We thank Sue Lindquist, Aaron Gitler, and Martin Duennwald for kindly sharing reagents. Our studies were supported by: an American Heart Association Post-Doctoral Fellowship (M.E.J); NIH Director's New Innovator Award DP2OD002177, NIH grants R21NS067354, R21HD074510, and R01GM099836, a Muscular Dystrophy Association Research Award (MDA277268), Packard Center for ALS Research at Johns Hopkins University, Target ALS, and an Ellison Medical Foundation New Scholar in Aging Award (J.S.).

1. ספריית דור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבנות ספריות של Hsp104 באמצעות PCR מועדת לטעויות תחום ספציפי, להגביר ראשון תחום עניינים עם DNA פולימרז לשגיאות 20. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את מוצר ה- PCR על ידי שאיבת קריש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע צעד הארכת megaprimer באמצעות פרוטוקול מוטגנזה מכוון סטנדרטי: לשלב פלסמיד 50 ng תבנית, 250 megaprimer ng, 200 מיקרומטר dNTPs, וDNA פולימרז באיכות גבוהה במאגר PCR, ולדלל את נפח כולל של 50 μl עם מים הכיתה PCR 20 . להפעיל תכנית PCR סטנדרטית. הערה: פריימרים ספציפיים בשימוש ישתנה בהתאם לאזור המסוים של הגן שהוא להיות מוגברים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות PCR, לעכל תבנית ה- DNA של הורים עם μl 1 אנזים הגבלת DPN אני לשעה 2 ב 37 מעלות צלזיוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך את הספרייה באמצעות electroporation או אחר בultracompetent E. coli ולטהר אותו על ידי miniprep. הערה: דור ספרייהמשתנה מבוסס במידה מהותית על המטרות של ניסוי נתון. Hsp104 הוא חלבון גדול מאוד, כך שזה לא מעשי באקראי כל הגן, וזו הסיבה שאנו מנצלים PCR לשגיאות תחום ספציפי. בנוסף, המבנה של Hsp104 נשאר הבין היטב, והעיצוב של ספריות בבימוי מאתגרות 21. ניתן לבנות ספריות תוך שימוש בגישות מכוונות או אקראיות לmutagenesis, עם ההגבלה היחידה הוא שעמוד שדרת פלסמיד התבנית צריכה להכיל את גן URA3 כדי לאפשר 5-פואה בחירת דלפק בתקשורת דקסטרוז. </li></ol> 2. שינוי של ספריית Hsp104 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשלב את המצע הקשורים למחלות לשמרי Hsp104 W303aΔ באמצעות ליתיום אצטט סטנדרטי / פרוטוקול שינוי PEG 22. בחר מושבות אחת ולסנן אותן לרעילות לבודד את מתח עם רעילות גבוהה של המחלה קשורה מצע 23. הערה: השתמש במתח וIsola משולביםTE מושבה אחת כדי להבטיח ביטוי שווה בכל התאים. לשכפל את מצע המחלה לפלסמיד המאפשר שילוב של הגן תחת כל סמן אחר מאשר אורציל (אנו משתמשים היסטידין) וספריית Hsp104 לפלסמיד pAG416GAL (סמן אורציל) 24. כדי לאפשר ל5-פואה counterselection, להבטיח שהספרייה באה לידי ביטוי מפלסמיד עם סמן אורציל. יכולים גם להיות מועסקים זני שמרים אחרים. רשמתי לפנינו את הפנוטיפ דיכוי רעילות דומה באמצעות W303a וBY4741 זני שמרים בשני רקעי Hsp104 WT וΔ (Mej וJS, תצפיות לא פורסמו). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך את ספריית Hsp104 לזן זה תוך שימוש באותו ליתיום אצטט / פרוטוקול שינוי PEG 22. בהיקף של עד השינוי כראוי כדי לשמור על מרחב הרצף של הספרייה ולשמור על גודל הספרייה חזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט תערובת הטרנספורמציה על noninducing, צלחות סלקטיבית (למשל SD--אורה) באמצעות מספיק צלחות ללהבטיח צמיחה של מספר רב של מושבות. השתמש בצלחות פטרי גדולות (150 מ&quot;מ) כדי למזער את מספר הצלחות הנחוצות. שחזור transformants באמצעות צלחות מאפשר יעילות שינוי להיות מוערכת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך Hsp104 WT ובקרות שליליות וקטור במקביל. </li></ol> 3. הקרנה לדיכוי Proteotoxicity <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את המושבות מהצלחות באמצעות תקשורת נשירת raffinose תוספת (למשל SRaff--אורה). השתמש פיפטה סרולוגית והחלה מעץ סטרילי כדי לשחרר את המושבות מהצלחות. העבר את שטיפות נוזל לצינור חרוטי 50 מיליליטר ומערבולת ביסודיות כדי להפריד כל גושים של תאים. לדלל את תרבות מעונן במקצת, OD 600 ~ 0.025. הערה: כאן raffinose משמשת כדי להקל על התאים של דיכוי בתיווך גלוקוז של אינדוקציה, וכך תחול התאים לזירוז בתיווך גלקטוז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול התרבות בדילול הלילה בתקשורת נשירת raffinose עם רועד ב30 ºC. לגדול WT Hsp104 ובקרות וקטור במקביל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת בבוקר, צלחת טווח ריכוזים על גלקטוז הבודד צלחות (למשל SGal--האורה) (1 μl 2 מיליליטר מרוכז תרבות ב400 μl נפח כולל). ציפוי במגוון רחב של ריכוזים יבטיח כי צלחת תהיה מושבות אחת. הריכוז בפועל נדרש תלוי ברעילות של מצע המחלה של עניין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנרמל את הווקטור ותרבויות Hsp104 WT לOD 600 של הספרייה וצלחת כמויות שווה להשוות צמיחה של הספרייה ביחס לקבוצת הביקורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להעריך החמרת בחירה, צלחת הספרייה ברמת סוכר (הדחקה) תקשורת. דגירה צלחות במשך 2-3 ימים ב 30 ºC, עד מושבות להופיע (איור 2). להעריך את המושבות וכתוצאה מכך ולהשוות לקבוצת הביקורת. הערה: לעתים קרובות שני מושבות גדולות וקטנות מתקבלות, אבל אין קשר בין גודל מושבה ומעשהivity הוא ציין. מסך להיטים הפוטנציאליים אלה תוך שימוש בטכניקת 5-פואה בחירת דלפק (שלב 4) כדי למזער את התוצאות החיוביות שגויות נשאו מעל לריצוף. </li></ol> 4. 