באמצעות פרוטוקול זה, ניתן לטהר ביעילות את הצורות הנמצאות בכל מקום של חלבון נתון מתאי יונקים, מה שמקל על מחקרים על התפקידים של יוביקוויטינציה בוויסות תפקוד החלבון. טיהור של חלבונים הנמצאים בכל מקום בתאי יונקים בהשוואה לטיהור במבחנה שומר על מצב קישור האוביקוויטין של חלבוני המטרה במצב רדיולוגי יותר. התחל על ידי הוספת 1.5 מיליליטר של בינוני סרום מופחת בשלושה צינורות צנטריפוגה 15 מיליליטר.
הוסיפו דנ"א פלסמיד מוכן להעברה לכל שפופרת והוסיפו 0.2 מיקרוגרם של פלסמיד חלבון פלואורסצנטי ירוק כדי לנטר את יעילות הטרנספקציה. הוסף 78 מיקרוליטרים של ריאגנט טרנספקציה של ליפוזום ל-4.5 מיליליטר של מדיום סרום מופחת בצינור צנטריפוגה אחר כדי לדלל את הליפוזומים. מערבבים היטב על ידי הבהוב הצינור ולאחר מכן מאפשרים לו לעמוד במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.
הוסף 1.5 מיליליטר של תמיסת ליפוזום מדולל לתוך כל צינור המכיל 1.5 מיליליטר של תמיסת DNA מדולל. מערבבים היטב ומקשרים את הפלסמידים עם הליפוזומים למשך 20 דקות לפחות בטמפרטורת החדר. השליכו את המדיום המקורי מצלחות הפטרי והוסיפו תשעה מיליליטר של מדיום הסרום המופחת לכל מנה.
מוסיפים שלושה מיליליטר מתערובת הדנ"א הליפוזום ומערבבים את התמיסה על ידי ניעור עדין של הצלחת הלוך ושוב שלוש פעמים ואז שמאלה וימינה שלוש פעמים לפיזור שווה של התערובת על הצלחת. תרבית את התאים באינקובטור הלח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. החלף את המדיום לאחר ארבע עד שש שעות והמשיך לתרבת את התאים במשך 24 עד 36 שעות.
לאחר 24 עד 36 שעות, לטפל בתאים עם MG132 בריכוז סופי של 10 micromolar במשך ארבע עד שש שעות. השליכו את המדיום ושטפו את התאים פעמיים עם PBS קר כקרח. מוסיפים מיליליטר אחד של PBS לתבשיל.
הסר את התאים על ידי גירוד אותם עם מגרד נקי ולהעביר את מתלה התא לתוך צינורות microcentrifuge. צנטריפוגה ב 700 G במשך חמש דקות כדי לאסוף את כדורי התא. הוסיפו 800 מיקרוליטרים של חיץ FLAG lysis קר כקרח בתוספת קוקטייל מעכבי פרוטאז לתאים בכל צינור.
מערבבים את התאים באמצעות מתנד מערבולת או אקדח פיפטה ולאחר מכן לדגור את התערובת על מסובב בארבע מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. אולטרא-סאונד של התערובת על הקרח כאשר כל פולס נמשך שנייה אחת, והכפיף את התערובת לחמש עד 10 פולסים קצרים. לדגור את התערובת על סיבוב ב 40 סל"ד במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס.
ואז צנטריפוגה דגימות ultrasonicated ב 8, 000 G במשך 20 עד 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. העבירו את הסופר-נטנט לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש. Aliquot 80 microliters של תמצית התא לערבב עם 20 microliters של 5X SDS טעינה חיץ.
מרתיחים את הדגימות ב 98 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. מצננים על הקרח כשתי דקות ומאחסנים בחום של מינוס 20 מעלות עד לשימוש. השתמש בדגימות אלה כקבוצת הקלט כדי לנטר את ביטוי החלבון.
לאחר מכן, הוסיפו 30 מיקרוליטרים של חרוזים מצומדים נגד נוגדן M2 נגד FLAG לתמציות התאים הנותרות ודגרו על סיבוב בארבע מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות לפחות או למשך הלילה. צנטריפוגה ב 1, 500 גרם במשך שתי דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי לאסוף את החרוזים. מוסיפים מיליליטר אחד של חיץ FLAG lysis קר כקרח לחרוזים ומערבבים על ידי היפוך הצינור מספר פעמים.
חזור על שלב זה ארבע עד שש פעמים, ולאחר מכן הוסף 40 מיקרוליטרים של פפטידי FLAG בריכוז סופי של 200 ננוגרם למיקרוליטר לחרוזים. דגירה על מסובב במשך שעתיים כפי שהוצג קודם לכן ולאחר מכן צנטריפוגה באותה טמפרטורה. העבר את הסופר-נאטנט לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש והוסף 10 מיקרוליטרים של מאגר טעינת SDS 5X.
מרתיחים את התערובת ב 98 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות ולאחר מכן לקרר אותו על קרח במשך שתי דקות. מוסיפים מיליליטר אחד של PBS קר כקרח לכדורי התא ומערבבים באופן שווה. Aliquot 100 microliters של מתלה התא לתוך צינור microcentrifuge כמו דגימת קלט צנטריפוגה ב 700 G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי לאסוף את כדורי התא.
הוסף 80 מיקרוליטרים של מאגר FLAG lysis לדגימת הקלט וערבב את התאים באמצעות מתנד מערבולת כפי שהוצג קודם לכן. מניחים את התאים על הקרח במשך שעה ואז שוב צנטריפוגה למשך 20 עד 30 דקות. לאחר צנטריפוזיה aliquot 80 microliters של supernatant לתוך צינור microcentrifuge חדש ולהוסיף 20 microliters של 5X SDS טעינה מאגר supernatant.
