هذا البروتوكول يسمح لنا لاستكشاف بسهولة السمات اللاجينية للمرض العصبي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هو أنه يستغل الخميرة كنظام نموذجي، بالمقارنة مع النماذج الخلوية والحيوانية الأخرى من الأمراض العصبية، الخميرة هو مناسب وفعالة من حيث التكلفة. هذه التقنية تسمح لنا لرسم خريطة للتغيرات اللاجينية التي تنشأ في الأمراض العصبية، والتي قد تؤدي إلى علامات جديدة للتشخيص، فضلا عن أهداف جديدة للعلاج.
تسمح هذه الطريقة بمزيد من البحث في دور العلامات اللاجينية في الأمراض العصبية التنكسية ويمكن تعديلها لتقييم الخلايا الليفية البشرية والخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات. هذه الطريقة بالذات تحتوي على عدد من التفاصيل التي تحتاج إلى أن تكون مرئية، مثل التحميل السليم من جهاز لطخة الغربية. سيكون من بين الفحوصات إجراء هذا الإجراء ميشيل فاله ونافران رنا، وكلاهما باحثان في مختبر تورنت.
تبدأ من خميرة restreaking من الأسهم الجلسرين المجمدة على الهستيدين 2٪ الجلوكوز agar لوحات متوسطة انتقائية, لحضانة يومين إلى ثلاثة أيام في 30 درجة مئوية. في نهاية الحضانة، تلقيح خميرة ريستيد لكل أكثر من نموذج التعبير والسيطرة في خمسة ملليلترات من الهستيدين الوسيط السائل انتقائية. تكمل مع 2٪ رافينوز في 30 درجة مئوية و 200 التناوب في الدقيقة الواحدة، بين عشية وضحاها.
في صباح اليوم التالي، تنمو 100 ملليلتر من الثقافة السائلة لكل من نماذج فرط التعبير والضوابط في وسائل انتقائية تكمل مع 2٪ galactose بين عشية وضحاها. وقياس الكثافة البصرية في 600 نانومتر أو OD600 لتحديد حجم ثقافة بين عشية وضحاها اللازمة لتقديم أكثر من ثقافات التعبير في بدء OD600 من 0.3. للحث على فرط التعبير عن البروتين ، تنمو الخميرة على وسط galactose مع اهتزاز في 30 درجة مئوية لفترة زمنية تجريبية مناسبة.
ثم قياس OD600 من كل ثقافة في نهاية فترة التعريفي. وتوحيد جميع من التهم الخلية إلى أدنى قيمة OD600. حصاد الثقافات في أنابيب أجهزة الطرد المركزي 50 ملليلتر عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق الكريات في ملليلتر واحد من المياه المعقمة لا تزال ثابتة لكل 10 ملليلتر من الثقافة نمت.
Aliquot ملليلتر واحد من إعادة دمج الخلية في أنابيب الطرد الدقيق الفردية للطرد المركزي الإضافي والتعرق للماكرين. ثم المفاجئة تجميد الكريات الخلية في النيتروجين السائل لتخزين في ناقص 80 درجة مئوية. لتحلل الخلايا لتحليل البقعة الغربية ، ذوبان كريات خلايا الخميرة على الجليد قبل إعادة النيادس في 100 ميكرولترات من الماء المقطر.
إضافة 300 ميكرولترات من هيدروكسيد الصوديوم 0.2-المولار و 20 ميكرولترات من 2-Mercaptoethanol لكل عينة الخلية. وإعادة تعليق الكريات عن طريق الأنابيب. بعد 10 دقيقة حضانة على الجليد، بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق العينات في 100 ميكرولترات من صبغة التحميل.