5-פואה Counterselection והאיתור לחסל חיובי שגוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פס החוצה מושבות אחת בשני עותקים על גבי מדיה זוגית אחת נשירה (למשל SD--האורה וSD-צלחות) ולגדול לילה בשעה 30 ºC. חזור עם פקדי וקטור וHsp104 WT. ציפוי על SD-לפני 5-פואה מגבירה את היעילות של שלב 5-פואה על ידי הגדלת הסבירות שתאים איבדו את הפלסמיד Hsp104 כאשר הם מצופים על 5-פואה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למנוע צלחות מהתייבשות, לעטוף את SD--אורה צלחות בparafilm ולאחסן ב 4 ºC בעת ביצוע מסך 5-פואה. צלחות אלה סופו של דבר לשמש לריצוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פס המושבות מSD-צלחות למושבות אחת על צלחות 5-פואה (YPD תקשורת + 1G / L 5-פואה) ו דגירה של 1-2 ימים ב 30 ו186 #; C עד מושבות אחת מופיע. כאן, 5-פואה הופכת למוצר רעיל (5-fluorodeoxyuridine) בתאים המכילים את גן URA3. כך, כל תאים מקננים עדיין פלסמיד Hsp104 ימותו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פס מושבות אחת מצלחות 5-פואה בשני עותקים על גבי SD-אורה וSD-צלחות. מבחן 3 מושבות לכל נפגעו כדי להגביר את הסבירות שמושבה אחת לפחות עבור כל פגע תאבד את הפלסמיד Hsp104. דגירה של 1-2 ימים ב 30 מעלות צלזיוס. מושבות שאיבדו את הפלסמיד Hsp104 לא יגדל על SD-צלחות, אך לא צלחות SD-אורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול הזנים שאיבדו פלסמידים Hsp104 לאיתור מבחני. לגדול הזנים לרוויה בתקשורת נשירת raffinose (למשל SRaff-שלו) ב -96 DeepWell 2 צלחות מיליליטר לילה בשעה 30 ºC עם רעד. הקפד לכלול זני שליטת 5-פואה טופלו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין צלחות לאיתור assay. בעזרת פיפטה רבה, 200 תקשורת נשירת raffinose μl aliquot (למשל SRaff-) לעמודות גם צלחת גם 96, בהזמנת 1 ו -7 לתרבויות המסודרות. Aliquot 250 μl של כל אחד 16 התרבויות רוויות בטורי 1 ו -7 של הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סדרתי לדלל את התרבויות 5 לקפל לתוך כל עמודה של הצלחת, ערבוב ביסודיות עם פיפטה רבה. הסר 50 μl של התרבות בדילול מלא מעמודים 6 ו -12 כדי להבטיח את הנפח הסופי של כל אחד גם הוא 200 μl. זה חיוני כדי להבטיח גם תצפית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בכלי 96-בורג משכפל (Frogger), לזהות את התרבויות בשני עותקים על גבי SD-SGal-צלחות ו. דגירה הצלחות על 30 ºC במשך 2-3 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר עבור סידור זנים כי תערוכת רעילות על SGal-צלחות דומות לזה של קבוצת הביקורת. בטל זנים חיוביים שקריים שאינם רעילים כמו הפקדים. 5-פואה היא גם לעתים קרובות רעילה בפני עצמו, כל כך להשליך זנים כי תערוכת פגם צמיחה בSD-צלחות או שהם מציגים רעילות משמעותית יותר מאשר מצע המחלה לבד ( <strong&gt; איור 3). </li></ol> 5. סידור גרסאות Hsp104 על ידי המושבה PCR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמרים לגרד ~ 10 μl מצלחות SD--האורה ב 3 μl 20 מ&quot;מ NaOH בצינורות רצועת PCR וlyse התאים על ידי ההפשרה הקפאה. מניחים את צינורות הרצועה במקפיא -80 ºC למשך 10 דקות או בחנקן נוזלי, ואז לדגור על 99 ºC בthermocycler למשך 10 דקות. לדלל את הזנים למי כיתה PCR 100 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן PCR תגובות: תבנית PCR 5 μl, 0.5 μl 100 מיקרומטר כל צבע יסוד, 10mm dNTPs 0.5 μl, 0.25 DNA פולימרז μl במאגר PCR, ולעשות עד נפח כולל של 25 μl עם מים כיתה PCR. פריימרים עיצוב כדי להגביר את האזור באופן אקראי בתוספת כ -100 נ&quot;ב בכל קצה. מזער את הגודל של האזור המוגבר כדי להגדיל את הסיכוי של הגברה מוצלחת. להפעיל תכנית PCR סטנדרטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח דגימות על ידי ג&#39;ל אלקטרופורזה agarose כדי לאשר הגברה של מוצר ה- PCR של siz המתאיםדואר. חזור PCR אם אין מוצר קיים. הערה: הכשל בPCR הוא בדרך כלל עקב יותר מדי שמרים בשימוש בשלב 5.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן דגימות לרצפי DNA. הסר פריימרים PCR או על ידי טיהור PCR או באמצעות מגיב ניקוי מוצר ה- PCR כמו exonuclease אני ושרימפס אלקליין phosphatase אנזים (ExoSAP-IT) לבזות DNA חד גדילים. מגיב זה אנזימי מדרדרת פריימרים וdNTPs מאוגדים, המאפשר תפוקה גבוהה יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רצף מוצרי ה- PCR. הקפד לנתח ביסודיות chromatograms רצף למוטציות. מוטציות אפשר לראות כתערובת של שני נוקלאוטידים באתר נתון (איור 4), כמרים לעתים קרובות נמל פלסמידים מרובים. </li></ol>

