We thank Sue Lindquist, Aaron Gitler, and Martin Duennwald for kindly sharing reagents. Our studies were supported by: an American Heart Association Post-Doctoral Fellowship (M.E.J); NIH Director's New Innovator Award DP2OD002177, NIH grants R21NS067354, R21HD074510, and R01GM099836, a Muscular Dystrophy Association Research Award (MDA277268), Packard Center for ALS Research at Johns Hopkins University, Target ALS, and an Ellison Medical Foundation New Scholar in Aging Award (J.S.).

1. ספריית דור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבנות ספריות של Hsp104 באמצעות PCR מועדת לטעויות תחום ספציפי, להגביר ראשון תחום עניינים עם DNA פולימרז לשגיאות 20. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את מוצר ה- PCR על ידי שאיבת קריש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע צעד הארכת megaprimer באמצעות פרוטוקול מוטגנזה מכוון סטנדרטי: לשלב פלסמיד 50 ng תבנית, 250 megaprimer ng, 200 מיקרומטר dNTPs, וDNA פולימרז באיכות גבוהה במאגר PCR, ולדלל את נפח כולל של 50 μl עם מים הכיתה PCR 20 . להפעיל תכנית PCR סטנדרטית. הערה: פריימרים ספציפיים בשימוש ישתנה בהתאם לאזור המסוים של הגן שהוא להיות מוגברים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות PCR, לעכל תבנית ה- DNA של הורים עם μl 1 אנזים הגבלת DPN אני לשעה 2 ב 37 מעלות צלזיוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך את הספרייה באמצעות electroporation או אחר בultracompetent E. coli ולטהר אותו על ידי miniprep. הערה: דור ספרייהמשתנה מבוסס במידה מהותית על המטרות של ניסוי נתון. Hsp104 הוא חלבון גדול מאוד, כך שזה לא מעשי באקראי כל הגן, וזו הסיבה שאנו מנצלים PCR לשגיאות תחום ספציפי. בנוסף, המבנה של Hsp104 נשאר הבין היטב, והעיצוב של ספריות בבימוי מאתגרות 21. ניתן לבנות ספריות תוך שימוש בגישות מכוונות או אקראיות לmutagenesis, עם ההגבלה היחידה הוא שעמוד שדרת פלסמיד התבנית צריכה להכיל את גן URA3 כדי לאפשר 5-פואה בחירת דלפק בתקשורת דקסטרוז. </li></ol> 2. שינוי של ספריית Hsp104 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשלב את המצע הקשורים למחלות לשמרי Hsp104 W303aΔ באמצעות ליתיום אצטט סטנדרטי / פרוטוקול שינוי PEG 22. בחר מושבות אחת ולסנן אותן לרעילות לבודד את מתח עם רעילות גבוהה של המחלה קשורה מצע 23. הערה: השתמש במתח וIsola משולביםTE מושבה אחת כדי להבטיח ביטוי שווה בכל התאים. לשכפל את מצע המחלה לפלסמיד המאפשר שילוב של הגן תחת כל סמן אחר מאשר אורציל (אנו משתמשים היסטידין) וספריית Hsp104 לפלסמיד pAG416GAL (סמן אורציל) 24. כדי לאפשר ל5-פואה counterselection, להבטיח שהספרייה באה לידי ביטוי מפלסמיד עם סמן אורציל. יכולים גם להיות מועסקים זני שמרים אחרים. רשמתי לפנינו את הפנוטיפ דיכוי רעילות דומה באמצעות W303a וBY4741 זני שמרים בשני רקעי Hsp104 WT וΔ (Mej וJS, תצפיות לא פורסמו). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך את ספריית Hsp104 לזן זה תוך שימוש באותו ליתיום אצטט / פרוטוקול שינוי PEG 22. בהיקף של עד השינוי כראוי כדי לשמור על מרחב הרצף של הספרייה ולשמור על גודל הספרייה חזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט תערובת הטרנספורמציה על noninducing, צלחות סלקטיבית (למשל SD--אורה) באמצעות מספיק צלחות ללהבטיח צמיחה של מספר רב של מושבות. השתמש בצלחות פטרי גדולות (150 מ&quot;מ) כדי למזער את מספר הצלחות הנחוצות. שחזור transformants באמצעות צלחות מאפשר יעילות שינוי להיות מוערכת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך Hsp104 WT ובקרות שליליות וקטור במקביל. </li></ol> 3. הקרנה לדיכוי Proteotoxicity <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את המושבות מהצלחות באמצעות תקשורת נשירת raffinose תוספת (למשל SRaff--אורה). השתמש פיפטה סרולוגית והחלה מעץ סטרילי כדי לשחרר את המושבות מהצלחות. העבר את שטיפות נוזל לצינור חרוטי 50 מיליליטר ומערבולת ביסודיות כדי להפריד כל גושים של תאים. לדלל את תרבות מעונן במקצת, OD 600 ~ 0.025. הערה: כאן raffinose משמשת כדי להקל על התאים של דיכוי בתיווך גלוקוז של אינדוקציה, וכך תחול התאים לזירוז בתיווך גלקטוז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול התרבות בדילול הלילה בתקשורת נשירת raffinose עם רועד ב30 ºC. לגדול WT Hsp104 ובקרות וקטור במקביל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת בבוקר, צלחת טווח ריכוזים על גלקטוז הבודד צלחות (למשל SGal--האורה) (1 μl 2 מיליליטר מרוכז תרבות ב400 μl נפח כולל). ציפוי במגוון רחב של ריכוזים יבטיח כי צלחת תהיה מושבות אחת. הריכוז בפועל נדרש תלוי ברעילות של מצע המחלה של עניין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנרמל את הווקטור ותרבויות Hsp104 WT לOD 600 של הספרייה וצלחת כמויות שווה להשוות צמיחה של הספרייה ביחס לקבוצת הביקורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להעריך החמרת בחירה, צלחת הספרייה ברמת סוכר (הדחקה) תקשורת. דגירה צלחות במשך 2-3 ימים ב 30 ºC, עד מושבות להופיע (איור 2). להעריך את המושבות וכתוצאה מכך ולהשוות לקבוצת הביקורת. הערה: לעתים קרובות שני מושבות גדולות וקטנות מתקבלות, אבל אין קשר בין גודל מושבה ומעשהivity הוא ציין. מסך להיטים הפוטנציאליים אלה תוך שימוש בטכניקת 5-פואה בחירת דלפק (שלב 4) כדי למזער את התוצאות החיוביות שגויות נשאו מעל לריצוף. </li></ol> 4. 