פרוטוקול זה מאפשר לנו לחקור בקלות את התכונות האפיגנטיות של מחלה נוירודגנרטיבית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מנצלת שמרים כמערכת מודל, בהשוואה למודלים תאיים ובעלי חיים אחרים של מחלה נוירודגנרטיבית, שמרים הוא יעיל וחסכוני. טכניקה זו מאפשרת לנו למפות את השינויים האפיגנטיים המתעוררים במחלה נוירודגנרטיבית, אשר עשוי להוביל סמנים חדשים לאבחון, כמו גם מטרות חדשות לטיפול.
שיטה זו מאפשרת חקירה נוספת של תפקידם של סימנים אפיגנטיים במחלות ניווניות ו ניתן לשנותה להערכת פיברובלסטים אנושיים ותאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים. שיטה מסוימת זו מכילה מספר פרטים שיש להדגים חזותית, כגון טעינה נכונה של מנגנון הכתם המערבי. הדגימו את ההליך יהיו מישל פלאח ונבין ראנה, שניהם חוקרים לתואר ראשון במעבדת טורנטה.
התחל על ידי restreaking שמרים ממניות גליצרול קפוא על היסטידין 2% גלוקוז אגר צלחות בינוניות סלקטיבית, עבור דגירה יומיים עד שלושה ימים ב 30 מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, לחסן שמרים restreaked עבור כל מודל ביטוי ושליטה בחמישה מיליליטר של מדיום נוזלי סלקטיבי היסטידין. בתוספת של 2% ב-30 מעלות צלזיוס ו-200 סיבובים בדקה, למשך הלילה.
למחרת בבוקר, לגדל 100 מיליליטר של תרבות נוזלית עבור כל אחד מודלים overexpression ובקרות מדיומים סלקטיביים בתוספת 2% גלקטוז לילה. ולמדוד את הצפיפות האופטית ב 600 ננומטר או OD600 כדי לקבוע את נפח תרבות הלילה הדרושה כדי לעבד מעל תרבויות ביטוי ב OD600 ההתחלה של 0.3. כדי לגרום ללחץ יתר של חלבון, לגדל את השמרים על מדיום גלקטוז עם רועד ב 30 מעלות צלזיוס לתקופת הזמן הניסיונית המתאימה.
לאחר מכן למדוד את OD600 של כל תרבות בסוף תקופת אינדוקציה. ותקן את כל ספירת התאים לערך OD600 הנמוך ביותר. לקצור את התרבויות ב 50 צינורות צנטריפוגה מיליליטר על ידי צנטריפוגה ו resuspend כדורי במיליליטר אחד של מים סטריליים סטילס עבור כל 10 מיליליטר של תרבות גדל.
Aliquot מיליליטר אחד של שימוש חוזר בתא לתוך צינורות microcentrifuge בודדים עבור צנטריפוגה נוספת לשאוף את supernatants. ואז הצמד להקפיא את כדורי התא בחנקן נוזלי לאחסון במינוס 80 מעלות צלזיוס. כדי ללטף את התאים לניתוח כתם מערבי, להפשיר את כדורי תא השמרים על קרח לפני ההתכוונות ב 100 microliters של מים מזוקקים.
הוסף 300 microliters של 0.2-טוחן נתרן הידרוקסיד ו 20 microliters של 2-Mercaptoethanol לכל דגימת תא. ולתלות מחדש את הכדורים על ידי צינורות. לאחר דגירה של 10 דקות על קרח, גלולה התאים על ידי צנטריפוגה ו resuspend את הדגימות ב 100 microliters של צבע טעינה.