<ol>
	<li>Johnson, B. S., McCaffery, J. M., Lindquist, S., Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+yeast+TDP-43+proteinopathy+model:+Exploring+the+molecular+determinants+of+TDP-43+aggregation+and+cellular+toxicity.">A yeast TDP-43 proteinopathy model: Exploring the molecular determinants of TDP-43 aggregation and cellular toxicity.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 105 (17), 6439-6444 (2008).</li><li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Determinants+and+Genetic+Modifiers+of+Aggregation+and+Toxicity+for+the+ALS+Disease+Protein+FUS/TLS.">Molecular Determinants and Genetic Modifiers of Aggregation and Toxicity for the ALS Disease Protein FUS/TLS.</a> PLoS Biol. 9 (4), (2011).</li><li>Outeiro, T. F., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+Cells+Provide+Insight+into+Alpha-Synuclein+Biology+and+Pathobiology.">Yeast Cells Provide Insight into Alpha-Synuclein Biology and Pathobiology.</a> Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003).</li><li>Forman, M. S., Trojanowski, J. Q., Lee, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurodegenerative+diseases:+a+decade+of+discoveries+paves+the+way+for+therapeutic+breakthroughs.">Neurodegenerative diseases: a decade of discoveries paves the way for therapeutic breakthroughs.</a> Nat Med. 10 (10), 1055-1063 (2004).</li><li>Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress,+aging,+and+neurodegenerative+disease.">Stress, aging, and neurodegenerative disease.</a> N Engl J Med. 355 (21), 2254-2255 (2006).</li><li>Elden, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ataxin-2+intermediate-length+polyglutamine+expansions+are+associated+with+increased+risk+for+ALS.">Ataxin-2 intermediate-length polyglutamine expansions are associated with increased risk for ALS.</a> Nature. 466 (7310), 1069-1075 (2010).</li><li>Cooper, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-synuclein+blocks+ER-Golgi+traffic+and+Rab1+rescues+neuron+loss+in+Parkinson's+models.">Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson's models.</a> Science. 313 (5785), 324-328 (2006).</li><li>Gitler, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-synuclein+is+part+of+a+diverse+and+highly+conserved+interaction+network+that+includes+PARK9+and+manganese+toxicity.">Alpha-synuclein is part of a diverse and highly conserved interaction network that includes PARK9 and manganese toxicity.</a> Nature genetics. 41 (3), 308-315 (2009).</li><li>Su, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compounds+from+an+unbiased+chemical+screen+reverse+both+ER-to-Golgi+trafficking+defects+and+mitochondrial+dysfunction+in+Parkinson's+disease+models.">Compounds from an unbiased chemical screen reverse both ER-to-Golgi trafficking defects and mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease models.</a> Disease models &amp; mechanisms. (3-4), 194-208 (2010).</li><li>Tardiff, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+reveal+a+'druggable'+Rsp5/Nedd4+network+that+ameliorates+alpha-synuclein+toxicity+in+neurons.">Yeast reveal a 'druggable' Rsp5/Nedd4 network that ameliorates alpha-synuclein toxicity in neurons.</a> Science. 342 (6161), 979-983 (2013).</li><li>Tardiff, D. F., Tucci, M. L., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+8-hydroxyquinolines+protect+models+of+TDP-43+protein,+alpha-synuclein,+and+polyglutamine+proteotoxicity+through+distinct+mechanisms.">Different 8-hydroxyquinolines protect models of TDP-43 protein, alpha-synuclein, and polyglutamine proteotoxicity through distinct mechanisms.</a> The Journal of biological chemistry. 287 (6), 4107-4120 (2012).</li><li>Kim, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+modulation+of+eIF2alpha+phosphorylation+rescues+TDP-43+toxicity+in+amyotrophic+lateral+sclerosis+disease+models.">Therapeutic modulation of eIF2alpha phosphorylation rescues TDP-43 toxicity in amyotrophic lateral sclerosis disease models.</a> Nature. 46 (2), 152-160 (2014).</li><li>Ju, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+yeast+model+of+FUS/TLS-dependent+cytotoxicity.">A yeast model of FUS/TLS-dependent cytotoxicity.</a> PLoS Biol. 9 (4), (2011).</li><li>Shorter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp104:+a+weapon+to+combat+diverse+neurodegenerative+disorders.">Hsp104: a weapon to combat diverse neurodegenerative disorders.</a> Neurosignals. 16 (1), 63-74 (2008).</li><li>Vashist, S., Cushman, M., Shorter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applying+Hsp104+to+protein-misfolding+disorders.">Applying Hsp104 to protein-misfolding disorders.</a> Biochem Cell Biol. 88 (1), 1-13 (2010).</li><li>DeSantis, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Operational+Plasticity+Enables+Hsp104+to+Disaggregate+Diverse+Amyloid+and+Nonamyloid+Clients.">Operational Plasticity Enables Hsp104 to Disaggregate Diverse Amyloid and Nonamyloid Clients.</a> Cell. 151 (4), 778-793 (2012).</li><li>Jackrel, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potentiated+Hsp104+Variants+Antagonize+Diverse+Proteotoxic+Misfolding+Events.">Potentiated Hsp104 Variants Antagonize Diverse Proteotoxic Misfolding Events.</a> Cell. 156 (1-2), 170-182 (2014).</li><li>Wittrup, K. D., Verdine, G. L., Wittrup, K. D., Verdine, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. 503, 13-14 (2012).</li><li>Boeke, J. D., Trueheart, J., Natsoulis, G., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. 154, 164-175 (1987).</li><li>Miyazaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creating+Random+Mutagenesis+Libraries+by+Megaprimer+PCR+of+Whole+Plasmid+(MEGAWHOP).+Directed+Evolution+Library+Creation:+Methods+in+Molecular+Biology.">Creating Random Mutagenesis Libraries by Megaprimer PCR of Whole Plasmid (MEGAWHOP). Directed Evolution Library Creation: Methods in Molecular Biology.</a> eds FrancesH Arnold &amp; George Georgiou. 231, 23-28 (2003).</li><li>Saibil, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaperone+machines+for+protein+folding,+unfolding+and+disaggregation.">Chaperone machines for protein folding, unfolding and disaggregation.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (10), 630-642 (2013).</li><li>Gietz, R. D., Schiestl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+yeast+transformation+using+the+LiAc/SS+carrier+DNA/PEG+method.">High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method.</a> Nat. Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).</li><li>Armakola, M., Hart, M. P., Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TDP-43+toxicity+in+yeast.">TDP-43 toxicity in yeast.</a> Methods. 53 (3), 238-245 (2011).</li><li>Alberti, S., Gitler, A. D., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+suite+of+Gateway&#174;+cloning+vectors+for+high-throughput+genetic+analysis+in+Saccharomyces+cerevisiae.">A suite of Gateway&#174; cloning vectors for high-throughput genetic analysis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 24 (10), 913-919 (2007).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

