td >RBMA-200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Blunt forceps</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chloroform</td>
			<td >Macron</td>
			<td >220905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Decapitation Scissors</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dissecting Scissors</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethyl Alcohol</td>
			<td >Pharmco</td>
			<td >111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glass Slide (for electrophoresis)</td>
			<td >BIORAD</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Homogenizer</td>
			<td >Kimble</td>
			<td >6HAZ6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ice Bucket</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Insulin Syringe (.5ml)</td>
			<td >BD</td>
			<td >329461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >iScript Adv cDNA kit for RT-qPCR</td>
			<td >BIORAD</td>
			<td >1725037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micro Spatula</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Needle Nose forceps</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Petri Dish</td>
			<td >Pyrex</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primetime Primer for Aldolase C</td>
			<td >IDT</td>
			<td >Mm.PT.58&#62;43415246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primetime Primer for Kcng4</td>
			<td >IDT</td>
			<td >Mm.PT.56a.9448518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primetime Primer for Parvalbumin</td>
			<td >IDT</td>
			<td >Mm.PT.58.7596729</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primetime Primer Rps18&#160;</td>
			<td >IDT</td>
			<td >Mm.PT.58.12109666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Single Edge Rzor Blades</td>
			<td >Personna GEM</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterile, sigle-use pestles</td>
			<td >FisherScientific</td>
			<td >12141364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TRIzol Reagent</td>
			<td >Ambion by Life technologies</td>
			<td >15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vascular Scissors</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cerebellar regional dissection for molecular analysis

Cerebellum ממלא תפקיד חשוב במספר פונקציות מפתח כולל שליטה בתנועה, איזון, קוגניציה, תגמול, השפעה. מחקרי הדמיה מצביעים על כך שאזורים מוחיים נפרדים תורמים לפונקציות שונות אלה. מחקרים מולקולריים הבוחנים הבדלים במוח הקטן האזורי מפגרים כפי שהם נעשים בעיקר על תמציות מוחין שלמות ובכך להסוות כל הבחנות על פני אזורים מוחיים ספציפיים. כאן אנו מתארים טכניקה לשחזור ובמהירות של ארבעה אזורי מוח הקטן שונים: גרעיני המוח הקטן העמוקים (DCN), קליפת המוח המוח הקדמית והאחורית, קליפת המוח המוח הקטן של חצי הכדור. ניתוח אזורים נפרדים אלה מאפשר לחקור מנגנונים מולקולריים שעשויים לעמוד בבסיס תרומתם הייחודית לאיזון, תנועה, השפעה וקוגניציה. טכניקה זו עשויה לשמש גם כדי לחקור הבדלים ברגישות הפתולוגית של אזורים ספציפיים אלה על פני מודלים שונים של מחלות עכבר.