5-פואה Counterselection והאיתור לחסל חיובי שגוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פס החוצה מושבות אחת בשני עותקים על גבי מדיה זוגית אחת נשירה (למשל SD--האורה וSD-צלחות) ולגדול לילה בשעה 30 ºC. חזור עם פקדי וקטור וHsp104 WT. ציפוי על SD-לפני 5-פואה מגבירה את היעילות של שלב 5-פואה על ידי הגדלת הסבירות שתאים איבדו את הפלסמיד Hsp104 כאשר הם מצופים על 5-פואה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למנוע צלחות מהתייבשות, לעטוף את SD--אורה צלחות בparafilm ולאחסן ב 4 ºC בעת ביצוע מסך 5-פואה. צלחות אלה סופו של דבר לשמש לריצוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פס המושבות מSD-צלחות למושבות אחת על צלחות 5-פואה (YPD תקשורת + 1G / L 5-פואה) ו דגירה של 1-2 ימים ב 30 ו186 #; C עד מושבות אחת מופיע. כאן, 5-פואה הופכת למוצר רעיל (5-fluorodeoxyuridine) בתאים המכילים את גן URA3. כך, כל תאים מקננים עדיין פלסמיד Hsp104 ימותו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פס מושבות אחת מצלחות 5-פואה בשני עותקים על גבי SD-אורה וSD-צלחות. מבחן 3 מושבות לכל נפגעו כדי להגביר את הסבירות שמושבה אחת לפחות עבור כל פגע תאבד את הפלסמיד Hsp104. דגירה של 1-2 ימים ב 30 מעלות צלזיוס. מושבות שאיבדו את הפלסמיד Hsp104 לא יגדל על SD-צלחות, אך לא צלחות SD-אורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול הזנים שאיבדו פלסמידים Hsp104 לאיתור מבחני. לגדול הזנים לרוויה בתקשורת נשירת raffinose (למשל SRaff-שלו) ב -96 DeepWell 2 צלחות מיליליטר לילה בשעה 30 ºC עם רעד. הקפד לכלול זני שליטת 5-פואה טופלו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין צלחות לאיתור assay. בעזרת פיפטה רבה, 200 תקשורת נשירת raffinose μl aliquot (למשל SRaff-) לעמודות גם צלחת גם 96, בהזמנת 1 ו -7 לתרבויות המסודרות. Aliquot 250 μl של כל אחד 16 התרבויות רוויות בטורי 1 ו -7 של הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סדרתי לדלל את התרבויות 5 לקפל לתוך כל עמודה של הצלחת, ערבוב ביסודיות עם פיפטה רבה. הסר 50 μl של התרבות בדילול מלא מעמודים 6 ו -12 כדי להבטיח את הנפח הסופי של כל אחד גם הוא 200 μl. זה חיוני כדי להבטיח גם תצפית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בכלי 96-בורג משכפל (Frogger), לזהות את התרבויות בשני עותקים על גבי SD-SGal-צלחות ו. דגירה הצלחות על 30 ºC במשך 2-3 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר עבור סידור זנים כי תערוכת רעילות על SGal-צלחות דומות לזה של קבוצת הביקורת. בטל זנים חיוביים שקריים שאינם רעילים כמו הפקדים. 5-פואה היא גם לעתים קרובות רעילה בפני עצמו, כל כך להשליך זנים כי תערוכת פגם צמיחה בSD-צלחות או שהם מציגים רעילות משמעותית יותר מאשר מצע המחלה לבד ( <strong&gt; איור 3). </li></ol> 5. סידור גרסאות Hsp104 על ידי המושבה PCR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמרים לגרד ~ 10 μl מצלחות SD--האורה ב 3 μl 20 מ&quot;מ NaOH בצינורות רצועת PCR וlyse התאים על ידי ההפשרה הקפאה. מניחים את צינורות הרצועה במקפיא -80 ºC למשך 10 דקות או בחנקן נוזלי, ואז לדגור על 99 ºC בthermocycler למשך 10 דקות. לדלל את הזנים למי כיתה PCR 100 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן PCR תגובות: תבנית PCR 5 μl, 0.5 μl 100 מיקרומטר כל צבע יסוד, 10mm dNTPs 0.5 μl, 0.25 DNA פולימרז μl במאגר PCR, ולעשות עד נפח כולל של 25 μl עם מים כיתה PCR. פריימרים עיצוב כדי להגביר את האזור באופן אקראי בתוספת כ -100 נ&quot;ב בכל קצה. מזער את הגודל של האזור המוגבר כדי להגדיל את הסיכוי של הגברה מוצלחת. להפעיל תכנית PCR סטנדרטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח דגימות על ידי ג&#39;ל אלקטרופורזה agarose כדי לאשר הגברה של מוצר ה- PCR של siz המתאיםדואר. חזור PCR אם אין מוצר קיים. הערה: הכשל בPCR הוא בדרך כלל עקב יותר מדי שמרים בשימוש בשלב 5.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן דגימות לרצפי DNA. הסר פריימרים PCR או על ידי טיהור PCR או באמצעות מגיב ניקוי מוצר ה- PCR כמו exonuclease אני ושרימפס אלקליין phosphatase אנזים (ExoSAP-IT) לבזות DNA חד גדילים. מגיב זה אנזימי מדרדרת פריימרים וdNTPs מאוגדים, המאפשר תפוקה גבוהה יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רצף מוצרי ה- PCR. הקפד לנתח ביסודיות chromatograms רצף למוטציות. מוטציות אפשר לראות כתערובת של שני נוקלאוטידים באתר נתון (איור 4), כמרים לעתים קרובות נמל פלסמידים מרובים. </li></ol>