כאן אנו מציגים את הגישה שלנו לבידוד גרסאות Hsp104 potentiated המדכאות את הרעילות של מצעים הקשורים למחלות באמצעות מודלים השמרים proteinopathy. שימוש בגישה זו, ספריות גדולות של גרסאות יכולות להיות מוקרנת בתפוקה גבוהה, עם המגבלה היחידה להיות מספר הגרסאות שעוברות מסך המשני 5-פואה. על י?...

המודלים proteinopathy השמרים פותחו לטיפול בהפרעות misfolding חלבון כוללים מחלת ניוון (ALS) ופרקינסון (PD) 1-3. ביטוי של החלבונים TDP-43 וFUS, שmisfold בחולי ALS, הם רעיל וmislocalize כדי ליצור אגרגטים cytoplasmic בשמרים 1,2. בדומה לכך, הביטוי של α-סינוקלאין (α-SYN), אשר היה מעורב בPD, הוא רעיל וmislocalizes כדי ליצור אגרגטים cytoplasmic בשמרים 3. תכונות אלה לשחזר פנוטיפים בחולים עם הפרעות אלה 4,5. כך, שמרי מודלים לספק פלטפורמה שימושית עבור בדיקות סקר לאיתור חלבונים או מולקולות קטנות המונעים או הפוך פנוטיפים אלה 2,6-13. אנו מעוניינים בפיתוח של חלבונים המסוגלים היפוך צבירה ורעילות בשל TDP-43, FUS, וα-syn. אנו מתמקדים בHsp104, AAA + חלבון משמרים כי הוא מסוגל ריסוק חלבונים ייחודי הן frאגרגטים אום אמורפי ועמילואיד בשמרים, אך אין לה homologue אדם 14,15. Hsp104 רגיש ועדין לdisaggregate פריונים שמרי אנדוגני ויש לו רק יכולת מוגבלת disaggregate מצעים המעורבים במחלות ניווניות אנושיות, שזה אף פעם לא נתקל בדרך 16,17. כך, אנו שואפים להנדס גרסאות משופרות של Hsp104 כי הם מסוגלים disaggregate efficaciously מצעים האנושיים אלה. לשם כך, אנו בונים ספריות גדולות של Hsp104 גרסאות באמצעות PCR ומועד לשגיאות; יכולות להיות מוקרנת ספריות אלה באמצעות המודלים השמרים proteinopathy 17. אנחנו אימצנו גישה ממוקדת-תחום לבניית וסינון ספריות, כHsp104 הוא גדול מאוד 17. אנחנו בתחילה התמקדנו בתחום ביניים (MD) של Hsp104 17, אם כי יכולים להיות מועסקות גישות דומות לדומיינים אחרים. מודלים אלה מאפשרים בדיקות סקר לאיתור פעילות Disaggregase ישירות, בניגוד לטכניקות חלופיות כגון תצוגה לפני שטח, ושארricted להשתמש לניטור מחייב 18. הפרוטוקול שלנו מבוסס על שני שלבי סינון (איור 1). ראשית, גרסאות Hsp104 המדכאות את הרעילות של מצע המחלה בשמרים נבחרות. לשם כך, Hsp104 גרסאות ו- קשור מחלה מצעם cotransformed לשמרי Hsp104 Δ. אנו מעסיקים שמרי Hsp104 Δ ללחקור את חלל רצף Hsp104 בהעדר wild-type (WT) Hsp104 17. חשוב לציין, מחיקה של Hsp104 אינה משפיעה על α-syn, FUS, או TDP-43 רעילות בשמרים, וביטוי של Hsp104 WT מספק הצלה מינימאלית 1,13,17. השמרים אז מצופים על גרימת תקשורת כדי לגרום לביטוי של שני החלבונים. שמרים מחסה גרסאות Hsp104 המדכאות רעילות של הצמיחה מקנה המצע הקשורים למחלות של המושבה. גרסאות אלו נבחרו לניתוח נוסף, בעוד שמושבות שמירת גרסאות שאינו לדכא למות רעילות. עם זאת,תוצאות חיוביות שגויות הן בעיה משמעותית במסך זה. הביטוי של TDP-43, FUS, וα-syn הוא רעיל ביותר, אשר יוצר לחץ סלקטיבי חזק להופעתו של מדכאי גנטיים ספונטניים של רעילות שאינה קשורה לגרסת Hsp104 לידי ביטוי. כך, יש לנו להשתמש במסך משני שהוא גם גבוהה יחסית תפוקה לחסל מדכאי רעילות ספציפיים אלה 17. במסך המשני זו, מטופלים שמרים נבחרים עם 5-Fluorootic חומצה (5-פואה) כדי להתמודד בחר לפלסמיד Hsp104 19. אז הזנים נבחנים לגבי מצע רעילות (TDP-43, FUS, או α-SYN) באמצעות איתור assay כדי להבטיח שהרעילות של המצע משוחזרת לאחר אובדן פלסמיד Hsp104. כך, שמרים שברעילות משוחזרת במסך משני זה כנראה שבעבר הוצגו דיכוי רעילות בשל נוכחותם של גרסת Hsp104. השמרים הללו מיועדים &#39;להיטים&#39; ופלסמיד Hsp104 צריך להיות אזהתאושש ורצף לזהות מוטציות בגן Hsp104 17 (איור 1). כל להיטים אז צריכים להיות אושר על ידי בניית המוטציה באופן עצמאי באמצעות מוטגנזה מכוונת ולאחר מכן בדיקה חוזרת לדיכוי רעילות. היישומים האפשריים עבור פרוטוקול זה הם רחבים. שימוש בשיטות אלה, ספריות מכל סוג של חלבון יכולות להיות מוקרנת לגרסות המדכאות רעילות של כל חלבון מצע כי הוא רעיל בשמרים.