בניסויים אלה נעשה שימוש בארבעה עכברי בר מסוג נקבה בני 11 שבועות מסוג C57/Black6. עכבר אחד שימש לעריכת ניתוח מוחי מלא המכונה "המוח הקטן בתפזורת" ומאפשר השוואה של רמות RNA באזורים ניתחו לביתור מלא. שלושת העכברים האחרים שימשו לעריכת ניתוח המוח הקטן המתואר בפרוטוקול זה. שימוש בשלושה עכברים מאפשר להבטיח שהמגמות שזוהו ברמות הרנ"א ניתנות לשחזור על פני עכברים.
איור 1A מייצג את המוח הקטן של העכבר - ורמיס בכחול ובחצי הכדור בצהוב. שרטוטים קשתיים של vermis (אזורים הקדמיים בכחול כהה, אזורים אחוריים בכחול בהיר) וחצי הכדור (בצהוב). ה- DCN מסומן בתיבות מנוקדות אדומות. ניתוח מוצלח יתחיל עם מיקום סכין הגילוח הראשוני בקו האמצע של המוח (איור 1B); פעולה זו מנחה את המיקום המוצלח של ששת הלהבים הבאים (איור 1C). זה משאיר שישה מקטעי קשת(איור 1D),ארבעה מקטעים לרוחב/חצי הכדור (המסווגים בסגול) ושני מקטעי קו האמצע/ורמאל (המסווגים בכחול בהיר). 4 המקטעים לרוחב מכילים את ה- DCN; איור 1E מתאר ניתוח אגרוף DCN מוצלח. החלקים המללים האמצעיים ככל הנראה יהיו מחצית DCN המהונדס ביותר נוכח בקטע 1 מ"מ עבה, אולם זה לא יהיה נוכח לאורך כל הדרך ולא ניתן לנתח באופן רב. החלקים הוורמליים של קו האמצע מופרדים לנבולינים הקדמיים והאחוריים המתוארים באיור 1F. ניתוח מוצלח מגדיר את שאר הניסויים להצלחה.
תוצאות תגובת שרשרת פולימראז איכותית בזמן אמת (RTqPCR) ממחישות את ההיתכנות של הערכת רמות ביטוי הגנים של כל אזור בנפרד, כמו גם לשמש לאימות ניתוחים. השתמשנו בפריימרים לזיהוי גנים המראים ביטוי הדרגתי מקליפת המוח המוח הקטן האחורית והעשרה ב- DCN והשווינו את הביטוי שלהם לריסטים המוח הקטן בתפזורת.
הערכנו את רמות הביטוי של שלושה גנים: אלדולאז C, פרבלבומין ו- Kcng4. אלדולאז C, הידוע גם בשם זברין II, הוא אנזים המתבטא בתבנית פסים עקבית דרך המוח הקטן. זה בא לידי ביטוי גבוה יותר ב vermis האחורי מאשר vermis הקדמי. יש גם להקות בחצי הכדור13,14. Parvalbumin שהוא חלבון מחייב סידן המתבטא בתאים מעכבים. בהתבסס על אטלס המוח אלן, parvalbumin נראה מתבטא באופן אחיד יחסית ברחבי קליפת המוח הקטן ב- DCN (http://mouse.brain-map.org/gene/show/19056). Kcng4, תת-כתר מגודר במתח אשלגן, נראה מועשר ב- DCN ובעורף הקדמי בהשוואה לאונות האחוריות (https://mouse.brain-map.org/gene/show/42576). ניתוח הביטוי הכמותי הראה כי, כצפוי, אלדולאז C מתבטאת יותר במוח הקטן האחורי ורמיס (CCpV) אך נמוכה יותר ב- DCN ובאזור הקדמי של ורמיס (CCaV) בהשוואה לניתוח המוח הקטן בתפזורת (איור 2A). Parvalbumin נוכח באופן דומה DCN, ורמיס הקדמי, ורמיס אחורי, קליפות המוח הקטן בחצי הכדור כמו בתמציות המוח הקטן בתפזורת(איור 2B). Kcng4 מועשר באופן משמעותי ב- DCN ובוורמיס הקדמי (CCaV) ואינו מועשר באופן משמעותי בוורמיס האחורי (CCPV) או בחצי הכדור (CCH) בהשוואה לחילוץ בתפזורת(איור 2C). תוצאה זו עוקבת אחר מה שהיה צפוי בהתבסס על הדפוס שנראה באטלס המוח אלן. לכן, ניתוח ביטוי גנים מאמת את פרוטוקול הניתוח ומאשר כי ניתן להשיג ולבדוק RNA באיכות טובה.