<ol>
	<li>Johnson, B. S., McCaffery, J. M., Lindquist, S., Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+yeast+TDP-43+proteinopathy+model:+Exploring+the+molecular+determinants+of+TDP-43+aggregation+and+cellular+toxicity.">A yeast TDP-43 proteinopathy model: Exploring the molecular determinants of TDP-43 aggregation and cellular toxicity.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 105 (17), 6439-6444 (2008).</li><li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Determinants+and+Genetic+Modifiers+of+Aggregation+and+Toxicity+for+the+ALS+Disease+Protein+FUS/TLS.">Molecular Determinants and Genetic Modifiers of Aggregation and Toxicity for the ALS Disease Protein FUS/TLS.</a> PLoS Biol. 9 (4), (2011).</li><li>Outeiro, T. F., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+Cells+Provide+Insight+into+Alpha-Synuclein+Biology+and+Pathobiology.">Yeast Cells Provide Insight into Alpha-Synuclein Biology and Pathobiology.</a> Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003).</li><li>Forman, M. S., Trojanowski, J. Q., Lee, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurodegenerative+diseases:+a+decade+of+discoveries+paves+the+way+for+therapeutic+breakthroughs.">Neurodegenerative diseases: a decade of discoveries paves the way for therapeutic breakthroughs.</a> Nat Med. 10 (10), 1055-1063 (2004).</li><li>Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress,+aging,+and+neurodegenerative+disease.">Stress, aging, and neurodegenerative disease.</a> N Engl J Med. 355 (21), 2254-2255 (2006).</li><li>Elden, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ataxin-2+intermediate-length+polyglutamine+expansions+are+associated+with+increased+risk+for+ALS.">Ataxin-2 intermediate-length polyglutamine expansions are associated with increased risk for ALS.</a> Nature. 466 (7310), 1069-1075 (2010).</li><li>Cooper, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-synuclein+blocks+ER-Golgi+traffic+and+Rab1+rescues+neuron+loss+in+Parkinson's+models.">Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson's models.</a> Science. 313 (5785), 324-328 (2006).</li><li>Gitler, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-synuclein+is+part+of+a+diverse+and+highly+conserved+interaction+network+that+includes+PARK9+and+manganese+toxicity.">Alpha-synuclein is part of a diverse and highly conserved interaction network that includes PARK9 and manganese toxicity.</a> Nature genetics. 41 (3), 308-315 (2009).</li><li>Su, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compounds+from+an+unbiased+chemical+screen+reverse+both+ER-to-Golgi+trafficking+defects+and+mitochondrial+dysfunction+in+Parkinson's+disease+models.">Compounds from an unbiased chemical screen reverse both ER-to-Golgi trafficking defects and mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease models.</a> Disease models &amp; mechanisms. (3-4), 194-208 (2010).</li><li>Tardiff, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+reveal+a+'druggable'+Rsp5/Nedd4+network+that+ameliorates+alpha-synuclein+toxicity+in+neurons.">Yeast reveal a 'druggable' Rsp5/Nedd4 network that ameliorates alpha-synuclein toxicity in neurons.</a> Science. 342 (6161), 979-983 (2013).</li><li>Tardiff, D. F., Tucci, M. L., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+8-hydroxyquinolines+protect+models+of+TDP-43+protein,+alpha-synuclein,+and+polyglutamine+proteotoxicity+through+distinct+mechanisms.">Different 8-hydroxyquinolines protect models of TDP-43 protein, alpha-synuclein, and polyglutamine proteotoxicity through distinct mechanisms.</a> The Journal of biological chemistry. 287 (6), 4107-4120 (2012).</li><li>Kim, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+modulation+of+eIF2alpha+phosphorylation+rescues+TDP-43+toxicity+in+amyotrophic+lateral+sclerosis+disease+models.">Therapeutic modulation of eIF2alpha phosphorylation rescues TDP-43 toxicity in amyotrophic lateral sclerosis disease models.</a> Nature. 46 (2), 152-160 (2014).</li><li>Ju, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+yeast+model+of+FUS/TLS-dependent+cytotoxicity.">A yeast model of FUS/TLS-dependent cytotoxicity.</a> PLoS Biol. 9 (4), (2011).</li><li>Shorter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp104:+a+weapon+to+combat+diverse+neurodegenerative+disorders.">Hsp104: a weapon to combat diverse neurodegenerative disorders.</a> Neurosignals. 16 (1), 63-74 (2008).</li><li>Vashist, S., Cushman, M., Shorter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applying+Hsp104+to+protein-misfolding+disorders.">Applying Hsp104 to protein-misfolding disorders.</a> Biochem Cell Biol. 88 (1), 1-13 (2010).</li><li>DeSantis, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Operational+Plasticity+Enables+Hsp104+to+Disaggregate+Diverse+Amyloid+and+Nonamyloid+Clients.">Operational Plasticity Enables Hsp104 to Disaggregate Diverse Amyloid and Nonamyloid Clients.</a> Cell. 151 (4), 778-793 (2012).</li><li>Jackrel, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potentiated+Hsp104+Variants+Antagonize+Diverse+Proteotoxic+Misfolding+Events.">Potentiated Hsp104 Variants Antagonize Diverse Proteotoxic Misfolding Events.</a> Cell. 156 (1-2), 170-182 (2014).</li><li>Wittrup, K. D., Verdine, G. L., Wittrup, K. D., Verdine, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. 503, 13-14 (2012).</li><li>Boeke, J. D., Trueheart, J., Natsoulis, G., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. 154, 164-175 (1987).</li><li>Miyazaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creating+Random+Mutagenesis+Libraries+by+Megaprimer+PCR+of+Whole+Plasmid+(MEGAWHOP).+Directed+Evolution+Library+Creation:+Methods+in+Molecular+Biology.">Creating Random Mutagenesis Libraries by Megaprimer PCR of Whole Plasmid (MEGAWHOP). Directed Evolution Library Creation: Methods in Molecular Biology.</a> eds FrancesH Arnold &amp; George Georgiou. 231, 23-28 (2003).</li><li>Saibil, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaperone+machines+for+protein+folding,+unfolding+and+disaggregation.">Chaperone machines for protein folding, unfolding and disaggregation.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (10), 630-642 (2013).</li><li>Gietz, R. D., Schiestl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+yeast+transformation+using+the+LiAc/SS+carrier+DNA/PEG+method.">High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method.</a> Nat. Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).</li><li>Armakola, M., Hart, M. P., Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TDP-43+toxicity+in+yeast.">TDP-43 toxicity in yeast.</a> Methods. 53 (3), 238-245 (2011).</li><li>Alberti, S., Gitler, A. D., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+suite+of+Gateway&#174;+cloning+vectors+for+high-throughput+genetic+analysis+in+Saccharomyces+cerevisiae.">A suite of Gateway&#174; cloning vectors for high-throughput genetic analysis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 24 (10), 913-919 (2007).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