<table><tbody><tr><td>GeneMorphII EZClone Domain Mutagenesis Kit</td><td>Agilent</td><td>200552</td><td></td></tr><tr><td>150 mm Petri dishes</td><td>Falcon</td><td>351058</td><td></td></tr><tr><td>5-Fluorootic Acid</td><td>Research Products International</td><td>f10501-5.0</td><td></td></tr><tr><td>96-DeepWell 2 ml Plates</td><td>Eppendorf</td><td>0030 502.302</td><td></td></tr><tr><td>96 bold replicator tool</td><td>V&amp;amp;P Scientific</td><td>vp-404</td><td></td></tr><tr><td>ExoSAP-IT</td><td>Affymetrix</td><td>78200</td><td></td></tr></tbody></table>

isolating potentiated hsp104 variants using yeast proteinopathy models

Many protein-misfolding disorders can be modeled in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Proteins such as TDP-43 and FUS, implicated in amyotrophic lateral sclerosis, and &#945;-synuclein, implicated in Parkinson&#8217;s disease, are toxic and form cytoplasmic aggregates in yeast. These features recapitulate protein pathologies observed in patients with these disorders. Thus, yeast are an ideal platform for isolating toxicity suppressors from libraries of protein variants. We are interested in applying protein disaggregases to eliminate misfolded toxic protein conformers. Specifically, we are engineering Hsp104, a hexameric AAA+ protein from yeast that is uniquely capable of solubilizing both disordered aggregates and amyloid and returning the proteins to their native conformations. While Hsp104 is highly conserved in eukaryotes and eubacteria, it has no known metazoan homologue. Hsp104 has only limited ability to eliminate disordered aggregates and amyloid fibers implicated in human disease. Thus, we aim to engineer Hsp104 variants to reverse the protein misfolding implicated in neurodegenerative disorders. We have developed methods to screen large libraries of Hsp104 variants for suppression of proteotoxicity in yeast. As yeast are prone to spontaneous nonspecific suppression of toxicity, a two-step screening process has been developed to eliminate false positives. Using these methods, we have identified a series of potentiated Hsp104 variants that potently suppress the toxicity and aggregation of TDP-43, FUS, and &#945;-synuclein. Here, we describe this optimized protocol, which could be adapted to screen libraries constructed using any protein backbone for suppression of toxicity of any protein that is toxic in yeast.

בנינו ספרייה של גרסאות Hsp104 אקראיות בתחום האמצע והקרנו אותו לדיכוי TDP-43 רעילות. הספרייה הפכה ומצופית על גלוקוז וגלקטוז צלחות (איור 2) על מנת להעריך את החומרה של המסך. מושבות אחת נבחרו והזנים נבחרו דלפק באמצעות 5-פואה לחסל את הפלסמיד Hsp104. זנים אלה ולאחר מכן נבדקו ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolating Potentiated Hsp104 Variants Using Yeast Proteinopathy Models at JoVE.com

Isolating Potentiated Hsp104 Variants Using Yeast Proteinopathy Models

Yeast proteinopathy models are valuable tools to assess the toxicity and aggregation of proteins implicated in disease. Here, we present methods for screening Hsp104 variant libraries for toxicity suppressors. This protocol could be adapted to screen any protein library for toxicity suppressors of any protein that is toxic in yeast.

