פיזור משופר Nanoplasmon, או nPES, היא חלופה פשוטה ולא פולשנית לביופסיה כירורגית שיכולה לדלג על צעדי טיהור אקסוזום זמן רב ועתירי עבודה, הרחבת היישום של ניתוח אקסוזום להגדרות קליניות. הבדיקה nPES זה הוא הליך מהיר לנתח סמנים ביולוגיים ספציפיים על הממברנה החיצונית של exosomes שאינו דורש צעדי בידוד וטיהור נפרדים. אנחנו צריכים רק דגימה קלינית קטנה מאוד להערכה זו.
לכן, שיטה זו יכולה להרחיב את השימוש ב- nPES לחקר מודלים של עכברים מהונדסים גנטית או PDX. ישנם כמה שלבים בפרוטוקול זה שעשויים להיראות מרתיעים. עם זאת, עם כמה ריצות תרגול, כל מי שיש לו כישורי מעבדה רטובים בסיסיים יכול ללמוד לבצע בהצלחה nPES.
כדי להתחיל את ההליך, לשלב 40 microliters של השעיה של Nanorods זהב פונקציונלי NeutrAvidin עם 200 microliters של קר, pH שבעה פוספט מאגר מלוחים. צנטריפוגה את התערובת ב 8500 פעמים גרם בארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות, ולהסיר את supernatant. חזור על תהליך כביסה זה פעמיים נוספות, ולאחר מכן resuspend nanorods ב 40 microliters של PBS קר.
לאחר מכן, להוסיף 150 microliters של PBS קר ו 10 microliters של פתרון 0.5 מיליגרם למיליליטר של נוגדנים biotinylated המתאים ההשעיה. מערבבים בארבע מעלות צלזיוס במשך שעתיים כדי להשיג ננו-רוד זהב גדוש בנוגדנים. לשטוף את nanorods שלוש פעמים על ידי צנטריפוגה ב 200-microliter חלקים של PBS קר ב 6500 פעמים g בארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות כל אחד.
לאחר מכן, יש להשתמש שוב בננו-רודס הנוגדנים השטופים ב-200 מיקרוליטרים של PBS קר, ולאחסן אותם בארבע מעלות צלזיוס למשך עד 24 שעות. כדי להתחיל להכין את השקופית, לדלל את נוגדני לכידת exosome הרצוי ל 025 מיליגרם למיליליטר ב PBS. פיפטה מיקרוליטר אחד של פתרון זה לתוך כל באר של חלבון A / G מטופלים שקופית מגובה עם זכוכית בדרגה אופטית.
לאחר מכן, להעביר את השקופית לקופסה לחות כדי להבטיח בארות לא להתייבש במהלך הדגירה. דגירה המגלשה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת כדי לשתק את נוגדני לכידה. לאחר מכן, שאף את הפתרון הנותר להסרת נוגדנים לא מאוגדים.
לשטוף את בארות על ידי הוספה ושוגם מיקרוליטר אחד של PBS שלוש פעמים. לאחר מכן, לטעון במהירות כל באר עם microliter אחד של מאגר חסימה מבוסס PBS, ולהדק את השקופית ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים. כאשר רצים סביב 15 דגימות, עלינו להשתמש פיפטה ערוץ יחיד לטעון חוצץ חסימה על 120 בארות בפחות מחמש דקות, כדי למנוע אידוי של סוכן חסימה.
התחל להכין פתרון של ננורודים זהב נדנוגדנים במהלך חסימת שקופיות. כ -30 דקות לפני חסימת גימורים, במהירות להפשיר דגימות פלזמה או סרום באמבט מים בטמפרטורת החדר. מערבולת הדגימות המופשרות למשך 30 שניות כדי להבטיח שהמתלים הומוגניים.
לאחר מכן, צנטריפוגה הדגימות ב 500 פעמים גרם במשך 15 דקות כדי לזרז אגרגטים חלבון ופסולת אחרת. מעבירים 10 מיקרוליטר aliquots של supernatant לצינורות טריים, ולעשות דילול אחד לאחד עם PBS. מערבבים את הדגימות המדוללים על ידי מערבולת עדינה או היפוך לפי הצורך.
לאחר סיום חסימת השקופיות, שאפו את מאגר החסימה ושטפו את בארות שלוש פעמים עם חלקים מיקרוליטריים אחד של PBS. מיד לטעון את הדגימות לתוך בארות עם microliter אחד לכל באר ושמונה שכפולים לכל מדגם. לטעון סטנדרטים exosome לתוך בארות המתאימות באותו אופן.
דגירה המגלשה במשך 12 עד 18 שעות במקרר בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, שאפו את בארות, ולשטוף כל באר פעם אחת עם microliter אחד של PBS. לטעון מיקרוליטר אחד של הנוגדן נדנוד זהב nanorod ההשעיה לתוך כל באר, ו דגירה השקופית ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים.