כאן אנו מציגים את הגישה שלנו לבידוד גרסאות Hsp104 potentiated המדכאות את הרעילות של מצעים הקשורים למחלות באמצעות מודלים השמרים proteinopathy. שימוש בגישה זו, ספריות גדולות של גרסאות יכולות להיות מוקרנת בתפוקה גבוהה, עם המגבלה היחידה להיות מספר הגרסאות שעוברות מסך המשני 5-פואה. על י?...

המודלים proteinopathy השמרים פותחו לטיפול בהפרעות misfolding חלבון כוללים מחלת ניוון (ALS) ופרקינסון (PD) 1-3. ביטוי של החלבונים TDP-43 וFUS, שmisfold בחולי ALS, הם רעיל וmislocalize כדי ליצור אגרגטים cytoplasmic בשמרים 1,2. בדומה לכך, הביטוי של α-סינוקלאין (α-SYN), אשר היה מעורב בPD, הוא רעיל וmislocalizes כדי ליצור אגרגטים cytoplasmic בשמרים 3. תכונות אלה לשחזר פנוטיפים בחולים עם הפרעות אלה 4,5. כך, שמרי מודלים לספק פלטפורמה שימושית עבור בדיקות סקר לאיתור חלבונים או מולקולות קטנות המונעים או הפוך פנוטיפים אלה 2,6-13. אנו מעוניינים בפיתוח של חלבונים המסוגלים היפוך צבירה ורעילות בשל TDP-43, FUS, וα-syn. אנו מתמקדים בHsp104, AAA + חלבון משמרים כי הוא מסוגל ריסוק חלבונים ייחודי הן frאגרגטים אום אמורפי ועמילואיד בשמרים, אך אין לה homologue אדם 14,15. Hsp104 רגיש ועדין לdisaggregate פריונים שמרי אנדוגני ויש לו רק יכולת מוגבלת disaggregate מצעים המעורבים במחלות ניווניות אנושיות, שזה אף פעם לא נתקל בדרך 16,17. כך, אנו שואפים להנדס גרסאות משופרות של Hsp104 כי הם מסוגלים disaggregate efficaciously מצעים האנושיים אלה. לשם כך, אנו בונים ספריות גדולות של Hsp104 גרסאות באמצעות PCR ומועד לשגיאות; יכולות להיות מוקרנת ספריות אלה באמצעות המודלים השמרים proteinopathy 17. אנחנו אימצנו גישה ממוקדת-תחום לבניית וסינון ספריות, כHsp104 הוא גדול מאוד 17. אנחנו בתחילה התמקדנו בתחום ביניים (MD) של Hsp104 17, אם כי יכולים להיות מועסקות גישות דומות לדומיינים אחרים. מודלים אלה מאפשרים בדיקות סקר לאיתור פעילות Disaggregase ישירות, בניגוד לטכניקות חלופיות כגון תצוגה לפני שטח, ושארricted להשתמש לניטור מחייב 18. הפרוטוקול שלנו מבוסס על שני שלבי סינון (איור 1). ראשית, גרסאות Hsp104 המדכאות את הרעילות של מצע המחלה בשמרים נבחרות. לשם כך, Hsp104 גרסאות ו- קשור מחלה מצעם cotransformed לשמרי Hsp104 Δ. אנו מעסיקים שמרי Hsp104 Δ ללחקור את חלל רצף Hsp104 בהעדר wild-type (WT) Hsp104 17. חשוב לציין, מחיקה של Hsp104 אינה משפיעה על α-syn, FUS, או TDP-43 רעילות בשמרים, וביטוי של Hsp104 WT מספק הצלה מינימאלית 1,13,17. השמרים אז מצופים על גרימת תקשורת כדי לגרום לביטוי של שני החלבונים. שמרים מחסה גרסאות Hsp104 המדכאות רעילות של הצמיחה מקנה המצע הקשורים למחלות של המושבה. גרסאות אלו נבחרו לניתוח נוסף, בעוד שמושבות שמירת גרסאות שאינו לדכא למות רעילות. עם זאת,תוצאות חיוביות שגויות הן בעיה משמעותית במסך זה. הביטוי של TDP-43, FUS, וα-syn הוא רעיל ביותר, אשר יוצר לחץ סלקטיבי חזק להופעתו של מדכאי גנטיים ספונטניים של רעילות שאינה קשורה לגרסת Hsp104 לידי ביטוי. כך, יש לנו להשתמש במסך משני שהוא גם גבוהה יחסית תפוקה לחסל מדכאי רעילות ספציפיים אלה 17. במסך המשני זו, מטופלים שמרים נבחרים עם 5-Fluorootic חומצה (5-פואה) כדי להתמודד בחר לפלסמיד Hsp104 19. אז הזנים נבחנים לגבי מצע רעילות (TDP-43, FUS, או α-SYN) באמצעות איתור assay כדי להבטיח שהרעילות של המצע משוחזרת לאחר אובדן פלסמיד Hsp104. כך, שמרים שברעילות משוחזרת במסך משני זה כנראה שבעבר הוצגו דיכוי רעילות בשל נוכחותם של גרסת Hsp104. השמרים הללו מיועדים &#39;להיטים&#39; ופלסמיד Hsp104 צריך להיות אזהתאושש ורצף לזהות מוטציות בגן Hsp104 17 (איור 1). כל להיטים אז צריכים להיות אושר על ידי בניית המוטציה באופן עצמאי באמצעות מוטגנזה מכוונת ולאחר מכן בדיקה חוזרת לדיכוי רעילות. היישומים האפשריים עבור פרוטוקול זה הם רחבים. שימוש בשיטות אלה, ספריות מכל סוג של חלבון יכולות להיות מוקרנת לגרסות המדכאות רעילות של כל חלבון מצע כי הוא רעיל בשמרים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="766">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:320px;">Table of Specific Materials/Equipment</td>
			<td style="width:227px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:87px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GeneMorphII EZClone Domain Mutagenesis Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>200552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">150mm Petri dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5-Fluorootic Acid</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>f10501-5.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96-DeepWell 2mL Plates</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 502.302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96 bold replicator tool</td>
			<td>V&#38;P Scientific</td>
			<td>vp-404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ExoSAP-IT</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>78200</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolating potentiated hsp104 variants using yeast proteinopathy models