בידוד דוגמניות Proteinopathy שמרי שימוש potentiated Hsp104 גרסאות

Many protein-misfolding disorders can be modeled in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Proteins such as TDP-43 and FUS, implicated in amyotrophic ...

isolating-potentiated-hsp104-variants-using-yeast-proteinopathy-models

Research

JoVE Journal

Biology

8.1K Views.  Perelman School of Medicine at the University of Pennsylvania. Yeast proteinopathy models are valuable tools to assess the toxicity and aggregation of proteins implicated in disease. Here, we present methods for screening Hsp104 variant libraries for toxicity suppressors. This protocol could be adapted to screen any protein library for toxicity suppressors of any protein that is toxic in yeast.

Video: Isolating Potentiated Hsp104 Variants Using Yeast Proteinopathy Models

Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool commonly used in yeast studies. The expression of a number of neurodegenerative disease-associated proteins in yeast causes cytotoxicity and aggregate formation, recapitulating findings seen in patients with these disorders. Here, we describe a method for screening a yeast model of the Amyotrophic Lateral Sclerosis-associated protein FUS for modifiers of its toxicity. Instead of using transformation, this new screening platform relies on the mating of yeast to introduce an arrayed library of plasmids into the yeast model. The mating method has two clear advantages: first, it is highly efficient; second, the pre-transformed arrayed library of plasmids can be stored for long-term as a glycerol stock, and quickly applied to other screens without the labor-intensive step of transformation into the yeast model each time. We demonstrate how this method can successfully be used to screen for genes that modify the toxicity of FUS.

This article presents a mating-based method to facilitate overexpression screening in budding yeast using an arrayed plasmid library.

ביטוי ההזדווגות מבוססי ספריית הקרנה שמרים

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool ...

Genetics

Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53

The finding that the well-known mammalian P53 protein can act as a transcription factor (TF) in the yeast S. cerevisiae has allowed for the development of different functional assays to study the impacts of 1) binding site [i.e., response element (RE)] sequence variants on P53 transactivation specificity or 2) TP53 mutations, co-expressed cofactors, or small molecules on P53 transactivation activity. Different basic and translational research applications have been developed. Experimentally, these approaches exploit two major advantages of the yeast model. On one hand, the ease of genome editing enables quick construction of qualitative or quantitative reporter systems by exploiting isogenic strains that differ only at the level of a specific P53-RE to investigate sequence-specificity of P53-dependent transactivation. On the other hand, the availability of regulated systems for ectopic P53 expression allows the evaluation of transactivation in a wide range of protein expression. Reviewed in this report are extensively used systems that are based on color reporter genes, luciferase, and the growth of yeast to illustrate their main methodological steps and to critically assess their predictive power. Moreover, the extreme versatility of these approaches can be easily exploited to study different TFs including P63 and P73, which are other members of TP53 gene family.

Presented here are four protocols to construct and exploit yeast Saccharomyces cerevisiae reporter strains to study human P53 transactivation potential, impacts of its various cancer-associated mutations, co-expressed interacting proteins, and the effects of specific small molecules.

שמרים כתושבת לפיתוח Assays פונקציונלי ללמוד אנושי האדם

The finding that the well-known mammalian P53 protein can act as a transcription factor (TF) in the yeast S. cerevisiae has allowed for the development of ...

Cancer Research

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives each year. Effective treatment options able to halt disease progression are lacking. Despite the extensive sequencing efforts in large patient populations, the majority of ALS and PD cases remain unexplained by genetic mutations alone. Epigenetics mechanisms, such as the post-translational modification of histone proteins, may be involved in neurodegenerative disease etiology and progression and lead to new targets for pharmaceutical intervention. Mammalian in vivo and in vitro models of ALS and PD are costly and often require prolonged and laborious experimental protocols. Here, we outline a practical, fast, and cost-effective approach to determining genome-wide alterations in histone modification levels using Saccharomyces cerevisiae as a model system. This protocol allows for comprehensive investigations into epigenetic changes connected to neurodegenerative proteinopathies that corroborate previous findings in different model systems while significantly expanding our knowledge of the neurodegenerative disease epigenome.

This protocol outlines experimental procedures to characterize genome-wide changes in the levels of histone post-translational modifications (PTM) occurring in connection with the overexpression of proteins associated with ALS and Parkinson&#39;s disease in Saccharomyces cerevisiae models. After SDS-PAGE separation, individual histone PTM levels are detected with modification-specific antibodies via Western blotting.

אפיון שינויים Post-translational שינוי היסטון במודלים ניווניות Proteinopathy שמרים

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Significant efforts were gathered to generate large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is instrumental to understand the pathogen-host relationships and was essentially performed by genetic screenings in yeast two-hybrid systems. The recent improvement of protein-protein interaction detection by a Gaussia luciferase-based fragment complementation assay now offers the opportunity to develop integrative comparative interactomic approaches necessary to rigorously compare interaction profiles of proteins from different pathogen strain variants against a common set of cellular factors.
This paper specifically focuses on the utility of combining two orthogonal methods to generate protein-protein interaction datasets: yeast two-hybrid (Y2H) and a new assay, high-throughput Gaussia princeps protein complementation assay (HT-GPCA) performed in mammalian cells.
A large-scale identification of cellular partners of a pathogen protein is performed by mating-based yeast two-hybrid screenings of cDNA libraries using multiple pathogen strain variants. A subset of interacting partners selected on a high-confidence statistical scoring is further validated in mammalian cells for pair-wise interactions with the whole set of pathogen variants proteins using HT-GPCA. This combination of two complementary methods improves the robustness of the interaction dataset, and allows the performance of a stringent comparative interaction analysis. Such comparative interactomics constitute a reliable and powerful strategy to decipher any pathogen-host interplays.