כדי להשוות ישירות את הביטוי של אלדולאז C על פני קליפת המוח הקטן, רמות הביטוי הושוו למקום שבו הוא אמור להיות הנמוך ביותר, vermis הקדמי (CCaV) (איור 3). רמת הביטוי של אלדולאז C הייתה גבוהה משמעותית בוורמיס האחורי (CCPV), ומגמה גבוהה יותר בחצי הכדור המוחי (CCH), אם כי לא ממש באופן משמעותי. מגמה זו בחצי הכדור המוחי היא ככל הנראה משום שיש להקות של אלדולאז C בחצי הכדור, והניתוח לוכד להקות שליליות וחיוביות של אלדולאז.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61922/61922fig01.jpg"> איור 1: תמונות מייצגות של ניתוח מוחי  א. סכמטי של המוח הקטן של העכבר עם ורמיס בכחול וחצי כדור בצהוב. שרטוטי מזל קשת של ורמיס וחצי הכדור. ורמיס בכחול, עם כחול כהה המסמן את ורמיס הקדמי, וסימון כחול בהיר ורמיס אחורי. חצי הכדור בצהוב. ה- DCN מסומנים בכל אחד מהם בתיבות מנוקדות באדום. ב. מוח מלא במטריצת מוח של עכבר קשתי, עם סכין גילוח במרכז. ג. מיקום של שלושה סכיני גילוח במרחק של 1 מ"מ זה מזה משני צדי קו האמצע. ד. ששת חלקי המוח הקשת שהתקבלו. ארבעה מכילים מקטעי מוח הקטן לרוחב/חצי הכדור (ארבע התמונות המובילות המסודרות בסגול). שניים מכילים מקטעי המוח הקטן המהוכל/ורמלי (שתי התמונות התחתונות, המסווגות בכחול בהיר). אי. קטע מוח הקטן לרוחב/חצי הכדור עם פונץ' DCN נותח מימין לסעיף (סעיף המסודר בוורוד באיור 1D). פ. קטע מוחי באיור 1D עם טורקיה מנוקדת מרובעת סביבו, ניתח לתוך lobules vermal הקדמי והאחורי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61922/61922fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61922/61922fig02.jpg"> איור 2: ביטוי גנים יחסי באזורים ספציפיים מבודדים במוח הקטן. ביטוי יחסי של אלדולאז C (2A), פרבלבומין (2B) ו Kcng4 (2C) מנורמל ל- Rps 18 (חלבון הקשור לרנ"א ריבוזומלי המבוטא בכל התאים), ושימוש בתמצית מוחית בתפזורת כהפניה. כצפוי, ביטוי אלדולאז C היה גבוה יותר ב vermis האחורי ונמוך יותר ב DCN ו vermis הקדמי (2A). כצפוי, בהתבסס על אלן אטלס המוח, ביטוי parvalbumin מתבטא באופן אחיד על פני כל אזור שחולץ, בעוד ביטוי Kcng4 מועשר באופן משמעותי DCN ו- CCaV. ANOVA בכיוון אחד, עם מבחן פוסט הוק של טוקי. *p<.0.005, ** p<.0.0001 ביחס לתמצית המוח הקטן בתפזורת. היסטוגרמה מייצגת ערכים ממוצעים עבור N=3 עם ערכים עבור כל עכבר בודד המוצג כנקודות. קווי שגיאה מייצגים שגיאה סטנדרטית של הממוצע. DCN (גרעיני המוח הקטן העמוק), CCaV (קליפת המוח הקטן של ורמיס הקדמי), CCPV (קליפת המוח הקטן של ורמיס האחורית) ו- CCH (קליפת המוח הקטן של חצי הכדור). N = 3 עכברים לאזורי ניתוח מוחי. N = 1 תמצית בתפזורת. הניסוי נעשה במשולש. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61922/61922fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61922/61922fig3v2.jpg"> איור 3: ביטוי גנים יחסי של אלדולאז C על פני קליפת המוח הקטן ביטוי יחסי של אלדולאז C באזורים ספציפיים של קליפת המוח הקטן - ורמיס הקדמי (CCaV), ורמיס אחורי (CCPV) וחצי הכדור (CCH). רמת ביטוי הגנים של אלדולאז C מנורמלה ל- Rps18 והושוותה לרמת הביטוי בוורמיס הזרוע. כצפוי ביטוי אלדולאז C הועשר בוורמיס האחורי. ANOVA בכיוון אחד, עם מבחן פוסט הוק של טוקי. *p<.0.005 ביחס ל- CCaV. קווי שגיאה מייצגים שגיאה סטנדרטית של הממוצע. CCaV (קליפת המוח הקטן של ורמיס הקדמי), CCPV (קליפת המוח הקטן של ורמיס האחורי), ו- CCH (קליפת המוח הקטן של ההמיספרות). N = 3 עכברים, ניסוי נעשה משולש. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61922/61922fig3v3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Cerebellar Regional Dissection for Molecular Analysis at JoVE.com