Many protein-misfolding disorders can be modeled in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Proteins such as TDP-43 and FUS, implicated in amyotrophic lateral sclerosis, and &#945;-synuclein, implicated in Parkinson&#8217;s disease, are toxic and form cytoplasmic aggregates in yeast. These features recapitulate protein pathologies observed in patients with these disorders. Thus, yeast are an ideal platform for isolating toxicity suppressors from libraries of protein variants. We are interested in applying protein disaggregases to eliminate misfolded toxic protein conformers. Specifically, we are engineering Hsp104, a hexameric AAA+ protein from yeast that is uniquely capable of solubilizing both disordered aggregates and amyloid and returning the proteins to their native conformations. While Hsp104 is highly conserved in eukaryotes and eubacteria, it has no known metazoan homologue. Hsp104 has only limited ability to eliminate disordered aggregates and amyloid fibers implicated in human disease. Thus, we aim to engineer Hsp104 variants to reverse the protein misfolding implicated in neurodegenerative disorders. We have developed methods to screen large libraries of Hsp104 variants for suppression of proteotoxicity in yeast. As yeast are prone to spontaneous nonspecific suppression of toxicity, a two-step screening process has been developed to eliminate false positives. Using these methods, we have identified a series of potentiated Hsp104 variants that potently suppress the toxicity and aggregation of TDP-43, FUS, and &#945;-synuclein. Here, we describe this optimized protocol, which could be adapted to screen libraries constructed using any protein backbone for suppression of toxicity of any protein that is toxic in yeast.

בנינו ספרייה של גרסאות Hsp104 אקראיות בתחום האמצע והקרנו אותו לדיכוי TDP-43 רעילות. הספרייה הפכה ומצופית על גלוקוז וגלקטוז צלחות (איור 2) על מנת להעריך את החומרה של המסך. מושבות אחת נבחרו והזנים נבחרו דלפק באמצעות 5-פואה לחסל את הפלסמיד Hsp104. זנים אלה ולאחר מכן נבדקו ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolating Potentiated Hsp104 Variants Using Yeast Proteinopathy Models at JoVE.com

Isolating Potentiated Hsp104 Variants Using Yeast Proteinopathy Models

Yeast proteinopathy models are valuable tools to assess the toxicity and aggregation of proteins implicated in disease. Here, we present methods for screening Hsp104 variant libraries for toxicity suppressors. This protocol could be adapted to screen any protein library for toxicity suppressors of any protein that is toxic in yeast.

בידוד דוגמניות Proteinopathy שמרי שימוש potentiated Hsp104 גרסאות

Many protein-misfolding disorders can be modeled in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Proteins such as TDP-43 and FUS, implicated in amyotrophic ...

isolating-potentiated-hsp104-variants-using-yeast-proteinopathy-models

Research

JoVE Journal

Biology

8.1K Views.  Perelman School of Medicine at the University of Pennsylvania. Yeast proteinopathy models are valuable tools to assess the toxicity and aggregation of proteins implicated in disease. Here, we present methods for screening Hsp104 variant libraries for toxicity suppressors. This protocol could be adapted to screen any protein library for toxicity suppressors of any protein that is toxic in yeast.