This article focuses on the identification of high-confident interaction datasets between host and pathogen proteins using a combination of two orthogonal methods: yeast two-hybrid followed by a high-throughput interaction assay in mammalian cells called HT-GPCA.

גישה השוואתית כדי לאפיין את הנוף של אינטראקציות בין חלבונים מאכסן לפתוגן

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

Immunology and Infection

Purification of Hsp104, a Protein Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key selective advantages. First, renaturation of disordered aggregates by Hsp104 empowers yeast survival after various protein-misfolding stresses, including heat shock3,5,11,12. Second, remodeling of cross-beta amyloid fibrils by Hsp104 enables yeast to exploit myriad prions (infectious amyloids) as a reservoir of beneficial and heritable phenotypic variation13-22. Remarkably, Hsp104 directly remodels preamyloid oligomers and amyloid fibrils, including those comprised of the yeast prion proteins Sup35 and Ure223-30. This amyloid-remodeling functionality is a specialized facet of yeast Hsp104. The E. coli orthologue, ClpB, fails to remodel preamyloid oligomers or amyloid fibrils26,31,32.
Hsp104 orthologues are found in all kingdoms of life except, perplexingly, animals. Indeed, whether animal cells possess any enzymatic system that couples protein disaggregation to renaturation (rather than degradation) remains unknown33-35. Thus, we and others have proposed that Hsp104 might be developed as a therapeutic agent for various neurodegenerative diseases connected with the misfolding of specific proteins into toxic preamyloid oligomers and amyloid fibrils4,7,23,36-38. There are no treatments that directly target the aggregated species associated with these diseases. Yet, Hsp104 dissolves toxic oligomers and amyloid fibrils composed of alpha-synuclein, which are connected with Parkinson's Disease23 as well as amyloid forms of PrP39. Importantly, Hsp104 reduces protein aggregation and ameliorates neurodegeneration in rodent models of Parkinson's Disease23 and Huntington's disease38. Ideally, to optimize therapy and minimize side effects, Hsp104 would be engineered and potentiated to selectively remodel specific aggregates central to the disease in question4,7. However, the limited structural and mechanistic understanding of how Hsp104 disaggregates such a diverse repertoire of aggregated structures and unrelated proteins frustrates these endeavors30,40-42.
To understand the structure and mechanism of Hsp104, it is essential to study the pure protein and reconstitute its disaggregase activity with minimal components. Hsp104 is a 102kDa protein with a pI of ~5.3, which hexamerizes in the presence of ADP or ATP, or at high protein concentrations in the absence of nucleotide43-46. Here, we describe an optimized protocol for the purification of highly active, stable Hsp104 from E. coli. The use of E. coli allows simplified large-scale production and our method can be performed quickly and reliably for numerous Hsp104 variants. Our protocol increases Hsp104 purity and simplifies His6-tag removal compared to a previous purification method from E. coli47. Moreover, our protocol is more facile and convenient than two more recent protocols26,48.

Here, we describe a protocol for the purification of highly active Hsp104, a hexameric AAA+ protein from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation. This scheme exploits a His6-tagged construct for affinity purification from E. coli followed by anion-exchange chromatography, His6-tag removal with TEV protease, and size-exclusion chromatography.

טיהור Hsp104, Disaggregase חלבון

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key ...

Growth Assays to Assess Polyglutamine Toxicity in Yeast

Protein misfolding is associated with many human diseases, particularly neurodegenerative diseases, such as Alzheimer&#x2019;s disease, Parkinson's disease, and Huntington's disease 1. Huntington's disease (HD) is caused by the abnormal expansion of a polyglutamine (polyQ) region within the protein huntingtin. The polyQ-expanded huntingtin protein attains an aberrant conformation (i.e. it misfolds) and causes cellular toxicity 2. At least eight further neurodegenerative diseases are caused by polyQ-expansions, including the Spinocerebellar Ataxias and Kennedy&#x2019;s disease 3.
The model organism yeast has facilitated significant insights into the cellular and molecular basis of polyQ-toxicity, including the impact of intra- and inter-molecular factors of polyQ-toxicity, and the identification of cellular pathways that are impaired in cells expressing polyQ-expansion proteins 3-8. Importantly, many aspects of polyQ-toxicity that were found in yeast were reproduced in other experimental systems and to some extent in samples from HD patients, thus demonstrating the significance of the yeast model for the discovery of basic mechanisms underpinning polyQ-toxicity. 
A direct and relatively simple way to determine polyQ-toxicity in yeast is to measure growth defects of yeast cells expressing polyQ-expansion proteins. This manuscript describes three complementary experimental approaches to determine polyQ-toxicity in yeast by measuring the growth of yeast cells expressing polyQ-expansion proteins. The first two experimental approaches monitor yeast growth on plates, the third approach monitors the growth of liquid yeast cultures using the BioscreenC instrument. 
Furthermore, this manuscript describes experimental difficulties that can occur when handling yeast polyQ models and outlines strategies that will help to avoid or minimize these difficulties. The protocols described here can be used to identify and to characterize genetic pathways and small molecules that modulate polyQ-toxicity. Moreover, the described assays may serve as templates for accurate analyses of the toxicity caused by other disease-associated misfolded proteins in yeast models.