Cerebellar Regional Dissection for Molecular Analysis

אזורים מוחיים שונים כבר מעורבים לשחק תפקיד תפוקות התנהגותיות ברורות, עדיין המנגנונים המולקולריים הבסיסיים עדיין לא ידוע. עבודה זו מתארת שיטה להתרבות במהירות ולנתח קליפת המוח המוח הקטן של חצי הכדור, האזורים הקדמיים והאחוריים של ורמיס, ואת גרעיני המוח הקטן העמוקים על מנת לחקור הבדלים מולקולריים על ידי בידוד RNA ובדיקת הבדלים בביטוי הגנים.

ניתוח אזורי של Cerebellar לניתוח מולקולרי

Cerebellum plays an important role in several key functions including control of movement, balance, cognition, reward, and affect. Imaging studies ...

cerebellar-regional-dissection-for-molecular-analysis

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

3.8K Views.  University of Minnesota. אזורים מוחיים שונים כבר מעורבים לשחק תפקיד תפוקות התנהגותיות ברורות, עדיין המנגנונים המולקולריים הבסיסיים עדיין לא ידוע. עבודה זו מתארת שיטה להתרבות במהירות ולנתח קליפת המוח המוח הקטן של חצי הכדור, האזורים הקדמיים והאחוריים של ורמיס, ואת גרעיני המוח הקטן העמוק...

Video: Cerebellar Regional Dissection for Molecular Analysis

A Simple Composite Phenotype Scoring System for Evaluating Mouse Models of Cerebellar Ataxia

We describe a protocol for the rapid and sensitive quantification of disease severity in mouse models of cerebella ataxia. It is derived from previously published phenotype assessments in several disease models, including spinocerebellar ataxias, Huntington s disease and spinobulbar muscular atrophy. Measures include hind limb clasping, ledge test, gait and kyphosis. Each measure is recorded on a scale of 0-3, with a combined total of 0-12 for all four measures. The results effectively discriminate between affected and non-affected individuals, while also quantifying the temporal progression of neurodegenerative disease phenotypes. Measures may be analyzed individually or combined into a composite phenotype score for greater statistical power. The ideal combination of the four described measures will depend upon the disorder in question. We present an example of the protocol used to assess disease severity in a transgenic mouse model of spinocerebellar ataxia type 7 (SCA7).
Albert R. La Spada and Gwenn A. Garden contributed to this manuscript equally.

We describe a protocol for the rapid and sensitive quantification of disease severity in mouse models of cerebellar ataxia. Measures include hind limb clasping, ledge test, gait and kyphosis. This protocol effectively discriminates between affected and non-affected individuals, and detects the progression of affected individuals over time.

ניקוד פשוט Composite הפנוטיפ מערכת להערכת מודלים של עכבר אטקסיה cerebellar

We describe a protocol for the rapid and sensitive quantification of disease severity in mouse models of cerebella ataxia. It is derived from previously ...

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

A live fluorescence imaging technique to quantify the replenishment and mobilisation of specific synaptic vesicle (SV) pools in central nerve terminals is described. Two rounds of SV recycling are monitored in the same nerve terminals providing an internal control.