Video: Isolating Potentiated Hsp104 Variants Using Yeast Proteinopathy Models

A Quantitative Assessment of The Yeast Lipidome using Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Lipids are one of the major classes of biomolecules and play important roles membrane dynamics, energy storage, and signalling1-4. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae, a genetically and biochemically manipulable unicellular eukaryote with annotated genome and very simple lipidome, is a valuable model for studying biological functions of various lipid species in multicellular eukaryotes2,3,5. S. cerevisiae has 10 major classes of lipids with chain lengths mainly of 16 or 18 carbon atoms and either zero or one degree of unsaturation6,7. Existing methods for lipid identification and quantification - such as high performance liquid chromatography, thin-layer chromatography, fluorescence microscopy, and gas chromatography followed by MS - are well established but have low sensitivity, insufficiently separate various molecular forms of lipids, require lipid derivitization prior to analysis, or can be quite time consuming. Here we present a detailed description of our experimental approach to solve these inherent limitations by using survey-scan ESI/MS for the identification and quantification of the entire complement of lipids in yeast cells. The described method does not require chromatographic separation of complex lipid mixtures recovered from yeast cells, thereby greatly accelerating the process of data acquisition. This method enables lipid identification and quantification at the concentrations as low as g/ml and has been successfully applied to assessing lipidomes of whole yeast cells and their purified organelles. Lipids extraction from whole yeast cells for using this method of lipid analysis takes two to three hours. It takes only five to ten minutes to run each sample of extracted and dried lipids on a Q-TOF mass spectrometer equipped with a nano-electrospray source.

We describe a new quantitative lipidomics method for identifying numerous lipid species in yeast using survey-scan electrospray ionization mass spectrometry (ESI/MS). This method exceeds currently available methods for lipid identification and quantification in the ability to resolve various molecular forms of lipids, sensitivity, and speed.

הערכה כמותית של Lipidome שמרים באמצעות Ionization electrospray ספקטרומטריית מסה

Lipids are one of the major classes of biomolecules and play important roles membrane dynamics, energy storage, and signalling1-4. The budding yeast ...

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers. Genetic studies in mammalian systems have been limited due to the lack of readily available tools including defined mutant genetic cell lines, regulatory expression systems, and appropriate selectable markers. To circumvent these difficulties, model genetic systems in lower eukaryotes have become an attractive choice for the study of functionally conserved DNA repair proteins and pathways. We have developed a model yeast system to study the poorly defined genetic functions of the Werner syndrome helicase-nuclease (WRN) in nucleic acid metabolism. Cellular phenotypes associated with defined genetic mutant backgrounds can be investigated to clarify the cellular and molecular functions of WRN through its catalytic activities and protein interactions. The human WRN gene and associated variants, cloned into DNA plasmids for expression in yeast, can be placed under the control of a regulatory plasmid element. The expression construct can then be transformed into the appropriate yeast mutant background, and genetic function assayed by a variety of methodologies. Using this approach, we determined that WRN, like its related RecQ family members BLM and Sgs1, operates in a Top3-dependent pathway that is likely to be important for genomic stability. This is described in our recent publication [1] at <a href="http://www.impactaging.com">www.impactaging.com</a>. Detailed methods of specific assays for genetic complementation studies in yeast are provided in this paper.

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System

Genetic studies in yeast can be employed to investigate the molecular and cellular functions of human genes in cellular DNA metabolism. Methods are described for the genetic characterization of the human WRN gene product defective in the premature aging disorder Werner syndrome in functionally conserved pathways using yeast as a tractable model system.

מחקרים גנטיים של חלבונים תיקון דנ&quot;א אנושי באמצעות שמרים כמודל למערכת

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

Yeast Colony Embedding Method

Patterning of different cell types in embryos is a key mechanism in metazoan development. Communities of microorganisms, such as colonies and biofilms also display patterns of cell types. For example, in the yeast S. cerevisiae, sporulated cells and pseudohyphal cells are not uniformly distributed in colonies. The functional importance of patterning and the molecular mechanisms that underlie these patterns are still poorly understood.
One challenge with respect to investigating patterns of cell types in fungal colonies is that unlike metazoan tissue, cells in colonies are relatively weakly attached to one another. In particular, fungal colonies do not contain the same extensive level of extracellular matrix found in most tissues . Here we report on a method for embedding and sectioning yeast colonies that reveals the interior patterns of cell types in these colonies. The method can be used to prepare thick sections (0.5 &mu;) useful for light microscopy and thin sections (0.1 &mu;) suitable for transmission electron microscopy. Asci and pseudohyphal cells can easily be distinguished from ovoid yeast cells by light microscopy , while the interior structure of these cells can be visualized by EM.
The method is based on surrounding colonies with agar, infiltrating them with Spurr's medium, and then sectioning. Colonies with a diameter in the range of 1-2 mm are suitable for this protocol. In addition to visualizing the interior of colonies, the method allows visualization of the region of the colony that invades the underlying agar.

A method for embedding yeast colonies allowing sectioning for light and electron microscopy. This protocol allows determination of the distribution of sporulated cells and pseudohyphal cells within colonies providing a new tool toward understanding the organization of cell types within a fungal community.

במושבה שמרים והטבעה שיטה

Patterning of  different cell types in embryos is a key mechanism in metazoan development. Communities of microorganisms, such as colonies and biofilms ...

Principles of Rodent Surgery for the New Surgeon

For both scientific and animal welfare reasons, training in basic surgical concepts and techniques should be undertaken before ever seeking to perform surgery on a rodent. Students, post-doctoral scholars, and others interested in performing surgery on rodents as part of a research protocol may not have had formal surgical training as part of their required coursework. Surgery itself is a technical skill, and one that will improve with practice. The principles of aseptic technique, however, often remain unexplained or untaught. For most new surgeons, this vital information is presented in piecemeal fashion or learned on the job, neither of which is ideal. It may also make learning how to perform a particular surgery difficult, as the new surgeon is learning both a surgical technique and the principles of asepsis at the same time. This article summarizes and makes recommendations for basic surgical skills and techniques necessary for successful rodent surgery. This article is designed to supplement hands-on training by the user's institution.

Before attempting surgery, a new surgeon should have training in basic surgical techniques and concepts. This article will present basic surgical considerations with an emphasis on rodents.

עקרונות של ניתוח מכרסמים למנתח חדש

For both scientific and animal welfare reasons, training in basic surgical concepts and techniques should be undertaken before ever seeking to perform ...