This manuscript describes three complementary protocols for assessing the toxicity of polyglutamine (polyQ)-expansion proteins in the yeast Saccharomyces cerevisiae. These protocols can easily be modified to monitor the toxicity of other misfolded proteins in yeast.

מבחני גידול כדי להעריך את רעילות Polyglutamine על שמרים

Protein misfolding is associated with many human diseases, particularly neurodegenerative diseases, such as Alzheimer&#x2019;s disease, Parkinson's ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

מבחני יחד לrefolding החלבון בניטור<em&gt; Cerevisiae Saccharomyces</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ryanodine receptor (RyR) is necessary for the formation of a functional Ca2+ release channel pore. Here, we describe detailed protocols for the assessment of protein self-association, including yeast two-hybrid (Y2H), co-immunoprecipitation (co-IP) and chemical cross-linking assays. In the Y2H system, protein self-interaction is detected by &#946;-galactosidase assay in yeast co-expressing GAL4 bait and target fusions of the test protein. Protein self-interaction is further assessed by co-IP using HA- and cMyc-tagged fusions of the test protein co-expressed in mammalian HEK293 cells. The precise stoichiometry of the protein homo-oligomer is examined by cross-linking and SDS-PAGE analysis following expression in HEK293 cells. Using these different but complementary techniques, we have consistently observed the self-association of the RyR N-terminal domain and demonstrated its intrinsic ability to form tetramers. These methods can be applied to protein-protein interaction and homo-oligomerization studies of other mammalian integral membrane proteins.

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Oligomerization of the ryanodine receptor, a homo-tetrameric ion channel mediating Ca2+ release from intracellular stores, is critical for skeletal and cardiac muscle contraction. Here, we present complementary in vivo and in vitro methods to detect protein self-association and determine homo-oligomer stoichiometry.

גישות גנטיות ביוכימיים עבור<em&gt; In vivo</em&gt; ו<em&gt; במבחנה</em&gt; הערכת oligomerization חלבון: מקרה המבחן קולטן Ryanodine

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ...

High-throughput Screening for Protein-based Inheritance in S. cerevisiae

The encoding of biological information that is accessible to future generations is generally achieved via changes to the DNA sequence. Long-lived inheritance encoded in protein conformation (rather than sequence) has long been viewed as paradigm-shifting but rare. The best characterized examples of such epigenetic elements are prions, which possess a self-assembling behavior that can drive the heritable manifestation of new phenotypes. Many archetypal prions display a striking N/Q-rich sequence bias and assemble into an amyloid fold. These unusual features have informed most screening efforts to identify new prion proteins. However, at least three known prions (including the founding prion, PrPSc) do not harbor these biochemical characteristics. We therefore developed an alternative method to probe the scope of protein-based inheritance based on a property of mass action: the transient overexpression of prion proteins increases the frequency at which they acquire a self-templating conformation. This paper describes a method for analyzing the capacity of the yeast ORFeome to elicit protein-based inheritance. Using this strategy, we previously found that &gt;1% of yeast proteins could fuel the emergence of biological traits that were long-lived, stable, and arose more frequently than genetic mutation. This approach can be employed in high throughput across entire ORFeomes or as a targeted screening paradigm for specific genetic networks or environmental stimuli. Just as forward genetic screens define numerous developmental and signaling pathways, these techniques provide a methodology to investigate the influence of protein-based inheritance in biological processes.

High-throughput Screening for Protein-based Inheritance in S. cerevisiae

This protocol describes a high-throughput methodology to functionally screen for protein-based inheritance in S. cerevisiae.

הקרנה תפוקה גבוהה של חלבון מבוססת ירושה cerevisiae ס

The encoding of biological information that is accessible to future generations is generally achieved via changes to the DNA sequence. Long-lived ...

A Method to Study &#945;-Synuclein Toxicity and Aggregation Using a Humanized Yeast Model

Parkinson's disease is the second most common neurodegenerative disorder and is characterized by progressive cell death caused by the formation of Lewy bodies containing misfolded and aggregated &#945;-synuclein. &#945;-synuclein is an abundant presynaptic protein that regulates synaptic vesicle trafficking, but the accumulation of its proteinaceous inclusions results in neurotoxicity. Recent studies have revealed that various genetic factors, including bacterial chaperones, could reduce the formation of &#945;-synuclein aggregates in vitro. However, it is also important to monitor the anti-aggregation effect in the cell to apply this as a potential treatment for the patients. It would be ideal to use neuronal cells, but these cells are difficult to handle and take a long time to exhibit the anti-aggregation phenotype. Therefore, a quick and effective in vivo tool is required for the further evaluation of in vivo anti-aggregation activity. The method described here was used to monitor and analyze the anti-aggregation phenotype in the humanized yeast Saccharomyces cerevisiae, which expressed human &#945;-synuclein. This protocol demonstrates in vivo tools that could be used for monitoring &#945;-synuclein-induced cellular toxicity, as well as the formation of &#945;-synuclein aggregates in cells.

An in vivo physiological model of &#945;-synuclein is required to study and understand the pathogenesis of Parkinson's disease. We describe a method to monitor the cytotoxicity and aggregate formation of &#945;-synuclein using a humanized yeast model.

שיטה לחקר רעילות וצבירה של α-סינוקלאין באמצעות מודל שמרים אנושי

Parkinson's disease is the second most common neurodegenerative disorder and is characterized by progressive cell death caused by the formation of Lewy ...

בידוד דוגמניות Proteinopathy שמרי שימוש potentiated Hsp104 גרסאות

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video