ثم تغلي العينات لمدة 10 دقائق على كتلة التدفئة. في حين يجري عينات lysed، وضع اثنين من المواد الهلامية في حامل هلام وملء الغرفة الداخلية إلى الأعلى مع تشغيل العازلة وغرفة خارج لعلامة خط هلام اثنين. عندما عينات جاهزة، تحميل 15 ميكرولترات لكل من، حل تحلل الخلية، في كل بئر من 10 جيدا، 12٪ هلام بولياكريلاميد وإضافة خمسة ميكرولترات من سلم البروتين إلى مسار سلم البروتين جيدا.
تشغيل هلام لمدة 45 دقيقة تقريبا في 150 فولت أو حتى تحميل صبغة الجبهة تصل إلى الجزء السفلي من هلام. في حين أن هلام هو تشغيل، نقع اثنين من منصات الألياف لكل هلام في نقل العازلة وفلوريد واحد بوليفينيدين، أو PVDF، غشاء لكل هلام في الميثانول. عندما يكون الجل جاهزًا ، شطف الغشاء في مخزن النقل المؤقت ووضع وسادة ألياف واحدة مسبقة على الجزء السفلي من خلية جهاز نقل شبه جافة.
تليها غشاء PVDF، والهلام وسادة الألياف المُسبقة الثانية. ثم تعيين السلطة إلى 150 مللي امبير لمدة ساعة واحدة. في نهاية نقل البروتين، وإزالة الغشاء من جهاز نقل لشطف قصيرة مع الماء المقطر.
وضع الغشاء المشطف، الجانب البروتين حتى في مربع تلطيخ صغيرة وتغطية الغشاء مع المالحة تريس المخزنة أو TBS، ومنع العازلة لمدة ساعة واحدة حضانة في درجة حرارة الغرفة مع هزاز لطيف. في نهاية الحضانة منع، احتضان الغشاء بين عشية وضحاها مع هيستون مضاد للخميرة ومضادة للتعديل محددة في TBS في أربع درجات مئوية. و جسم مضاد مناسب للتحكم في التحميل النووي
في صباح اليوم التالي، وغسل الغشاء أربع مرات في TBS، تستكمل مع 0.1٪ بوليسوربات 20 لمدة خمس دقائق مع هزاز في درجة حرارة الغرفة في غسل. بعد الغسيل الأخير ، احتضان البقعة مع الأجسام المضادة الثانوية المناسبة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. تليها أربعة، خمس دقائق يغسل في TBST وواحد خمس دقائق غسل في TBS وحدها مع هزاز.
ثم صورة وصمة عار على نظام التخيل لطخة الغربية الفلورسنت لمدة دقيقتين. هنا، يظهر قمع النمو في الثقافات الصلبة والسائلة مع آثار كبيرة على نمو الخميرة لوحظ في وجود galactose غرست في نماذج الساركوما فرط التعبير. انخفاض كبير في مستويات هيستون واضحة في تنصهر في نموذج فرط التعبير الساركوما والزيادات الكبيرة في مستويات الأسيتيل histone في بروتين TAR ملزمة 43 نموذج overexpression, ويلاحظ أن لا ينظر في أي من تنصهر في ساركوما أو ألفا synuclein نموذج فرط التعبير.
وهناك أيضا انخفاض كبير في مستويات هيستون في نموذج overexpression سينوكلين ألفا. في هذه التجربة sucrose ضبط، وانخفاض كمية من galactose المستخدمة للحث على تنصهر في السركوما overexpression، سمية أقل التي لوحظت في كل من الثقافة الصلبة والسائلة. الأهم من ذلك، وانخفاض مستوى تنصهر في السركوما overexpression، أصغر حجم الانخفاض في مستويات هيستون.
أثناء تنفيذ هذا البروتوكول ، لا بد من توحيد كمية الخميرة في كل عينة لتمكين المقارنة السليمة في مستويات التعديل اللاحقة للحجر. 2-يجب استخدام ميركابتوتاينول تحت غطاء محرك السيارة لتجنب الاستنشاق. إذا تم استخدام وصمة بونساو، يجب التخلص منها بشكل صحيح.