Manual Restraint and Common Compound Administration Routes in Mice and Rats

Being able to safely and effectively restrain mice and rats is an important part of conducting research. Working confidently and humanely with mice and rats requires a basic competency in handling and restraint methods. This article will present the basic principles required to safely handle animals. One-handed, two-handed, and restraint with specially designed restraint objects will be illustrated. Often, another part of the research or testing use of animals is the effective administration of compounds to mice and rats. Although there are a large number of possible administration routes (limited only by the size and organs of the animal), most are not used regularly in research. This video will illustrate several of the more common routes, including intravenous, intramuscular, subcutaneous, and oral gavage. The goal of this article is to expose a viewer unfamiliar with these techniques to basic restraint and substance administration routes. This video does not replace required hands-on training at your facility, but is meant to augment and supplement that training.

Working safely and humanely with research rodents requires a core competency in handling and restraint methods. This article will present the basic principles required to safely handle and effectively administer compounds to mice and rats.

איפוק ידני ומסלולי מנהל מתחם נפוצים בעכברים וחולדות

Being able to safely and effectively restrain mice and rats is an important part of conducting research.  Working confidently and humanely with mice and ...

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, including those with direct relevance to human disease. Because of its short generation time and well-characterized genome, a major experimental advantage of the yeast model system is the ability to perform genetic screens to identify genes and pathways that are involved in a given process. Over the last thirty years such genetic screens have been used to elucidate the cell cycle, secretory pathway, and many more highly conserved aspects of eukaryotic cell biology 1-5. In the last few years, several genomewide libraries of yeast strains and plasmids have been generated 6-10. These collections now allow for the systematic interrogation of gene function using gain- and loss-of-function approaches 11-16. Here we provide a detailed protocol for the use of a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot to perform a plasmid overexpression screen, using an arrayed library of 5,500 yeast plasmids. We have been using these screens to identify genetic modifiers of toxicity associated with the accumulation of aggregation-prone human neurodegenerative disease proteins. The methods presented here are readily adaptable to the study of other cellular phenotypes of interest.

Here we describe a plasmid overexpression screen in Saccharomyces cerevisiae, using an arrayed plasmid library and a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot.

תפוקה גבוהה Overexpression פלסמיד שמרים מסך

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

Purification of Hsp104, a Protein Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key selective advantages. First, renaturation of disordered aggregates by Hsp104 empowers yeast survival after various protein-misfolding stresses, including heat shock3,5,11,12. Second, remodeling of cross-beta amyloid fibrils by Hsp104 enables yeast to exploit myriad prions (infectious amyloids) as a reservoir of beneficial and heritable phenotypic variation13-22. Remarkably, Hsp104 directly remodels preamyloid oligomers and amyloid fibrils, including those comprised of the yeast prion proteins Sup35 and Ure223-30. This amyloid-remodeling functionality is a specialized facet of yeast Hsp104. The E. coli orthologue, ClpB, fails to remodel preamyloid oligomers or amyloid fibrils26,31,32.
Hsp104 orthologues are found in all kingdoms of life except, perplexingly, animals. Indeed, whether animal cells possess any enzymatic system that couples protein disaggregation to renaturation (rather than degradation) remains unknown33-35. Thus, we and others have proposed that Hsp104 might be developed as a therapeutic agent for various neurodegenerative diseases connected with the misfolding of specific proteins into toxic preamyloid oligomers and amyloid fibrils4,7,23,36-38. There are no treatments that directly target the aggregated species associated with these diseases. Yet, Hsp104 dissolves toxic oligomers and amyloid fibrils composed of alpha-synuclein, which are connected with Parkinson's Disease23 as well as amyloid forms of PrP39. Importantly, Hsp104 reduces protein aggregation and ameliorates neurodegeneration in rodent models of Parkinson's Disease23 and Huntington's disease38. Ideally, to optimize therapy and minimize side effects, Hsp104 would be engineered and potentiated to selectively remodel specific aggregates central to the disease in question4,7. However, the limited structural and mechanistic understanding of how Hsp104 disaggregates such a diverse repertoire of aggregated structures and unrelated proteins frustrates these endeavors30,40-42.
To understand the structure and mechanism of Hsp104, it is essential to study the pure protein and reconstitute its disaggregase activity with minimal components. Hsp104 is a 102kDa protein with a pI of ~5.3, which hexamerizes in the presence of ADP or ATP, or at high protein concentrations in the absence of nucleotide43-46. Here, we describe an optimized protocol for the purification of highly active, stable Hsp104 from E. coli. The use of E. coli allows simplified large-scale production and our method can be performed quickly and reliably for numerous Hsp104 variants. Our protocol increases Hsp104 purity and simplifies His6-tag removal compared to a previous purification method from E. coli47. Moreover, our protocol is more facile and convenient than two more recent protocols26,48.

Here, we describe a protocol for the purification of highly active Hsp104, a hexameric AAA+ protein from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation. This scheme exploits a His6-tagged construct for affinity purification from E. coli followed by anion-exchange chromatography, His6-tag removal with TEV protease, and size-exclusion chromatography.

טיהור Hsp104, Disaggregase חלבון

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key ...

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies. Many of these valuable animals exist only as live animals, with no backup plan in case of emergency. Cryopreservation of embryos can provide this backup, but is costly, can be a lengthy procedure, and generally requires a large number of animals for success. Since the discovery that mouse sperm can be successfully cryopreserved with a basic cryoprotective agent (CPA) consisting of 18&#37; raffinose and 3&#37; skim milk, sperm cryopreservation has become an acceptable and cost-effective procedure for archiving, distributing and recovery of these valuable strains.
 Here we demonstrate a newly developed I&bull;Cryo kit for mouse sperm cryopreservation. Sperm from five commonly-used strains of inbred mice were frozen using this kit and then recovered. Higher protection ratios of sperm motility (&gt; 60&#37;) and rapid progressive motility (&gt; 45&#37;) compared to the control (basic CPA) were seen for sperm frozen with this kit in 5 inbred mouse strains. Two cell stage embryo development after IVF with the recovered sperm was improved consistently in all 5 mouse strains examined. Over a 1.5 year period, 49 GM mouse lines were archived by sperm cryopreservation with the I&bull;Cryo kit and later recovered by IVF.