ואז להרתיח את הדגימות במשך 10 דקות על בלוק חימום. בזמן שהדגימות נדגמים, מניחים שני ג'לים במחזיק ג'ל וממלאים את התא הפנימי למעלה עם חיץ ריצה ואת התא החיצוני לסימן קו שני ג'ל. כאשר הדגימות מוכנות, לטעון 15 microliters כל אחד, פתרון תמיסת תא, לתוך כל באר של 10 באר, 12% פוליאקרילמיד ג'ל ולהוסיף חמישה microliters של סולם חלבון לנתיב סולם החלבון היטב.
מפעילים את הג'ל כ-45 דקות ב-150 וולט או עד שהטענת צבע קדמי מגיעה לתחתית הג'ל. בזמן הג'ל פועל, להשרות שתי רפידות סיבים לכל ג'ל במאגר העברה אחד פוליווינילידין פלואוריד, או PVDF, קרום לכל ג'ל במתנול. כאשר הג'ל מוכן, יש לשטוף את הממברנה במאגר ההעברה ולהציב כרית סיבים אחת על תחתית תא מנגנון העברה יבש למחצה.
ואחריו קרום PVDF, הג'ל ו כרית הסיבים השנייה. ואז להגדיר את הכוח ל150 מיליאמפר לשעה אחת. בסוף העברת החלבון, מוציאים את הממברנה ממנגנוני ההעברה לשטיפה קצרה במים מזוקקים.
מניחים את הממברנה שטוף, צד חלבון למעלה בקופסת כתמים קטנה לכסות את הממברנה עם מלוחים טריס-buffered או TBS, חסימת חיץ עבור דגירה של שעה אחת בטמפרטורת החדר עם נדנדה עדינה. בסוף הדגירה החוסמת, הדגירה את הממברנה לילה עם היסטון אנטי שמרים ונוגדן ספציפי לשינוי ב- TBS בארבע מעלות צלזיוס. ונוגדן בקרת טעינה גרעינית ראוי.
למחרת בבוקר, לשטוף את הממברנה ארבע פעמים ב TBS, בתוספת 0.1% polysorbate 20 במשך חמש דקות עם נדנדה בטמפרטורת החדר לכל לשטוף. לאחר הכביסה האחרונה, הדגירה את הכתם עם הנוגדנים המשניים המתאימים במשך שעה בטמפרטורת החדר. ואחריו ארבע, חמש דקות שוטף ב TBST ואחד חמש דקות לשטוף ב- TBS לבד עם נדנדה.
ואז לדמיין את הכתם על מערכת כתמים מערבית פלואורסצנטיים לדמיין במשך שתי דקות. כאן, דיכוי צמיחה בתרבויות מוצקות ונוזליות מוצג עם השפעות משמעותיות על צמיחת שמרים שנצפו בנוכחות גלקטוז חדורים במודלים של לחץ יתר של סרקומה. ירידה משמעותית ברמות היסטון ניכרים במודל התמזגות בסרקומה overexpression ועליות משמעותיות ברמות של אצטילציה היסטון במודל 43 חלבון מחייב TAR overexpression, נצפו כי אינם נראים גם התמזגו סרקומה או אלפא סינוקליין מודל לחץ יתר.
יש גם ירידות משמעותיות ברמות ההיסטון במודל הדיכוי המודח של אלפא סינוקליין. בניסוי זה של כוונון סוכרוז, כך כמות הגלקטוז המשמשת להעשרת סרקומה נמוכה יותר, כך הרעילות הנמוכה יותר נצפית הן בתרבות המוצקה והן בתרבות הנוזלית. חשוב לציין, ככל שרמת ההתמזגות בלחץ יתר של סרקומה נמוכה יותר, כך גודל הירידה ברמות היסטון קטן יותר.
בעת ביצוע פרוטוקול זה, חובה לתקנן את כמות השמרים בכל מדגם כדי לאפשר השוואה נאותה ברמות של שינוי היסטון לאחר התרגום. 2-Mercaptoethanol יש להשתמש מתחת למכסה המנוע כדי למנוע שאיפה. אם נעשה שימוש בכתם פונסאו, יש להשליך אותו כראוי.