לאחר מכן, שאפו את ההשעיה ננורוד, ולשטוף את השקופית PBS בתוספת 1%polysorbate 20 במשך 10 דקות באמצעות מערבל. לאחר מכן, שאפו את בארות, ולשטוף את המגלשה במים deionized במשך 10 דקות על מערבל מסתובב. מוציאים את המים, ומאפשרים למגלשה להתייבש באוויר בצלחת פטרי נקייה לפני שמביאים את המגלשה למיקרוסקופ השדה הכהה.
הקימו מיקרוסקופ הפוך המצויד במרכז טבילת שמן בשדה כהה, מטרה של פי 4 ושלב ממונע. חבר את המיקרוסקופ למחשב באמצעות מצלמה דיגיטלית ופתח את תוכנת ההדמיה. לאחר מכן, מקם את השקופית לדוגמה במהופך על שלב המיקרוסקופ, והחל טיפה קטנה של שמן טבילה במקום שבו עדשת המרכז יוצרת קשר עם השקופית.
הצג את התצוגה דרך המיקרוסקופ בתוכנת ההדמיה. התאימו את זמן החשיפה מול באר סטנדרטית בריכוז גבוה כדי להבטיח שהתמונה לא תהיה רוויה. לאחר מכן, פתחו את הכלי לסריקת תמונות גדולות והגדירו את ההגדלה האובייקטיבית ל- 10x.
בחר לסגור את התריס הפעיל במהלך תנועת הבמה ולהמתין 20 אלפיות שניה לפני כל לכידה. הגדר את חפיפת התפירה ל- 20% ובחר תפרים דרך הנתיב האופטימלי. בחר ליצור תמונה גדולה מהסריקה.
הגדר את המצלמה להתמקד באופן ידני בתחילת הסריקה, והפוך את המוקד האוטומטי צעד אחר צעד לזמין בכל 20 שדות. לאחר מכן, בחר להגדיר גבולות שמאליים, ימניים, עליונים ותחתונים עבור שדה הסריקה המשמש כיעד והגדר את אזור הסריקה על-ידי הזזת שלב המיקרוסקופ לכל אחד מהמגבלות הרצויות. לאחר מכן, התאימו את המוקד, את מעבה ואת תאורת האזור כדי לקבל תמונה ברורה ומוארת היטב.
תן שם לקובץ התמונה שיש ליצור והתחל את הסריקה. כאשר היא מסתיימת, פתח את התמונה ושמור אותה בקנה מידה של 1/8. פתח את תוכנת ניתוח התמונות.
לאחר מכן, פתחו את התפריט תוספים, לחצו על DSM Scan, הגדירו את מספר העמודות והשורות, הגדירו את אחוז הגודל ל-25, הגדירו קוטר ספוט, בפיקסלים, ל-190 עד 200, הגדירו טווח קוטר ל-32 והגדירו קוטר קבוע, בפיקסלים, לשמונה. הגדר את מגבלות ה- DSM הנמוכות והגבוהות לאפס ול- 62, את המרחק הסמוך ל- 100 ואת הטיית ההפחתה לאפס. הפעל את אלגוריתם ה- DSM ושמור את הנתונים המתקבלים.
טכניקת ניתוח DSM הראתה רבייה טובה על פני דגימות EXOSOME PANC-1 מדוללות סדרתיות הנעות בין 0.24 ל -1.2 מיקרוגרם למיקרוליטר. מתאם ליניארי חזק נצפה בין תגובת פיזור מן nanorods זהב ריכוז חלבון exosome. הבדל משמעותי בשפע של exosomes בסרום המבטא את הסמן הביולוגי הקשורים לסרטן EphA2 נצפתה בין חולים עם סרטן הלבלב וחולים בריאים.
מהתוספת של סוכן חסימה ואילך, צינורות מהירים ומדויקים חיוניים כדי למנוע אידוי של דגימות, החדרת זיהום צולב, ושריטת פני השטח של השקופית. בעקבות הליך זה, אנו מבצעים ניתוח סטטיסטי כדי לחקור כל מתאם בין הביטוי של סמן ביולוגי אקסוזומלי של עניין לבין שלב אחר של המחלה הנחקרת. לאחר הקמת טכנולוגיה זו, ואנחנו יכולים למצוא סמנים ביולוגיים אקסוזומליים לסרטן הלבלב בשלב מוקדם.
נכון לעכשיו, אנחנו מרחיבים את הגילוי הזה לסוגים אחרים של סרטן ומחלות זיהום. בדרך כלל, הדגימות שטופלו בהבטחה זו הן דגימות חולים או דגימות אקסוסום מטוהרות מקווי תאים סרטניים, המחייבים הכשרת בטיחות מיוחדת.