Here we demonstrate the newly developed I&#x2022;Cryo kit for mouse sperm cryopreservation. Two-cell stage embryo development with frozen-thawed sperm was improved consistently in 5 mouse strains with the use of this kit. Over a 1.5 year period, 49 genetically modified mouse lines were archived by sperm cryopreservation with the I&#x2022;Cryo kit and later successfully recovered by IVF.

הזרע עכבר cryopreservation ושחזור באמצעות · אני cryo Kit

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies.  Many of these ...

Detection of Rare Genomic Variants from Pooled Sequencing Using SPLINTER

As DNA sequencing technology has markedly advanced in recent years2, it has become increasingly evident that the amount of genetic variation between any two individuals is greater than previously thought3. In contrast, array-based genotyping has failed to identify a significant contribution of common sequence variants to the phenotypic variability of common disease4,5. Taken together, these observations have led to the evolution of the Common Disease / Rare Variant hypothesis suggesting that the majority of the "missing heritability" in common and complex phenotypes is instead due to an individual's personal profile of rare or private DNA variants6-8. However, characterizing how rare variation impacts complex phenotypes requires the analysis of many affected individuals at many genomic loci, and is ideally compared to a similar survey in an unaffected cohort. Despite the sequencing power offered by today's platforms, a population-based survey of many genomic loci and the subsequent computational analysis required remains prohibitive for many investigators.
To address this need, we have developed a pooled sequencing approach1,9 and a novel software package1 for highly accurate rare variant detection from the resulting data. The ability to pool genomes from entire populations of affected individuals and survey the degree of genetic variation at multiple targeted regions in a single sequencing library provides excellent cost and time savings to traditional single-sample sequencing methodology. With a mean sequencing coverage per allele of 25-fold, our custom algorithm, SPLINTER, uses an internal variant calling control strategy to call insertions, deletions and substitutions up to four base pairs in length with high sensitivity and specificity from pools of up to 1 mutant allele in 500 individuals. Here we describe the method for preparing the pooled sequencing library followed by step-by-step instructions on how to use the SPLINTER package for pooled sequencing analysis (<a href="http://www.ibridgenetwork.org/wustl/splinter" target="_blank">http://www.ibridgenetwork.org/wustl/splinter</a>). We show a comparison between pooled sequencing of 947 individuals, all of whom also underwent genome-wide array, at over 20kb of sequencing per person. Concordance between genotyping of tagged and novel variants called in the pooled sample were excellent. This method can be easily scaled up to any number of genomic loci and any number of individuals. By incorporating the internal positive and negative amplicon controls at ratios that mimic the population under study, the algorithm can be calibrated for optimal performance. This strategy can also be modified for use with hybridization capture or individual-specific barcodes and can be applied to the sequencing of naturally heterogeneous samples, such as tumor DNA.

Pooled DNA sequencing is a fast and cost-effective strategy to detect rare variants associated with complex phenotypes in large cohorts. Here we describe the computational analysis of pooled, next-generation sequencing of 32 cancer-related genes using the SPLINTER software package. This method is scalable, and applicable to any phenotype of interest.

זיהוי גנטי של וריאנטים נדירים מן הרצף נקווה שימוש Splinter

As DNA sequencing technology has markedly advanced in recent years2, it has become increasingly evident that the amount of genetic variation between any ...

Screening for Functional Non-coding Genetic Variants Using Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) and DNA-affinity Precipitation Assay (DAPA)

Population and family-based genetic studies typically result in the identification of genetic variants that are statistically associated with a clinical disease or phenotype. For many diseases and traits, most variants are non-coding, and are thus likely to act by impacting subtle, comparatively hard to predict mechanisms controlling gene expression. Here, we describe a general strategic approach to prioritize non-coding variants, and screen them for their function. This approach involves computational prioritization using functional genomic databases followed by experimental analysis of differential binding of transcription factors (TFs) to risk and non-risk alleles. For both electrophoretic mobility shift assay (EMSA) and DNA affinity precipitation assay (DAPA) analysis of genetic variants, a synthetic DNA oligonucleotide (oligo) is used to identify factors in the nuclear lysate of disease or phenotype-relevant cells. For EMSA, the oligonucleotides with or without bound nuclear factors (often TFs) are analyzed by non-denaturing electrophoresis on a tris-borate-EDTA (TBE) polyacrylamide gel. For DAPA, the oligonucleotides are bound to a magnetic column and the nuclear factors that specifically bind the DNA sequence are eluted and analyzed through mass spectrometry or with a reducing sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) followed by Western blot analysis. This general approach can be widely used to study the function of non-coding genetic variants associated with any disease, trait, or phenotype.

Screening for Functional Non-coding Genetic Variants Using Electrophoretic Mobility Shift Assay EMSA and DNA-affinity Precipitation Assay DAPA

We present a strategic plan and protocol for identifying non-coding genetic variants affecting transcription factor (TF) DNA binding. A detailed experimental protocol is provided for electrophoretic mobility shift assay (EMSA) and DNA affinity precipitation assay (DAPA) analysis of genotype-dependent TF DNA binding.

הקרנה עבור וריאנטים גנטיים ללא קידוד תפקודיים באמצעות ניידות Electrophoretic Shift Assay (Emsa) ו Assay משקע זיקת DNA (DAPA)

Population and family-based genetic studies typically result in the identification of genetic variants that are statistically associated with a clinical ...