ניתוח כמותי של רענון שלפוחיות Synaptic בריכת ב Cultured נוירונים גרגיר cerebellar באמצעות צבעים FM

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

להדמיה מניפולציה גנטית של דנדריטים עם קוצים בקליפת עכבר היפוקמפוס מוחין באמצעות<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

The process by which the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina continues to be a major focus of both clinical and basic research. In addition to the obvious medical relevance for understanding and treating retinal disease, the development of the vertebrate retina continues to serve as an important and elegant model system for understanding neuronal cell type determination and differentiation1-16. The neural retina consists of six discrete cell types (ganglion, amacrine, horizontal, photoreceptors, bipolar cells, and M&uuml;ller glial cells) arranged in stereotypical layers, a pattern that is largely conserved among all vertebrates 12,14-18.
While studying the retina in the intact developing embryo is clearly required for understanding how this complex organ develops from a protrusion of the forebrain into a layered structure, there are many questions that benefit from employing approaches using primary cell culture of presumptive retinal cells 7,19-23. For example, analyzing cells from tissues removed and dissociated at different stages allows one to discern the state of specification of individual cells at different developmental stages, that is, the fate of the cells in the absence of interactions with neighboring tissues 8,19-22,24-33. Primary cell culture also allows the investigator to treat the culture with specific reagents and analyze the results on a single cell level 5,8,21,24,27-30,33-39. Xenopus laevis, a classic model system for the study of early neural development 19,27,29,31-32,40-42, serves as a particularly suitable system for retinal primary cell culture 10,38,43-45.
Presumptive retinal tissue is accessible from the earliest stages of development, immediately following neural induction 25,38,43. In addition, given that each cell in the embryo contains a supply of yolk, retinal cells can be cultured in a very simple defined media consisting of a buffered salt solution, thus removing the confounding effects of incubation or other sera-based products 10,24,44-45.
However, the isolation of the retinal tissue from surrounding tissues and the subsequent processing is challenging. Here, we present a method for the dissection and dissociation of retinal cells in Xenopus laevis that will be used to prepare primary cell cultures that will, in turn, be analyzed for calcium activity and gene expression at the resolution of single cells. While the topic presented in this paper is the analysis of spontaneous calcium transients, the technique is broadly applicable to a wide array of research questions and approaches (Figure 1).

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Xenopus laevis provides an ideal model system for studying cell fate specification and physiological function of individual retinal cells in primary cell culture. Here we present a technique for dissecting retinal tissues and generating primary cell cultures that are imaged for calcium activity and analyzed by in situ hybridization.

Dissection, תרבות וניתוח של<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; רקמת רשתית עוברית

The process by which  the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina  continues to be a major focus of both clinical and ...

Dissection and Lateral Mounting of Zebrafish Embryos: Analysis of Spinal Cord Development

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene knockdown approaches can be utilized to examine the molecular mechanisms underlying nervous system development. Second, large clutches of developmentally synchronized embryos provide large experimental sample sizes. Third, the optical clarity of the zebrafish embryo permits researchers to visualize progenitor, glial, and neuronal populations. Although zebrafish embryos are transparent, specimen thickness can impede effective microscopic visualization. One reason for this is the tandem development of the spinal cord and overlying somite tissue. Another reason is the large yolk ball, which is still present during periods of early neurogenesis. In this article, we demonstrate microdissection and removal of the yolk in fixed embryos, which allows microscopic visualization while preserving surrounding somite tissue. We also demonstrate semipermanent mounting of zebrafish embryos. This permits observation of neurodevelopment in the dorso-ventral and anterior-posterior axes, as it preserves the three-dimensionality of the tissue.

Developmental processes such as proliferation, patterning, differentiation, and axon guidance can be readily modeled in the zebrafish spinal cord. In this article, we describe a mounting procedure for zebrafish embryos, which optimizes visualization of these events.