מרתיחים את התערובת ב 98 מעלות צלזיוס במשך 5 עד 10 דקות ולאחר מכן מגניב על קרח במשך שתי דקות. צנטריפוגה של 900 המיקרוליטרים הנותרים של מתלה התא ב 700 G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי לאסוף את כדור התא. הוסיפו מיליליטר אחד של מאגר יוביקוויטין 1 לכדורי התא וערבבו על ידי פיפטינג למעלה ולמטה מספר פעמים כדי לפזר את התאים באופן שווה.
נושא התא ליזאט ל 10 עד 20 סיבובים של אולטרה סאונד על הקרח עד שהתמיסה כבר לא צמיגית, ולאחר מכן צנטריפוגה את התמיסה. העבירו את הסופרנטנט לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש והוסיפו 30 מיקרוליטרים של שרף טעון ניקל לסופרנטנט. לדגור על סיבוב ב 15 סל"ד במשך ארבע שעות או לילה בטמפרטורת החדר ולאחר מכן צנטריפוגה במשך שתי דקות.
לאחר centrifusion, לאסוף את החרוזים ולהוסיף מיליליטר אחד של ubiquitin חיץ 1 אליו. דגירה עם סיבוב בשייקר במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן צנטריפוגה שוב ב 1, 500 G במשך שתי דקות, כפי שהוצג קודם לכן. מוסיפים מיליליטר אחד של מאגר יוביקוויטין 2 לחרוזים ומבצעים דגירה ואחריה צנטריפוגה, כפי שהוצג קודם לכן, כדי לאסוף את החרוזים.
חזור על שלב זה פעם אחת. לאחר מכן, להוסיף מיליליטר אחד של PBS לחרוזים ופעל לפי אותו הליך של דגירה וצנטריפוגה כדי לאסוף את החרוזים. חזור על שלב זה שוב.
חלבונים הקשורים לאלוטה על ידי דגירה של החרוזים עם 40 מיקרוליטרים של אימידזול בריכוז סופי של 0.5 טוחנות למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה, צנטריפוגה שוב ב 1, 500 G במשך שתי דקות. העבירו את הסופר-נאטנט לצינור מיקרוצנטריפוגה נקי והוסיפו 10 מיקרוליטרים של מאגר טעינת SDS 5X.
מרתיחים את התמיסה ב 98 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות ולאחר מכן לקרר אותו על קרח במשך שתי דקות. פתור את הדגימות על ידי SDS-PAGE ולאחר מכן העבר אותן לקרום ניטרוצלולוז על ידי כתם מערבי כדי לזהות חלבוני מטרה באמצעות הנוגדנים המתאימים. הפעל את מערכת ההדמיה chemiluminescence כדי לזהות אותות מהכתם המערבי.
מניחים את קרום הניטרוצלולוז בקמרה אובסקורה עם הפנים כלפי מעלה. לקודד את תמיסת המצע באופן שווה על הממברנה באמצעות אקדח פיפטה. לבסוף, בחר את הליך החשיפה האוטומטי כדי ללכוד את האותות הכימילומינסנטיים וכוונן ידנית את זמן החשיפה עד להשגת אות אידיאלי.
סה"כ חלבון p53, כולל p53 ubiquitinated, היה חיסוני עם חרוזי FLAG M2 מתאי H1299 בתנאים שאינם דנטורציה. האלואט היה נתון לכתמים מערביים עם אנטי p53 ואנטי המגלוטינין או עם אנטי p53 ונוגדנים חד שבטיים. כאן, תמציות התאים הגולמיים או הקלט היו נתונים לכתמים מערביים עם נוגדנים חד שבטיים נגד p53 ונגד MDM2.
האות מחלבון p53 המצוי בכל מקום, המופיע כלהקה מרוחה ממשקל מולקולרי נמוך לגבוה, עלה במידה ניכרת כאשר MDM2 בא לידי ביטוי באופן אקטופי בתאים אלה. תוצאה זו מרמזת על כך שהחלבון p53 המצוי בכל מקום טוהר ביעילות מהתאים. לאחר מכן, התאים היו שוכבים בתנאי דנטורציה.
סך כל החלבונים הנמצאים בכל מקום בתאים נמשכו למטה עם שרף טעון ניקל, ולאחר מכן היו נתונים לכתמים מערביים עם נוגדנים חד-שבטיים נגד p53 ונגד המגלוטינין. חלבון p53 המצוי בכל מקום זוהה באמצעות נוגדן נגד p53 ונוגדן נגד המגלוטינין. כאן בתמציות התאים הגולמיים או הקלט היו נתונים לכתמים מערביים עם נוגדנים חד שבטיים נגד p53 ונגד MDM2.
התוצאות הראו כי רמת החלבון הכוללת של יוביקוויטין לא השתנתה, אך רמת החלבון p53 המצוי בכל מקום עלתה באופן דרמטי לאחר ש-MDM2 התבטא יתר על המידה בתאים אלה. זה מצביע על כך שסך חלבוני האוביקוויטין המכילים יוביקוויטין p53 נמשכו למעשה מליזאטים של תאים בתנאי דנטורציה. כאשר מנסים הליך זה, זכור לטפל בתאים עם MG132 לפני איסוף תאים אולטרה סאונד את התאים כראוי על הקרח לטיהור של חלבונים ubiquitinated.