נתיחה והרכבה לרוחב של עוברי דג הזברה: ניתוח התפתחות חוט השדרה

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

מניפולציה גנטית של Cerebellar גרגיר נוירונים<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; בVivo</em&gt; ללמוד עצבי מורפולוגיה וגירה

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat muscles can offer significant advantage over traditionally used thicker muscles, such as those from the hind limb (e.g. gastrocnemius). Thin muscles allow for comprehensive overview of the entire innervation pattern for a given muscle, which in turn permits identification of selectively vulnerable pools of motor neurons. These muscles also allow analysis of parameters such as motor unit size, axonal branching, and terminal/nodal sprouting. A common obstacle in using such muscles is gaining the technical expertise to dissect them. In this video, we detail the protocol for dissecting the transversus abdominis (TVA) muscle from young mice and performing immunofluorescence to visualize axons and neuromuscular junctions (NMJs). We demonstrate that this technique gives a complete overview of the innervation pattern of the TVA muscle&#160;and can be used to investigate NMJ pathology in a mouse model of the childhood motor neuron disease, spinal muscular atrophy.

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

In this video we demonstrate a protocol for dissection of the transversus abdominis muscle of the mouse and use immunofluorescence and microscopy to visualize neuromuscular junctions.

ניתוח של השריר Transversus Abdominis לניתוח צומת נוירומוסקולרי הר שלם

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to understand the mechanism that promotes neuronal regeneration, an in-depth analysis of the neuronal types that can remodel after injury is needed. Several studies showed that damaged climbing fibers are capable of regrowing also in adult animals1,2. The investigation of the time-lapse dynamics of degeneration and regeneration of these axons within their complex environment can be performed by time-lapse two-photon fluorescence (TPF) imaging in vivo3,4. This technique is here combined with laser surgery, which proved to be a highly selective tool to disrupt fluorescent structures in the intact mouse cortex5-9.
This protocol describes how to perform TPF time-lapse imaging and laser nanosurgery of single axonal branches in the cerebellum in vivo. Olivocerebellar neurons are labeled by anterograde tracing with a dextran-conjugated dye and then monitored by TPF imaging through a cranial window. The terminal portion of their axons are then dissected by irradiation with a Ti:Sapphire laser at high power. The degeneration and potential regrowth of the damaged neuron are monitored by TPF in vivo imaging during the days following the injury.

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Two-photon imaging, coupled to laser nanodissection, are useful tools to study degenerative and regenerative processes in the central nervous system with subcellular resolution. This protocol shows how to label, image, and dissect single climbing fibers in the cerebellar cortex in vivo.

Nanosurgery הלייזר של האקסונים Cerebellar<em&gt; בVivo</em

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

צעד-אחד פשוט פרוטוקול לנתיחה עבור כל הר הכנה למבוגרים<em&gt; תסיסנית</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their post-natal development, abundance, and accessibility, CGNs are an ideal model to study neuronal processes, including neuronal development, neuronal migration, and physiological neuronal activity stimulation. In addition, CGN cultures provide an excellent model for studying different modes of cell death including excitotoxicity and apoptosis. Within a week in culture, CGNs express N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors, a specific ionotropic glutamate receptor with many critical functions in neuronal health and disease. The addition of low concentrations of NMDA in conjunction with membrane depolarization to rodent primary CGN cultures has been used to model physiological neuronal activity stimulation while the addition of high concentrations of NMDA can be employed to model excitotoxic neuronal injury. Here, a method of isolation and culturing of CGNs from 6 day old pups as well as genetic manipulation of CGNs by adenoviruses and lentiviruses are described. We also present optimized protocols on how to stimulate NMDA-induced excitotoxicity, low-potassium-induced apoptosis, oxidative stress and DNA damage following transduction of these neurons.

This protocol describes a simple method for isolating and culturing primary mouse cerebral granule neurons (CGNs) from 6-7 day old pups, efficient transduction of CGNs for loss and gain of function studies, and modelling NMDA-induced neuronal excitotoxicity, low-potassium-induced cell death, DNA-damage, and oxidative stress using the same culture model.

מידול מוות עצביים והתנוונות בנוירונים גרגר אסטרוציטומה העיקרי העכבר

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...